凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理及其消化

1、精品文檔凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理及其消化、蒸餾以凱氏定氮法測定氮含量換算蛋白質(zhì)的方法， 是國際上 通用的標準方法，操作簡單，測定結果重復性和重現(xiàn)性都很 好，廣泛用于各種食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質(zhì)含量測 定。此法又分為常量、半微量、微量法三種。國家標準規(guī)定 為半微量凱氏定氮法。其測定原理相同，主要區(qū)別在于常量 法的樣品及試劑用量較微量法多。 而微量法則具有實驗規(guī)模 小，實驗費用低的優(yōu)點。但微量法的準確度和精密度比常量 法要差一些。凱氏定氮法整個測定過程分為消解、蒸餾、滴 定三步。凱式定氮法包括消化爐和蒸餾裝置，它們的結合能 夠讓實驗盡可能的簡單。要使測定結果有更好的正確度、準確度和精準度，

2、認真 細致掌握測定的每個步驟、各個細節(jié)及相應的注意事項，就 顯得尤為重要。實驗過程操作1、主要試劑的配制40%氫氧化鈉： 化學純400g氫氧化鈉溶于1000ml無氨 蒸餾水中。2%硼酸：分析純20g硼酸溶于1000ml無氨蒸餾水中。0.05mol/L鹽酸：分析純4.2ml鹽酸定容至1000ml，通 過無水碳酸鈉標定。精品文檔混合指示劑：把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚綠溶液5份和溶于95%乙醇的0.l%甲基紅溶液1份混合而成.2、實驗過程注意事項(1)樣品應是均勻的。 固體樣品應預先研細混勻， 液體樣 品應振搖或攪拌均勻。固體樣品一般取樣范圍為0.20g2.00g;半固體試樣一般 取樣范圍為

3、2.00g5.00g;液體樣品取樣10.0mL25.0mL(約 相當?shù)?0mg40mg)。若檢測液體樣品，結果以g/100mL表 示。樣品應是均勻的。固體樣品應預先研細混勻，液體樣品 應振搖或攪拌均勻。(2)樣品放入定氮瓶內(nèi)時， 不要沾附頸上。 萬一沾附可用 少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結果偏低，或者用濾 紙包裹好一起投入消化，濾紙影響通過空白扣除。消化時應 注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底 消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷 卻，加入數(shù)滴過氧化氫后，再繼續(xù)加熱消化至完全。(3)消化時，不要用強火。 若樣品含糖高或含脂及較多時， 注意控制加熱溫度，以

4、免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品 損失。可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn) 生。在整個消化過程中保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏 瓶底部，以免附在壁上的蛋白精品文檔質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使 氮有損失。海能公司消解爐SH220或SH520能夠很好的解 決此問題。(4)如硫酸缺少， 過多的硫酸鉀會引起氨的損失， 這樣會 形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當硫酸過多的被消耗 或樣品中脂肪含量過高時， 要增加硫酸的量;加入硫酸鉀的作 用為增加溶液的沸點;催化劑硫酸銅在有機物全部消化后， 溶 液顯清澈透明的藍綠色，可用它來指示消化終點。此外，硫 酸銅還可用做下一步蒸餾時堿性反應的指示劑。過

5、氧化氫， 為氧化劑，有助于有機物消化，同時可以消除消化過程中的 氣泡現(xiàn)象。(5)向蒸餾器瓶中加入濃堿時， 往往出現(xiàn)褐色沉淀物， 這 是由于分解促進堿與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經(jīng) 加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時銅離子與氨作用，生 成深蘭色的結合物Cu(NH3)42，加入氫氧化鈉是否足量,常常影響整個測定的順利進行。由反應原理可知，當氫氧化 鈉足量時有黑色氧化銅生成而使溶液呈淡黑色;當氫氧化鈉 量不足時就無黑色氧化銅產(chǎn)生而使溶液呈淡藍色， 所以有無 氧化銅顏色存在是判斷氫氧化鈉是否足量的標志。(6)因蒸餾時反應室的壓力大于大氣壓力，故可將氨帶 出。所以，蒸餾時，蒸氣要發(fā)生均勻，充足，蒸

6、餾中不得停 火斷氣，否則，會發(fā)生倒吸。停止蒸餾時，由于反應室外層 的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應室外層，所以，操作 時，應先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分鐘后 關掉熱源。蒸餾是否完全，可用精密PH試紙測冷凝管口的 冷凝液來測定，中性則說明已蒸餾完全。一般情況下精品文檔建議使 用半微量法，因為如果蒸餾失敗的話，半微量法還可繼續(xù)蒸 餾，而常量法只好全部重來， 費時費力。 我們使用海能K9840經(jīng)過多次蒸餾吸收實驗達到理想效果。(7)混合指示劑在堿性溶液中呈綠色， 在中性溶液中呈灰 色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。(8)吸收液也可以用0.01當量的酸代表硼酸，過剩的酸 液用0.01N堿液滴定，而以硼酸為氨的吸收液，可省去標定 堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴格，亦可免去用移液 管，操作比較簡便。另外，硼酸吸收液的溫度不應超過40C,否則氨吸收減弱，造成檢測結果偏低。可把接收瓶置于冷水 浴中。(9)在鹽酸標準溶液的配制