Western blot 技術(shù)-詳細版

1、Western blot 實驗技術(shù) 定義：n印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。n1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。n而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法Western Blot基本原理基本原理 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種

2、固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。快速、特異，信號弱、昂貴快速、特異，信號弱、昂貴信號強、二抗選擇多，非特異性結(jié)信號強、二抗選擇多，非特異性結(jié)合合nSDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳l轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色n蛋白樣品的制備裂解液SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理原理： M丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 MSDSM配膠的Tris緩沖液MTEMEDM過硫酸銨(時間)MTris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份凝膠成份大于大于20KD0.45 um20KD0.2 um7KD0.1 um轉(zhuǎn)膜半干法半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間。（小分子量蛋白）濕法濕法將凝膠和固相基

3、質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。（大分子量蛋白） 濕轉(zhuǎn)半干轉(zhuǎn)一抗、二抗孵育n把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37一小時，4 過夜。n倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。n加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動， 37一小時，4 過夜。n倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)DAB ？ 背景太高1.1.膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕2.2.膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染3.3.封閉不充分封閉不充分4.4.

4、抗體與封閉劑出現(xiàn)交抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)叉反應(yīng)5.5.抗體濃度過高抗體濃度過高 原原因因?qū)Σ卟?.1.轉(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜完甲醇將膜完全浸濕全浸濕2.2.拿取膜與吸水紙時要戴手拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液3.3.檢測一抗、二抗與封閉劑檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)是否有交叉反應(yīng)4.4.雜交前檢測一抗、二抗的雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度工作濃度沒有陽性條帶或比較弱1.1.抗體染色不充分抗體染色不充分2.2.靶蛋白含量太低靶蛋白含量太低3.3.HRPHRP抑制劑抑制劑4.4.轉(zhuǎn)膜時間不夠轉(zhuǎn)膜時間不夠5.5.曝光時間過短曝光時間過短 原原因因?qū)Σ卟?.1.增加抗體滴度，延長孵育增加抗體滴度，延長孵育時間時間2.2.增加樣本上樣量增加樣本上樣量3.3.所用溶液和容器中避免含所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉有疊氮化鈉4.4.大分量蛋白相應(yīng)增加轉(zhuǎn)膜大分量蛋白相應(yīng)增加轉(zhuǎn)膜時間及曝光時間時間及曝光時間彌散性條帶或非特異性條帶1.1.抗體濃度太高抗體濃度太高2.