第三章 無菌技術(shù)

1、第3章 無菌技術(shù)無菌是細(xì)胞培養(yǎng)成功的最基本要求 無菌技術(shù)是進(jìn)行離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)，設(shè)備、培養(yǎng)基、懸浮系統(tǒng)和操作方法等的復(fù)雜性都易引起微生物污染。 操作人員建立極強(qiáng)的無菌意識和具有良好的無菌操作技能，是細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虺晒Φ谋仨毜囊彩腔镜囊蟆Ｒ?、常用滅菌方法及原?細(xì)胞培養(yǎng)中易引起污染的微生物污染源主要有：細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等. 殺菌的等級滅菌：殺死物體上的一切微生物，徹底殺菌消毒：殺死物體上的有害微生物，使之達(dá)到無害化。防腐：利用化學(xué)或物理方法，防止或抑制微生物的生長繁殖。（一）熱力（高溫）滅菌 利用高溫殺死微生物的方法利用高溫殺死微生物的方法 高溫滅菌的基本原理：當(dāng)高溫作用于微生物時，

2、使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，原生質(zhì)變性，酶結(jié)構(gòu)破壞或被鈍化，新陳代謝活動停止，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)變化，從而使細(xì)胞死亡。 根據(jù)微生物生長發(fā)育與溫度的關(guān)系，可將微生物劃分為低溫性微生物、中溫性微生物和高溫性微生物三大類。不同溫度型的微生物對高溫的抵抗力不同。當(dāng)環(huán)境溫度超過微生物生長的最高溫度范圍時很容易死亡。 一般說來，處于營養(yǎng)生長期細(xì)胞耐熱性差，處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞，如各類（細(xì)菌）芽孢、（真菌）孢子耐熱性較強(qiáng)。 滅菌徹底與否，一般以殺死芽孢或孢子為標(biāo)準(zhǔn)。熱力滅菌的兩個殺菌指數(shù) 熱死溫度：一定時間內(nèi)可以殺死細(xì)菌懸液中的所有細(xì)胞的溫度； 熱死速度：在一定的溫度下，殺死所有細(xì)胞所需的時間。 兩者的關(guān)系：1、濕熱滅菌

3、法(高壓蒸氣滅菌法) 概念：指用飽和水蒸氣、沸水進(jìn)行滅菌的方法。 特點(diǎn)：由于蒸汽潛熱大,穿透力強(qiáng),容易使蛋白質(zhì)變性或凝固, 因此該法滅菌效率高，滅菌時間短，適用性廣，是細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室及藥物制劑生產(chǎn)過程中最常用的滅菌方法。 常用儀器：高壓蒸氣滅菌鍋（高壓蒸氣滅菌法） 使用注意事項(xiàng)（P22）培養(yǎng)基的滅菌高壓濕熱滅菌高壓濕熱滅菌：121, 18-20min液體體積液體體積(mL) 所需的時間所需的時間(min) （121 ）20-501560-15020150-50025500-100030 其它常用濕熱滅菌法 1）常壓蒸氣滅菌法：在常壓條件下，采用100 流通蒸氣加熱殺滅微生物，滅菌時間通常為30

4、-60分鐘。該法適用于消毒不耐高熱制劑的滅菌，但不能保證殺滅所有芽孢，是非可靠的滅菌方法。 2）間歇滅菌法：利用反復(fù)多次的流通蒸汽加熱，殺滅所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽滅菌法，但要重復(fù)3次以上。 3）煮沸滅菌法：適用于應(yīng)急需要的情況下，金屬器械、玻璃及橡膠類物品的滅菌。在水中煮沸至100后，持續(xù)1520分鐘。此方法可殺滅一般細(xì)菌。針對帶芽胞的細(xì)菌需每日至少煮沸12小時，連續(xù)3天才合要求。2、干熱滅菌法 概念：采用灼燒或干熱空氣滅菌的方法。 類型： 1）火焰滅菌（灼燒法）：接種工具、容器的滅菌 在無菌操作時，把鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅火焰上

5、灼燒滅菌菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250/500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。 2）干熱滅菌：使用設(shè)備，電熱干燥箱。 適用：玻璃器皿或金屬器械等的滅菌。 特點(diǎn)：溫度高、時間長，一般160 維持40分鐘2小時 熱力滅菌的優(yōu)勢：熱力滅菌的優(yōu)勢：快速高效；簡單易行快速高效；簡單易行熱力滅菌的劣勢：熱力滅菌的劣勢：對不耐高溫的物對不耐高溫的物質(zhì)不能使用。質(zhì)不能使用。（二）過濾滅菌 過濾滅菌過濾滅菌（ Filter sterilization）：某些激素：某些激素（如天然生長素天然生長素IAA、玉米素、玉米素ZT、赤霉素、赤霉素GA等等）、維生素、抗生素、血清抗生素、血清等不耐熱

6、或射線不耐熱或射線照射的物質(zhì)照射的物質(zhì)。 滅菌原理: 機(jī)械性阻留大于一定孔徑一定孔徑的微生物 Filter sterilization-過濾滅菌過濾滅菌濾膜濾膜0.45m以以下下1.過濾器先滅菌，滅菌溫度過濾器先滅菌，滅菌溫度121，20min。2.細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔直徑一般細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔直徑一般小于小于0.45m和和0.22m不會破壞溶液中的生物活性物質(zhì)，但是無法去除病毒等。（三）紫外線消毒 紫外線消毒的科學(xué)原理：1）主要作用于微生物的DNA，破壞DNA結(jié)構(gòu)，使之失去繁殖和自我復(fù)制的功能從而達(dá)到殺菌消毒的目的。2）通過紫外照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。 殺菌特點(diǎn)：穿透力弱，穿透力弱，只適用于空氣和物

7、只適用于空氣和物體表面體表面等的消毒等的消毒. 應(yīng)用實(shí)例：無菌室、超凈臺使用紫外燈殺菌（四）化學(xué)滅菌 利用化學(xué)藥劑，滲透到細(xì)菌體內(nèi)，使菌體蛋白質(zhì)變性的滅菌方法； 主要用于滅去環(huán)境、器具、材料或藥品上的微生物1、氧化消毒劑 常用氧化藥品：高錳酸鉀、過氧乙酸、雙氧水、次氯酸納、漂白粉（主要成分，次氯酸鈣）等 滅菌原理：通過化學(xué)反應(yīng)中強(qiáng)烈的氧化反應(yīng)作用，破壞微生物的原生質(zhì)或酶蛋白結(jié)構(gòu)。 使用特點(diǎn)：一般需現(xiàn)配現(xiàn)用。2、重金屬鹽類消毒劑 常用0.1-0.5%的硝酸銀或0.1-0.2%的升汞（HgCl2)等溶液滅菌5-10min 殺菌原理：重金屬離子所帶的正電荷容易與帶負(fù)電的菌體蛋白質(zhì)結(jié)合，使其凝固變性。

8、 使用中存在的問題：1）毒性過大，濃度和時間不易把握；2）滅菌后去除殘余困難；3）滅菌后含重金屬離子廢液的處理困難。3、表面活性消毒劑 常用：乙醇、新潔爾滅、來蘇兒、石炭酸等。 乙醇：最常用的表面消毒劑，常用70-75%，具有較強(qiáng)的穿透力和殺菌力，常用于快速揮發(fā)且持續(xù)時間不需太久的消毒，如手、臺面或物體表面的消毒。 應(yīng)用實(shí)例：超凈臺使用前使用消毒劑噴霧（滅菌、降塵）.4、甲醛 37-40%甲醛用于防腐、消毒 應(yīng)用實(shí)例：甲醛熏蒸法（長期不用的無菌甲醛熏蒸法（長期不用的無菌室滅菌室滅菌， 100ml甲醛 + 5g/20m2 ）二、常見污染原因和預(yù)防措施 （一）細(xì)菌性污染 1、污染癥狀：培養(yǎng)材料附近

9、出現(xiàn)黏液狀物體或渾濁的水跡狀（液體培養(yǎng)時表現(xiàn)為渾濁狀），接種后3-5天出現(xiàn) 2、污染原因： 材料帶菌（內(nèi)源性污染） 操作不慎 呼吸污染預(yù)防措施 1）接種前，工作人員必須剪指甲及用肥皂洗手，穿上無菌工作服，戴好囗罩和工作帽； 2）接種前，還要用70-75%酒精棉球擦試雙手； 3）接種時，還應(yīng)注意避免“雙重傳遞”的污染； 4）接種用的鑷子等接種工具要經(jīng)常在酒精燈火焰上灼燒滅菌、冷卻后使用； 5）操作時應(yīng)注意灼燒瓶囗滅菌，不要污染瓶囗。如果是內(nèi)源性污染,可考慮在培養(yǎng)基中添加一定數(shù)量的抗抗生素生素； （二）真菌污染：細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種。 1、污染癥狀：菌斑等（液體中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，但不渾濁），培養(yǎng)物生長變慢。 2、污染原因：多為接種室內(nèi)空氣污染；接種瓶囗