病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)ppt課件

1、 病理學(xué)常用研討方法病理學(xué)常用研討方法整體水平整體水平：尸體解剖尸體解剖 autopsyautopsy動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) animal experimentanimal experiment細(xì)胞水平：細(xì)胞水平：光鏡組織切片光鏡組織切片 light-microscopelight-microscope細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) cell culturecell culture流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù) flow cytometryflow cytometry組織芯片組織芯片 tissue micro-arraytissue micro-array組織微切割技術(shù)組織微切割技術(shù) micro-dissectionm

2、icro-dissection電鏡電鏡 透射、掃描、免疫電鏡透射、掃描、免疫電鏡蛋白水平：蛋白水平：1.1.免疫組化免疫組化 immunohistochemstryimmunohistochemstry2.Western Blotting2.Western Blotting3.3.組織芯片組織芯片 tissue micro-arraytissue micro-array基因水平：基因水平：1.1.原位分子雜交原位分子雜交( (組織、染色體組織、染色體Fish)Fish) in situ hybridization in situ hybridization2.2.基因芯片基因芯片 gene c

3、hipgene chip3.3.組織芯片組織芯片 tissue micro-arraytissue micro-array4.PCR4.PCR及測(cè)序等及測(cè)序等 PCR and sequencePCR and sequence一、免疫組化規(guī)范化問(wèn)題討論本世紀(jì)本世紀(jì)7070年代問(wèn)世年代問(wèn)世抗體種類(lèi)急速添加，交叉反響存在抗體種類(lèi)急速添加，交叉反響存在免疫組化技術(shù)方法不斷問(wèn)世免疫組化技術(shù)方法不斷問(wèn)世運(yùn)用的試劑或?qū)嶒?yàn)室條件不同運(yùn)用的試劑或?qū)嶒?yàn)室條件不同操作人員的熟練程度操作人員的熟練程度病理醫(yī)生的結(jié)果斷定程度及關(guān)聯(lián)知識(shí)病理醫(yī)生的結(jié)果斷定程度及關(guān)聯(lián)知識(shí)處理規(guī)范化的問(wèn)題勢(shì)在必行處理規(guī)范化的問(wèn)題勢(shì)在必行(一)

4、方法的選擇目前常用的免疫組化方法有：目前常用的免疫組化方法有：PAPPAP、ABCABC、APAAPAPAAP法、法、S-PS-P方法等方法等各種方法只需運(yùn)用得好，都會(huì)得到稱心各種方法只需運(yùn)用得好，都會(huì)得到稱心的結(jié)果的結(jié)果建議：在我們省內(nèi)都采用建議：在我們省內(nèi)都采用S-PS-P法法S-P法的優(yōu)點(diǎn) 方法一致 有配套的即用型抗體、試劑盒和顯色試劑盒 普通2-3小時(shí)(30-60)，而ABC法需1天，分 子量小(60KD)，穿透力強(qiáng) 靈敏性高，特異性強(qiáng)，4個(gè)亞基都能于二抗上的生 物素結(jié)合，而且結(jié)合鍵強(qiáng) 背景低，非特異性反響少，等電點(diǎn)為6.5，接近于 中性，不與內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)結(jié)合,而ABC法為10S

5、-P法與ABC法的區(qū)別S-PS-P法：法：Streptaridin peroxidase conjugataed methodStreptaridin peroxidase conjugataed method 鏈霉菌素抗生物素蛋白鏈霉菌素抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶銜接法過(guò)氧化物酶銜接法ABCABC法：法： Avidin-Biotin peroxidase complex method Avidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素親生物素卵白素親生物素過(guò)氧化酶復(fù)合物法過(guò)氧化酶復(fù)合物法S-PS-P法中的鏈霉菌素抗生物素蛋白取代了法中的鏈霉菌素抗生物素蛋白取代

6、了ABCABC方法中的卵白方法中的卵白 素和生物素素和生物素即：卵白素中的即：卵白素中的4 4個(gè)亞基一方面與第二抗體上的生物素結(jié)個(gè)亞基一方面與第二抗體上的生物素結(jié) 合，另一方面還與復(fù)合物中的生物素結(jié)合合，另一方面還與復(fù)合物中的生物素結(jié)合一一抗抗二二抗抗卵卵白白素素生生物物素素過(guò)過(guò)氧氧化化物物酶酶A-B-C一一抗抗二二抗抗鏈菌素抗生物素鏈菌素抗生物素蛋白蛋白過(guò)氧化過(guò)氧化物酶物酶ABCABC法：法：S-PS-P法：法：(二) 固定、包埋固定液：普通固定液：普通10%10%中性緩沖福爾馬林，中性緩沖福爾馬林，PH7.3-7.4(PBSPH7.3-7.4(PBS配制配制) )固定時(shí)間：應(yīng)少于固定時(shí)間：

7、應(yīng)少于2424小時(shí)，固定時(shí)間越長(zhǎng)，小時(shí)，固定時(shí)間越長(zhǎng)，抗原喪失越多抗原喪失越多固定液量或組織塊大小：組織為固定液量或組織塊大?。航M織為1/31/3，固定，固定液液2/32/3大體標(biāo)本：切下一塊固定大體標(biāo)本：切下一塊固定包埋：起初免疫組化對(duì)蠟溫的要求包埋：起初免疫組化對(duì)蠟溫的要求很?chē)?yán)，溫度一高會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。如今很?chē)?yán)，溫度一高會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。如今由于抗體質(zhì)量的提高，以及抗原恢復(fù)方由于抗體質(zhì)量的提高，以及抗原恢復(fù)方法的問(wèn)世，多數(shù)人又忽視了蠟溫的問(wèn)題。法的問(wèn)世，多數(shù)人又忽視了蠟溫的問(wèn)題。個(gè)人以為：雖然有抗原修復(fù)方法，但不個(gè)人以為：雖然有抗原修復(fù)方法，但不如開(kāi)場(chǎng)就不使抗原破壞，另外，蠟溫過(guò)如開(kāi)場(chǎng)就不使

8、抗原破壞，另外，蠟溫過(guò)高，組織變脆，不易切成大片，容易脫高，組織變脆，不易切成大片，容易脫片。因此，要控制蠟溫在片。因此，要控制蠟溫在6565以下以下(三) 抗原修復(fù)(抗原暴露、抗原復(fù)原)組織中存在某種抗原、但用特異性抗體，卻為陰性組織中存在某種抗原、但用特異性抗體，卻為陰性其緣由是：其緣由是：固定、包埋后部分抗原決議簇與核酸或其它蛋白抗固定、包埋后部分抗原決議簇與核酸或其它蛋白抗原發(fā)生了交聯(lián)，構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)原發(fā)生了交聯(lián)，構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)固定液中的醛根本身也會(huì)發(fā)生交聯(lián)，而封鎖抗原固定液中的醛根本身也會(huì)發(fā)生交聯(lián)，而封鎖抗原抗原修復(fù)的目的：就是要翻開(kāi)交聯(lián)，暴露抗原決議簇，有利于抗原抗體反響，抗原修復(fù)的方法從大的

9、方面講有兩種：只限于需求抗原修復(fù)的只限于需求抗原修復(fù)的抗體抗體熱熱微波微波高壓鍋高壓鍋水浴鍋水浴鍋酶消化酶消化胰蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶熱修復(fù)： 0.01M檸檬酸緩沖液，PH=6.0，95，10分鐘留意：脫片多多聚L賴氨酸 干片 選醫(yī)用微波爐酶消化：1.細(xì)胞內(nèi)抗原0.1%胰蛋白酶 2037 2.間質(zhì)抗原4%胃蛋白酶37，4-8小時(shí)( (八八) )免疫組織化學(xué)的開(kāi)展免疫組織化學(xué)的開(kāi)展1. 1. 免疫免疫PCRPCR：主要用于臨床生物分子檢測(cè)方面：主要用于臨床生物分子檢測(cè)方面 血清血清(Ag)(Ag)電泳電泳+Ab+Ab+無(wú)關(guān)引物擴(kuò)增無(wú)關(guān)引物擴(kuò)增顯色顯色 意義：意義：1. 1. 原來(lái)較弱、程

10、度較低的酶等，用免疫原來(lái)較弱、程度較低的酶等，用免疫PCRPCR就可以檢測(cè)出來(lái)就可以檢測(cè)出來(lái) 2. 2. 需求較長(zhǎng)或一定時(shí)間才干查出來(lái)需求較長(zhǎng)或一定時(shí)間才干查出來(lái)用 免 疫用 免 疫 P C RP C R 法 ， 就 可 提 早 查 出 來(lái)法 ， 就 可 提 早 查 出 來(lái)如：病毒性心肌炎、血腫如：病毒性心肌炎、血腫CPKCPK檢測(cè)檢測(cè) 心梗早期心肌酶譜的檢測(cè)等心梗早期心肌酶譜的檢測(cè)等心梗預(yù)告：心絞痛心梗預(yù)告：心絞痛普通以為沒(méi)有酶普通以為沒(méi)有酶 譜改動(dòng)，想象用免譜改動(dòng)，想象用免疫疫PCRPCR就能夠發(fā)現(xiàn)改動(dòng)就能夠發(fā)現(xiàn)改動(dòng)2. 2. 原位免疫原位免疫PCRPCR在組織切片上有定位在組織切片上有定

11、位 Ag+Ab1+Ab2 Ag+Ab1+Ab2卵白素卵白素洗凈洗凈生生物素標(biāo)志的物素標(biāo)志的DNADNA片斷片斷洗凈洗凈原位原位PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增洗凈洗凈ACBACB或或S-PS-P顯色顯色 特點(diǎn)：提高陽(yáng)性率特點(diǎn)：提高陽(yáng)性率 定位好定位好2. 2. 擴(kuò)增：擴(kuò)增：Total: 25lTotal: 25l PCR buffer 2.5l PCR buffer 2.5l mixed dNTP 2.0l mixed dNTP 2.0l dH2O 16.375l dH2O 16.375l primer 1 1.0l primer 1 1.0l primer 2 1.0l primer 2 1.0l Ta

12、q 0.125l Taq 0.125l DNA template 2.0l DNA template 2.0l94 2594 25 55 25 55 25 72 40 72 40 30 30 cyclescycles3. Agarose 2-5%3. Agarose 2-5%，用，用1 1TBETBE電泳電泳 擴(kuò)增后液擴(kuò)增后液 5l + 1l loading buffer 5l + 1l loading buffer 溴化乙淀染色溴化乙淀染色 20 20，UVUV照射下確認(rèn)泳帶照射下確認(rèn)泳帶照相照相4. DNA4. DNA搜集搜集 RECOCHIP RECOCHIP法法三、三、Western

13、BlottingWestern Blotting1. 1. 提取蛋白提取蛋白 500l500l的的hypotonic buffer + hypotonic buffer + 組織組織2mm32mm3勻漿器勻漿器粉碎粉碎 冰上放置冰上放置3030 1 5 0 0 01 5 0 0 0 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) / / 分 ，分 ， 4 4 ， 3 0 3 0 。上清：細(xì)胞質(zhì)蛋白，上清：細(xì)胞質(zhì)蛋白，+250l 3+250l 3loading bufferloading buffer沉 淀 物沉 淀 物 + 7 5 0 l + 7 5 0 l l o a d i n g b u f f e r l o a d i n

14、g b u f f e r再次粉碎、離心，上清為細(xì)胞膜蛋白再次粉碎、離心，上清為細(xì)胞膜蛋白 2-2-氫硫基乙醇?xì)淞蚧掖?7.5l(1/100) 7.5l(1/100)混合混合 9595沸騰沸騰5 5分鐘分鐘 冰上放置冰上放置2. 2. 蛋白定量蛋白定量 規(guī)范蛋白濃度制備：規(guī)范蛋白濃度制備：BSABSA，0 0，0.50.5，1 1，2mg/ml2mg/ml 比色：測(cè)定系數(shù)比色：測(cè)定系數(shù) 換算成含量換算成含量 計(jì)算出每個(gè)樣品加樣量計(jì)算出每個(gè)樣品加樣量3. 3. 電泳電泳 丙烯酰胺丙烯酰胺 上部膠、下部膠上部膠、下部膠 marker marker樣品樣品4. 4. 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜5. 5. 洗膜洗膜

15、一抗、二抗一抗、二抗 顯色或自顯影顯色或自顯影四、組織芯片四、組織芯片(Tissue Micro-Array, TMA)(Tissue Micro-Array, TMA) 組織芯片技術(shù)是一種特殊生物芯片技術(shù)，它是將幾組織芯片技術(shù)是一種特殊生物芯片技術(shù)，它是將幾十個(gè)或幾百個(gè)不同個(gè)體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順十個(gè)或幾百個(gè)不同個(gè)體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序陳列在一張玻片進(jìn)展分析研討，是一種高通量、多樣序陳列在一張玻片進(jìn)展分析研討，是一種高通量、多樣本的分析工具。它使科研人員第一次有能夠同時(shí)對(duì)幾百本的分析工具。它使科研人員第一次有能夠同時(shí)對(duì)幾百甚至上千種正?；蚣膊∫约凹膊￠_(kāi)展不同階段的自然病甚至

16、上千種正?；蚣膊∫约凹膊￠_(kāi)展不同階段的自然病理生理形狀下的組織樣本，進(jìn)展某一個(gè)或多個(gè)特定的基理生理形狀下的組織樣本，進(jìn)展某一個(gè)或多個(gè)特定的基因，或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研討。因，或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研討。運(yùn)用運(yùn)用免疫組化免疫組化DNADNA或或RNARNA原位雜交原位雜交FISHFISH原位原位PCRPCR低密度芯片低密度芯片(50-70(50-70個(gè)標(biāo)本個(gè)標(biāo)本) )、高密度芯片、高密度芯片(500(500個(gè)標(biāo)本個(gè)標(biāo)本) )制造過(guò)程制造過(guò)程1. 1. 組織處置：固定、石蠟包埋、組織處置：固定、石蠟包埋、HEHE染色、組織定位染色、組織定位2. 2. 組織打孔組織打孔/ /陣列儀鉆取組織，直徑陣列儀鉆取組織，直徑0.6mm0.6mm3. 3. 制造陣列蠟塊，將鉆取的組織按設(shè)定的位置放入制造陣列蠟塊，將鉆取的組織按設(shè)定的位置放入空白蠟塊內(nèi)空白蠟塊內(nèi)4. 4. 切片厚度為切片厚度為5m5m，以，以404