基因工程重點總結(jié)

1、基因工程名詞解釋：基因工程：重組DNA技術(shù)或者基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之滲入到原先沒有這類分子的宿主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定的傳遞和表達。報告基因：其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定，常用來判斷外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細(xì)胞（器官或組織）并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因。雙元載體：由兩個分別含有TDNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒載體系統(tǒng)。受體系統(tǒng)：用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源基因的整合，對轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。正負(fù)選擇法：哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA發(fā)生隨機整合

2、的幾率相當(dāng)高，而同源重組的頻率則相當(dāng)?shù)?。正是由于這種緣故，給哺乳動物細(xì)胞的基因定向插入事件的檢測造成了很大困難。用于富集同源重組事件的特殊試驗體系，涉及正選擇和負(fù)選擇兩個方面。基因靶標(biāo)：通過在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生的外源基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重組，使外源基因定點地整合到核基因組的特定位置上，從而達到改變系把你遺傳特性的目的。密碼子使用的偏愛性：無論是真核基因還是原核基因，一種特定的氨基酸并不是以同等頻率使用所有的同義密碼子，而主要使用其中的某一兩種。這種密碼子使用的非隨機性現(xiàn)象選擇標(biāo)記基因：用于鑒別目標(biāo)DNA的存在，將成功轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的宿主挑選出來的基因。主要是一類編碼可使抗生素或除草劑

3、失活的蛋白酶基因。HAT選擇法：由于選擇TK+細(xì)胞的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷，所以稱之為。生殖細(xì)胞浸泡法：將供試外植體如種子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并穩(wěn)定地整合、表達和遺傳。胚囊、子房注射法：使用微量注射器把外源DNA溶液注射到子房或胚囊中，由于卵細(xì)胞的吸收使外源DNA進入受精的卵細(xì)胞中，從而獲得轉(zhuǎn)基因的種子。啟動子：RNA聚合酶識別并結(jié)合，從而起始轉(zhuǎn)錄的一段特異DNA序列。增強子：增強與之相連鎖的基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控序列。先導(dǎo)序列：從真核基因mRNA5端帽子到起始密碼子之間不翻譯的核苷酸序列。胸苷激酶

4、TK：核苷酸合成代謝途徑中的一種酶，能夠?qū)⑿剀辙D(zhuǎn)換為胸苷一磷酸。In Planta轉(zhuǎn)化：利用花粉粒及花粉管通道、子房、幼穗及種胚導(dǎo)入外源基因?；ǚ酃芡ǖ澜閷?dǎo)基因轉(zhuǎn)化：授粉后，外源DNA能沿花粉管滲入，經(jīng)過誅心通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。愈傷組織再生體系：外植體經(jīng)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，并通過分化培養(yǎng)能獲得再生植株的受體系統(tǒng)。直接分化再生系統(tǒng)：外植體細(xì)胞越過脫分化階段而直接分化出不定芽獲得再生植株。用葉片、幼莖、子葉、胚軸等外植體，直接出芽。胚狀體再生系統(tǒng)：二倍體或單倍體細(xì)胞在未經(jīng)性細(xì)胞融合的情況下，模擬有性合子胚胎發(fā)生的各個階段而發(fā)育形成一個新的個體的形態(tài)發(fā)生

5、過程。生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)：以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞為受體細(xì)胞進行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。種質(zhì)系統(tǒng)?；驑尫ǎ椶Z擊法：將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細(xì)胞或組織。微粒上的外源DNA進入細(xì)胞后，整合到植物染色體上，得到表達，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。種質(zhì)系：合子胚中特定細(xì)胞將來分化發(fā)育成植物體的特定器官和部位。原生質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)化：以原生質(zhì)體為受體的基因轉(zhuǎn)化。PEG法、脂質(zhì)體法、電激法、超聲波法、激光打孔法等。脂質(zhì)體法：用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。脂質(zhì)體：是人工構(gòu)建的由磷脂酰膽堿或磷脂酰絲氨酸等組成的雙層膜囊

6、。電激法介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化：利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上電激穿孔形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的導(dǎo)入。顯微注射介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)化：利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化：將激光引入光學(xué)顯微鏡聚集成微米級的微束照射培養(yǎng)細(xì)胞后，在細(xì)胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加入細(xì)胞懸浮液里的外源DNA流入細(xì)胞，實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。生物反應(yīng)器：用于生物反應(yīng)過程的容器總稱。包括酶反應(yīng)器（游離酶和固定酶）、固定細(xì)胞反應(yīng)器、各種細(xì)胞培養(yǎng)器、發(fā)酵罐和轉(zhuǎn)基因動植物等。Bradford法：考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生藍(lán)色，595nm處有最大吸收值?；蛩睫D(zhuǎn)移HGT：遺傳物質(zhì)從一

7、個有機體向另一個與供體有性不親和的有機體轉(zhuǎn)移酵母雙雜交系統(tǒng)：將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因和GAL4激活結(jié)構(gòu)域基因，構(gòu)建成融合表達載體，從表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。物理圖譜：表示某些基因與遺傳標(biāo)志之間在基因組上的直線相對位置和距離的圖譜。遺傳圖譜：由基因重組測驗結(jié)果推算出來的、在一條染色體上可以發(fā)生的突變座位的直線排列（基因位點的排列)圖。染色體步查：從染色體上某一位置（某一DNA克隆）出發(fā)，在基因組文庫中篩選出與該DNA末端序列有互補序列的DNA克隆，亦即與該DNA一端相鄰接的DNA片段一步一步達到靶DNA序列。雙分子熒光互補

8、：熒光蛋白切割成兩個多肽連接到兩個相互作用的蛋白質(zhì)上重新發(fā)出熒光。分子伴侶：阻止副反應(yīng)保證其他蛋白質(zhì)的正確折疊的蛋白質(zhì)。N端法則：生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的新陳代謝的穩(wěn)定性主要取決于N端氨基酸的性質(zhì)。轉(zhuǎn)化受體：高效穩(wěn)定的再生能力，較高的遺傳穩(wěn)定性，具有穩(wěn)定的外植體來源，對選擇性抗生素敏感，對農(nóng)桿菌的侵染有敏感性?；蚱疲恨D(zhuǎn)基因植物通過花粉漂移或種子擴散將基因轉(zhuǎn)入同一物種或相關(guān)物種。瞬時表達：轉(zhuǎn)入的基因在植物當(dāng)代表達或是分化時表達穩(wěn)定性表達：轉(zhuǎn)入的基因能穩(wěn)定的遺傳給子代并得到表達核基質(zhì)附著區(qū)MAR：存在于真核細(xì)胞染色體中的一段與基質(zhì)特異結(jié)合的DNA序列。簡答：真核生物基因在原核生物系統(tǒng)表達的載體的基本組

9、成：1、 強啟動子2、轉(zhuǎn)錄終止子3、翻譯起始序列4、翻譯增強子5、翻譯終止密碼啟動子的強度、DNA轉(zhuǎn)錄起始序列、密碼子的選擇、mRNA分子的二級結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性和寄主細(xì)胞生理特征等都會不同程度地影響克隆基因的表達效率克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達1、 外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞周質(zhì)，分泌到細(xì)胞外使克隆基因表達的外源蛋白分泌到胞外的培養(yǎng)基中，是獲得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的最佳途徑。2、 外源蛋白在大腸桿菌中的穩(wěn)定性（1） 蛋白質(zhì)的降解作用1） 讓外源蛋白定位在周質(zhì)或胞外表達2） 使用蛋白酶缺陷的大腸桿菌做表達菌株3） 將轉(zhuǎn)化有克隆基因的寄主菌株放置在低溫

10、環(huán)境中生長4） 使目標(biāo)基因以融合蛋白形式表達5） 置換多肽鏈中的某些氨基酸，清除蛋白酶切點6） 對目標(biāo)蛋白質(zhì)作疏水性修飾（2） 結(jié)構(gòu)決定因子與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性N端法則（3） 表達天然的蛋白質(zhì)以形成融合蛋白的形式在大腸桿菌細(xì)胞中表達外源真核基因有許多方面的優(yōu)越性（4） 分子伴侶的穩(wěn)定作用指一類多功能蛋白質(zhì)，能夠通過阻止諸如聚合作用這樣的副反應(yīng)，來促使其他蛋白質(zhì)按正確的方式折疊，而本身卻不是最終形成的功能蛋白質(zhì)的組成成分。通過分子伴侶與克隆的外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞中的共表達是增強目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，實現(xiàn)高水平表達的有效方法。（5） 大腸桿菌突變體菌株與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性使用胞內(nèi)蛋白酶含量很低的大腸桿菌

11、突變株，作為表達外源蛋白質(zhì)的寄主細(xì)胞，其中用得最多的是缺失Ion蛋白酶的大腸桿菌突變株。影響克隆基因在大腸桿菌中表達效率的因素1、 啟動子對克隆基因表達效率的影響1） 啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響啟動子序列與上述保守序列之間相似程度越高，其表達能力也就越強。兩個保守序列之間的距離，接近于17個堿基。2） 啟動子與克隆基因的間隔距離對表達效率的影響5端與SD序列之間的距離應(yīng)15bp3）提高克隆基因表達效率的實驗方案2、 質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性與基因表達效率1) 質(zhì)粒的拷貝數(shù)a、 啟動子的強度b、 基因的拷貝數(shù)，即基因劑量，最簡單的方法是將基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體RNAI和Rom蛋白質(zhì)2) 質(zhì)粒載

12、體的不穩(wěn)定性a、 將Par克隆到表達載體b、 對無質(zhì)粒細(xì)胞進行反選擇3、 mRNA轉(zhuǎn)錄本身的分子特性對基因表達效率的影響1） 翻譯起始序列SD序列：許多細(xì)菌基因起始密碼子5上游都存在510個核苷酸的核糖體結(jié)合位點（RBS），包含5UAAGGAGG 3的全部或其中的一部分。2） mRNA的穩(wěn)定性mRNA分子的相對壽命，或?qū)?nèi)源RNase降解作用的抵抗能力。5UTR系列和3URT系列以及順反子間區(qū)4、 遺傳密碼子的使用1） 密碼子使用的偏愛性a、 細(xì)胞中同工tRNA的豐度差異b、 嘧啶堿基結(jié)尾的密碼子（C或U)之間的非隨機選擇5、 寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、細(xì)胞培養(yǎng)方式、以及培養(yǎng)溫度和培

13、養(yǎng)基中所溶解的氧等。HAT選擇法及其原理由于選擇TK+細(xì)胞的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷基本原理：如果用葉酸的類似物氨基蝶呤處理細(xì)胞，二氫葉酸還原酶便被抑制，培養(yǎng)基中的還原輔助因子四氫葉酸因得不到補充而逐漸耗盡，于是從dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻斷，但次黃嘌呤是daATP和dGTP補救合成途徑的一種底物。培養(yǎng)基中補加有此種物質(zhì)時，細(xì)胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，由于在HAT培養(yǎng)基中補加有外源的胸苷，所以TK+細(xì)胞通過胸苷激酶的作用可把它合成為dTTP，繼續(xù)存活下去，而TK細(xì)胞則不會發(fā)生這種合成，因而死亡。把正常的tk基因?qū)隩K細(xì)胞，它們也就照樣能存活下

14、去。所以使用HAT培養(yǎng)基，能夠選擇出由tk基因轉(zhuǎn)化而來的TK+細(xì)胞。正負(fù)選擇法及其原理轉(zhuǎn)染DNA與內(nèi)源基因組DNA之間的同源重組事件，是由轉(zhuǎn)染DNA的自由末端激發(fā)的。哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA發(fā)生隨機整合的幾率相當(dāng)高，而同源重組的頻率則相當(dāng)?shù)?。正是由于這種緣故，基因定向插入事件的檢測造成了很大的困難。用于富集同源重組事件的特殊的試驗體系，涉及正選擇和負(fù)選擇。正選擇：neo基因叫做正選擇標(biāo)記基因，可抑制抗菌素G418的活性。因此，獲得的neo基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞呈G418抗性，能夠在含有G418抗菌素的選擇培養(yǎng)基中生長存活。負(fù)選擇：HSVtk基因叫做負(fù)選擇標(biāo)記基因，它編碼的單純皰疹病毒胸苷激酶，可以把核苷

15、類似物，例如鳥嘌呤(GCV)，轉(zhuǎn)變成毒性的核苷酸，造成細(xì)胞中毒死亡。因此，選擇培養(yǎng)基中的GCV能夠特異性的殺死表達HSVtk基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。圖位克?。?、 建立目的基因的遺傳分離群體2、 找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記3、 用遺傳圖或物理作圖將目的基因定位在染色體特定位置4、 構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫5、 以與目的基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫6、 用陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊群7、 通過染色體步移、登陸或跳查，獲得含有目標(biāo)基因的大片段克隆8、 通過亞克隆獲得目標(biāo)的小片段克隆9、 通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補驗證，最終確定目標(biāo)基因的堿基序列常用的選擇標(biāo)記基因：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因

16、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Bar基因EPSP合成酶基因報告基因：GUS基因，綠色熒光蛋白，熒光素酶基因，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化：1、 對受體的識別2、 浮著到植物受體細(xì)胞3、 誘導(dǎo)啟動毒性基因4、 類似接合孔復(fù)合體的合成和裝配5、 TDNA的加工和轉(zhuǎn)運6、 TDNA的整合無標(biāo)記的轉(zhuǎn)化策略：1、 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法2、 位點特異性重組酶介導(dǎo)的標(biāo)記基因的切除3、 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的標(biāo)記基因的切除4、 MAT載體系統(tǒng)5、 通過染色體內(nèi)部同源重組來消除標(biāo)記基因6、 PCR法轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞（外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法）：1、 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法2、 DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)3、 聚陽離子

17、DMSO轉(zhuǎn)染技術(shù)4、 基因顯微注射技術(shù)5、 電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)6、 脂質(zhì)體載體法動物基因工程篩選標(biāo)記：1、 胸腺激酶基因2、 二氫葉酸還原酶基因3、 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因4、 細(xì)菌的黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因5、 細(xì)菌的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因提高外源基因表達的策略：1、 構(gòu)建高效表達的轉(zhuǎn)化載體2、 克服轉(zhuǎn)基因的失活3、 利用位點特異性重組系統(tǒng)4、 利用去甲基化試劑5氮胞苷植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)：1、 愈傷組織再生系統(tǒng)2、 直接分化再生系統(tǒng)3、 原生質(zhì)體再生系統(tǒng)4、 胚狀體再生系統(tǒng)5、 生殖細(xì)胞再生系統(tǒng)克服質(zhì)粒丟失的方法：質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性指質(zhì)粒缺陷性分配引起的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。分配功能區(qū)Par能

18、夠保證質(zhì)粒分子在每次細(xì)胞周期中都能準(zhǔn)確分離，并均勻的分配到子細(xì)胞中去?？朔椒ǎ?、 將Par克隆島表達載體2、 對無質(zhì)粒細(xì)胞進行反選擇基因工程的選擇標(biāo)記基因的選擇原則：1、 標(biāo)記基因產(chǎn)物不會干擾受體細(xì)胞正常的新陳代謝活動，同時，轉(zhuǎn)化細(xì)胞應(yīng)具有抵抗選擇劑的能力。2、 使用的選擇劑不明顯影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長發(fā)育。3、 選擇過程花時短，選擇劑的用量低。4、 應(yīng)盡量選用被證明環(huán)境釋放安全的選擇基因。Bt蛋白的殺蟲機制Bt基因編碼的內(nèi)毒素是以無毒的原毒素形式存在，當(dāng)敏感的昆蟲在其取食轉(zhuǎn)基因植物時，Bt原毒素隨之進入昆蟲的消化道，在昆蟲的中腸道被腸胃堿性蛋白酶水解成毒素分子，這種活化的毒素分子與中腸上皮細(xì)

19、胞表面的糖蛋白結(jié)合，其N端區(qū)域插入細(xì)胞膜，形成小孔，破壞K通道，引起細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓失衡，致使細(xì)胞因膨脹而破裂，結(jié)果昆蟲便停止取食而最終死亡。原毒素的溶解，原毒素的蛋白酶水解，毒素分子穿過圍食膜，毒素分子與受體結(jié)合，毒素分子插入膜中，小孔的形成，中腸細(xì)胞失去離子平衡裂解。要證明外源基因成功地在受體生物中整合和表達，應(yīng)進行哪些檢測：1、 外源基因整合分子生物學(xué)鑒定PCR擴增，Southern斑點雜交，Southern印跡雜交，Southern原位雜交，PCR-Southern雜交2、 外源基因表達的檢測轉(zhuǎn)錄水平上：Northern雜交（斑點，印跡雜交）翻譯水平上：生化反應(yīng)檢測，免疫學(xué)檢測，生物學(xué)

20、活性的檢測利用基因工程控制果實成熟的方法：MetSAMACC（ACC合成酶）乙烯（乙烯形成酶）1、 ACC合成酶反義基因及其應(yīng)用2、 乙烯形成酶反義基因及其應(yīng)用3、 ACC脫氨酶基因及其應(yīng)用4、 PG反義基因的應(yīng)用耐除草劑基因工程主要由兩種策略：1、 修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對除草劑不敏感2、 引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前將其降解或解毒草甘膦草甘膦特異性地抑制植物和細(xì)菌中的莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶（EPSPS）的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途徑的一個酶。在植物中，大部分EPSPS的活性中心位于葉綠體中。莽草酸途徑被抑制，造成植物芳香族氨基酸的缺乏。EPSPS合成酶的過量表達對除草劑

21、不敏感的EPSPS合成酶除草劑的解讀基因磺酰脲類除草劑磺酰脲類除草劑抑制支鏈氨基酸合成過程中一個關(guān)鍵酶乙酰乳酸合成酶（ALS）而抑制蛋白質(zhì)的合成。在植物和微生物中，ALS催化支鏈氨基酸生物合成中共同的第一步反應(yīng)。分離對磺酰脲類除草劑不敏感的ALS基因，并轉(zhuǎn)化植物。草丁膦草丁膦強烈地抑制谷氨酰合成酶（GS）的活性而造成氨在植物的積累毒害。乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶催化乙酰CoA與草丁膦的游離氨基結(jié)合，使草丁膦變成乙酰草丁膦，從而失去除草劑的活性。阿特拉津三嗪除草劑的主要代表，其主要作用是抑制植物葉綠體中的光合作用。與質(zhì)體醌競爭32kD蛋白的同一結(jié)合位點，阿特拉津與32kD蛋白結(jié)合后，就被抑制了PS電子傳遞

22、中質(zhì)體醌。利用點突變耐阿特拉津的psbA基因。基因工程建立的基礎(chǔ)：1、 理論基礎(chǔ)a、DNA是遺傳信息的攜帶者 b、DNA能自我復(fù)制和傳遞 c、中心法則的提出和遺傳密碼子的通用性2、 技術(shù)基礎(chǔ) a、工具酶：限制性內(nèi)切酶、連接酶 b、質(zhì)粒載體 c、受體的轉(zhuǎn)化方法植物來源的抗蟲基因轉(zhuǎn)入原始品種或其近緣種往往達不到理想的抗蟲效果，簡述其原因。昆蟲和植物之間存在食與被食的關(guān)系，昆蟲和植物進行進化，植物來源的抗蟲基因?qū)θ∈忱ハx而言類似于抗原，能誘導(dǎo)產(chǎn)生對抗蟲基因產(chǎn)物不敏感的靶酶，或超量表達靶酶，或者表達解毒基因，降解抗蟲基因的產(chǎn)物。植物病毒載體的應(yīng)用潛力1、 個別病毒可以較高頻率通過種子傳遞到下一代，可以

23、避開質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時的組織培養(yǎng)植株再生的困難。2、 多年生以及那些用營養(yǎng)器官進行繁殖的一年生植物（如土豆），用病毒接種是可行的3、 克隆基因的功能驗證4、 密集種植的溫室栽培植物如番茄等，用人工接種，在經(jīng)濟上是可以承受的。5、 用植物細(xì)胞表達外源基因產(chǎn)物從安全性考慮，理想的轉(zhuǎn)基因方法應(yīng)該滿足哪些條件。1、 不發(fā)生基因漂移2、 不影響靶生物，非靶生物和生物多樣性3、 不影響農(nóng)業(yè)生態(tài)和自然生態(tài)環(huán)境4、 無標(biāo)記基因，不影響食品安全動物基因工程的制約因素有哪些1、 動物細(xì)胞全能性的局限性2、 動物細(xì)胞組織培養(yǎng)的技術(shù)限制3、 轉(zhuǎn)基因動物胚胎細(xì)胞需放入動物體內(nèi)才能發(fā)育成新的個體，花時長4、 動物繁殖速度一般

24、較慢5、 轉(zhuǎn)化方法的限制6、 載體的限制植物轉(zhuǎn)基因的操作程序外源基因的分離克隆載體的選擇和構(gòu)建基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立基因轉(zhuǎn)化篩選轉(zhuǎn)化體檢測外源基因的表達表型性狀的鑒定遺傳學(xué)分析后代目標(biāo)性狀的傳遞和穩(wěn)定性農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化：外源基因的分離克隆到載體上建立基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)農(nóng)桿菌的敏感性試驗及菌種的選擇外植體的預(yù)培養(yǎng)外植體的接種和培養(yǎng)選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞外源基因整合和表達檢測外源基因提高表達策略抗植物病毒的基因工程策略：1、 CP基因及應(yīng)用2、 復(fù)制酶基因及應(yīng)用3、 病毒衛(wèi)星RNA的利用衛(wèi)星RNA的特點;A、 在其相伴病毒中發(fā)現(xiàn)B、 按照相伴病毒的復(fù)制和傳播機制，從一個植株傳到另一個植株C、 它們不與其相

25、伴病毒的核苷酸序列同源，對病毒的復(fù)制也不起作用D、 衛(wèi)星RNA能改變其相伴病毒的致病力4、 核糖體失活蛋白RIP的利用一類能抑制蛋白質(zhì)生物合成的蛋白，廣泛存在于高等植物中。型是單鏈堿性蛋白質(zhì)，分子量約為30kD，可以帶有糖基也可以不帶糖基但其生物活性都一樣，都具有抑制無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的作用，對完整細(xì)胞或動物呈無毒或低毒。型由A、B兩條肽鏈通過二硫鍵組成的二聚體，其分子量約60kD，其A鏈與I型同源呈酸性或堿性，是毒性分子，B鏈?zhǔn)悄?，能結(jié)合到細(xì)胞膜表面并協(xié)助A鏈進入細(xì)胞。Ti質(zhì)粒改造策略：一元載體系統(tǒng)：去除野生型Ti質(zhì)粒TDNA中的Onc基因，引入一段過程操作的小質(zhì)粒序列，保留TDNA的邊界

26、序列。將外源基因裝載到小質(zhì)粒上，然后把載有外源基因的小質(zhì)粒通過一定的方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌，利用Ti質(zhì)粒與小質(zhì)粒的同源重組，將外源基因引入TDNA，制成用于轉(zhuǎn)化的一元載體轉(zhuǎn)化菌株。雙元載體系統(tǒng)：大Ti質(zhì)粒的改造，主要是去除TDNA上的Onc基因，甚至完全消除TDNA，保留Ti質(zhì)粒上的其他部分，并保留在受體菌體中。小質(zhì)粒只帶有TDNA、復(fù)制起點和選擇標(biāo)記基因，有些仍保留VirG序列，并在TDNA上引入多克隆位點?；虻亩c插入技術(shù)，通過在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生的外源基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重組，使外源基因定點地整合到核基因組的特定位置上，從而達到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。在外源定點插入基因與內(nèi)源核基

27、因組目標(biāo)基因之間，必須存在一段適當(dāng)長度的同源的DNA序列。插入型和置換型1、 應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，能夠?qū)Ⅲw外修飾改造的突變基因或某種新的外源基因，取代受體細(xì)胞核基因組上的目標(biāo)基因，使基因組獲得新的遺傳信息，以便使科學(xué)工作者能夠相當(dāng)有效地檢測基因的功能。2、 應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，也可以在核基因組的目標(biāo)基因序列附近，插入一個具相同調(diào)控序列的同源基因拷貝。如此，既可形成重復(fù)基因，提高表達效率和相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，又可能不會破壞目標(biāo)基因及其鄰近基因的功能。3、 利用基因定向插入技術(shù)，還可以在核基因組內(nèi)部增加一段DNA序列，或造成序列缺失，甚至是單堿基定點突變等，從而達到抑制或糾正目標(biāo)基因的功能，為遺

28、傳疾病的基因治療提供技術(shù)途徑。動物病毒的特點：1、 動物病毒含有能夠被真核細(xì)胞識別的有效地啟動子。2、 有許多動物病毒，在其感染周期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝數(shù)達到相當(dāng)高的水平。3、 病毒具有控制自我復(fù)制的順式元件和反式作用因子。4、 有些動物病毒，在它們的復(fù)制過程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主核基因組上。5、 病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識別細(xì)胞接收器，因此外殼蛋白可作為感染劑能夠?qū)⑼庠椿蚋咝У貙?dǎo)入寄主細(xì)胞。用病毒外殼蛋白質(zhì)包裝重組質(zhì)粒DNA形成的假病毒顆粒，即構(gòu)成了一種高效地轉(zhuǎn)化體系。A、 晚期區(qū)段取代載體缺失了整個晚期區(qū)段功能的SV40病毒，同可互補這段功能的一種溫度敏感ts的輔助病毒混合感

29、染時，仍然能夠增殖。因此，可以通過取代晚期區(qū)段的途徑構(gòu)建SV40病毒載體。最常用的輔助病毒是tsA突變體，它合成一種溫度敏感的T抗原。B、早期區(qū)段取代載體通過由一種輔助病毒提供抗原，被這種取代載體感染的受體細(xì)胞，便會出現(xiàn)正常的裂解周期。重組的病毒質(zhì)粒載體1、 含有完整早期區(qū)段和復(fù)制起點的病毒質(zhì)粒載體由病毒的早期區(qū)段和復(fù)制起點同大腸桿菌的質(zhì)粒分子重建而成。2、 微型病毒復(fù)制子質(zhì)粒載體含有SV40復(fù)制起點的DNA片段Southern 印跡雜交檢測轉(zhuǎn)基因植物外源基因整合位點和拷貝數(shù)的原理重疊探針雜技，并以轉(zhuǎn)化的外源基因不同拷貝數(shù)為對照。轉(zhuǎn)化植株基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化時，外源DNA序列會產(chǎn)生四種片段。1、 內(nèi)部片段：由外源DNA內(nèi)的切點產(chǎn)生2、 邊界片段：是外源DNA插入的末端片段3、 復(fù)合片段：這種片段與TDNA的左邊界及右邊界表現(xiàn)同源4、 重新編排的序列：這種限制性片段可能來自TDNA的重新編排或異常整合。也可能是正常整合后發(fā)生如何評價一個轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)劣？1、 從外源基因分離和克隆的角度，基因序列是新的，要求有氨基酸的改變2、 從載體的角度，操作簡單、安全，對受體不造成傷害，也不影響受體細(xì)胞正常的新陳代謝和發(fā)育，轉(zhuǎn)化率高，應(yīng)能讓外源基