透射電子顯微鏡生物樣品常規(guī)制樣技術

1、南京農業(yè)大學生命科學 實驗中心電鏡室 2010.6.21制樣技術中所用的化學試劑制樣技術中所用的化學試劑 一、固定劑一、固定劑 1、戊二醛、戊二醛 物理特性：帶有刺激性氣味的無色或淡黃色液體，熔點物理特性：帶有刺激性氣味的無色或淡黃色液體，熔點-14，沸點，沸點189，與水混溶。市售戊二醛一般為，與水混溶。市售戊二醛一般為25的水溶液，的水溶液，pH值在值在23.5之之間。間。 性性 能：穿透性強、固定迅速、能較好地保存酶的活性。能：穿透性強、固定迅速、能較好地保存酶的活性。 健康危害：對眼和上呼吸道有強烈地刺激性，長時間吸入或皮膚接健康危害：對眼和上呼吸道有強烈地刺激性，長時間吸入或皮膚接觸

2、能致敏。觸能致敏。 固定作用：醛類固定劑中的醛基對細胞結構具有很高的親和力，能固定作用：醛類固定劑中的醛基對細胞結構具有很高的親和力，能制樣技術中所用的化學試劑制樣技術中所用的化學試劑 較好地保存糖元、核酸、核蛋白的特性，對微管、內質網(wǎng)等細胞膜系統(tǒng)較好地保存糖元、核酸、核蛋白的特性，對微管、內質網(wǎng)等細胞膜系統(tǒng)和細胞基質具有良好的固定作用。和細胞基質具有良好的固定作用。 缺缺 點：對脂質不起固定作用。點：對脂質不起固定作用。 使用濃度：濃度范圍為使用濃度：濃度范圍為16%，一般常用濃度，一般常用濃度2%3%。通常用。通常用pH 6.87.5的的 0.2M 磷酸緩沖液配制。磷酸緩沖液配制。 2、四

3、氧化鋨、四氧化鋨 物理特性：四氧化鋨俗稱鋨酸，強氧化劑；帶有刺激性氣味的淡黃物理特性：四氧化鋨俗稱鋨酸，強氧化劑；帶有刺激性氣味的淡黃色結晶，熔點色結晶，熔點40，沸點，沸點130，低于沸點時升華，溶于水。市售四氧，低于沸點時升華，溶于水。市售四氧化鋨一般為化鋨一般為0.5克包裝，密封于小玻璃安培瓶里，有劇毒?？税b，密封于小玻璃安培瓶里，有劇毒。制樣技術中所用的化學試劑制樣技術中所用的化學試劑 健康危害：吸入、消化道攝入和皮膚接觸毒性很強，導致嚴重燒傷健康危害：吸入、消化道攝入和皮膚接觸毒性很強，導致嚴重燒傷和刺激，蒸氣、固體及溶液對皮膚具有腐蝕性，吸入會引起肺水腫。和刺激，蒸氣、固體及溶液

4、對皮膚具有腐蝕性，吸入會引起肺水腫。 固定作用：由于它與氮原子有極強的親和力，所以能與氮基、肽、固定作用：由于它與氮原子有極強的親和力，所以能與氮基、肽、蛋白質反應，在蛋白質之間形成交聯(lián)，使其穩(wěn)定，而且不會形成沉淀。蛋白質反應，在蛋白質之間形成交聯(lián)，使其穩(wěn)定，而且不會形成沉淀。四氧化鋨對脂蛋白、核蛋白有良好的固定作用。四氧化鋨對脂蛋白、核蛋白有良好的固定作用。 缺缺 點：四氧化鋨對點：四氧化鋨對 DNA、RNA、糖元和微管等沒有固定作用，、糖元和微管等沒有固定作用，而且對酶的活性影響很大，因此在細胞化學和免疫電鏡實驗中應避免使而且對酶的活性影響很大，因此在細胞化學和免疫電鏡實驗中應避免使用。用

5、。 使用濃度：通常使用濃度為使用濃度：通常使用濃度為1%2%。制樣技術中所用的化學試劑制樣技術中所用的化學試劑 二、緩沖液二、緩沖液 磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（PBS)、 二甲砷酸鈉緩沖液（二甲砷酸鈉緩沖液（CAB） 三、脫水劑三、脫水劑 乙醇、丙酮乙醇、丙酮 透射電鏡生物樣品制備的基本要求透射電鏡生物樣品制備的基本要求 透射電子顯微鏡常規(guī)制樣技術也稱為超薄切片技術，它是根據(jù)透透射電子顯微鏡常規(guī)制樣技術也稱為超薄切片技術，它是根據(jù)透射電子顯微鏡的性能以及對生物樣品的要求的一種樣品制備技術。射電子顯微鏡的性能以及對生物樣品的要求的一種樣品制備技術。 超薄切片制樣技術目前還存在一定的缺超薄切片制樣技

6、術目前還存在一定的缺陷，制樣過程中應根據(jù)研究目的的不同，對陷，制樣過程中應根據(jù)研究目的的不同，對樣品制作的要求應有所側重。從組織形態(tài)學樣品制作的要求應有所側重。從組織形態(tài)學觀點考慮，需要盡可能真實精確地保存結構觀點考慮，需要盡可能真實精確地保存結構,忽略其組織的機能；從生物化學觀點考慮，忽略其組織的機能；從生物化學觀點考慮，主要研究的是組織和細胞的機能，對形態(tài)的主要研究的是組織和細胞的機能，對形態(tài)的要求有所降低。要求有所降低。透射電子顯微鏡常規(guī)制樣步驟透射電子顯微鏡常規(guī)制樣步驟 取材取材 醛類固定醛類固定 (前固定前固定) 緩沖液清洗緩沖液清洗 鋨酸固定鋨酸固定 (后固定后固定) 緩沖液清洗緩

7、沖液清洗 梯度脫水梯度脫水 環(huán)氧丙烷置換環(huán)氧丙烷置換 浸漬浸漬 包埋包埋 聚合（聚合（45、60） 修塊修塊 超薄切片超薄切片 鈾染色鈾染色 、鉛染色、鉛染色 取材的原則和基本要求取材的原則和基本要求 （1 1）取材部位要準確）取材部位要準確 根據(jù)實驗的目的和要求，選取特征非常明顯的正?；虿「鶕?jù)實驗的目的和要求，選取特征非常明顯的正?；虿∽兘M織的部位。變組織的部位。 如果實驗對象是經(jīng)過一個系列方法（時間系列、濃度系如果實驗對象是經(jīng)過一個系列方法（時間系列、濃度系列等）處理，取材時要做到各階段取材部位盡可能保持一致，這列等）處理，取材時要做到各階段取材部位盡可能保持一致，這樣最終的實驗結果才有可

8、比性。樣最終的實驗結果才有可比性。 （2 2）取材要迅速）取材要迅速 為了使生物體活體時的狀態(tài)能夠完整的保存下來，取材時必為了使生物體活體時的狀態(tài)能夠完整的保存下來，取材時必須迅速。須迅速。 取材的原則和基本要求取材的原則和基本要求 生物材料特別是動物材料在離體后，由于組織細胞中的各生物材料特別是動物材料在離體后，由于組織細胞中的各種酶，尤其是溶酶體中的水解酶迅速釋放到組織中，會造成蛋白種酶，尤其是溶酶體中的水解酶迅速釋放到組織中，會造成蛋白質、核酸的降解，形成自溶。故取材后要迅速投入到固定液中。質、核酸的降解，形成自溶。故取材后要迅速投入到固定液中。 （3 3）取材時的溫度要低）取材時的溫度

9、要低 主要是為了降低組織內酶的活性，減少蛋白質和核酸降解主要是為了降低組織內酶的活性，減少蛋白質和核酸降解的速率。的速率。 取材應在取材應在0 044的低溫條件下操作，取材的器械和固的低溫條件下操作，取材的器械和固定液也要預冷。定液也要預冷。取材的原則和基本要求取材的原則和基本要求 （4 4）材料的體積要?。┎牧系捏w積要小 通常戊二醛的滲透深度約為通常戊二醛的滲透深度約為 0.5 0.5 毫米，鋨酸的滲透深度約毫米，鋨酸的滲透深度約為為 0.25 0.25 毫米。由于固定液的滲透能力原因，為了使材料各部分毫米。由于固定液的滲透能力原因，為了使材料各部分能夠得到迅速的固定，取材的體積不應超過能夠

10、得到迅速的固定，取材的體積不應超過1 1立方毫米。立方毫米。 （5 5）取材時應避免損傷）取材時應避免損傷 取材器械要鋒利，盡量減少由于擠壓、牽拉所造成組織內取材器械要鋒利，盡量減少由于擠壓、牽拉所造成組織內部結構的損傷破壞。通常使用手術刀或雙面刀片。部結構的損傷破壞。通常使用手術刀或雙面刀片。 （1）動物取材）動物取材 一般將動物麻醉或急性處死后迅速解剖選取出所需要的組一般將動物麻醉或急性處死后迅速解剖選取出所需要的組織器官，放入預冷的固定液中，然后再在滴有預冷固定液的蠟板織器官，放入預冷的固定液中，然后再在滴有預冷固定液的蠟板或泡沫板上，用新的鋒利的刀片切成或泡沫板上，用新的鋒利的刀片切成

11、1mm3左右的小塊，用牙簽左右的小塊，用牙簽輕輕挑入到裝有預冷固定液的玻璃小瓶內，置于輕輕挑入到裝有預冷固定液的玻璃小瓶內，置于4條件下低溫條件下低溫固定。固定。 對于特殊材料如神經(jīng)組織或腦組織，可用原位固定或灌流對于特殊材料如神經(jīng)組織或腦組織，可用原位固定或灌流固定，待組織適度硬化后再取材。固定，待組織適度硬化后再取材。取取 材材 方方 法法取取 材材 方方 法法 （2 2）植物材料）植物材料 植物材料的取材較為容易，材料離體后的變化不會像動物植物材料的取材較為容易，材料離體后的變化不會像動物材料那樣快。但仍需要盡快投入預冷固定液中固定。植物材料表材料那樣快。但仍需要盡快投入預冷固定液中固定

12、。植物材料表面的毛刺需要組織軟化處理，表面有蠟質的葉片要進行脫蠟處理，面的毛刺需要組織軟化處理，表面有蠟質的葉片要進行脫蠟處理，再用雙蒸水清洗數(shù)次后，取材固定。再用雙蒸水清洗數(shù)次后，取材固定。 植物葉片可切成植物葉片可切成1mm1mm寬、寬、2 23mm3mm長的長條狀，直徑小于長的長條狀，直徑小于0.5mm0.5mm的幼根可直接取的幼根可直接取2 2 3mm3mm長一段。長一段。 由于植物材料常常漂浮在固定液表面，不利于固定，由于植物材料常常漂浮在固定液表面，不利于固定，取取 材材 方方 法法 因此，需要適當?shù)某闅馐共牧铣寥牍潭ㄒ褐?，從而達到充分固因此，需要適當?shù)某闅馐共牧铣寥牍潭ㄒ褐?，從?/p>

13、達到充分固定的目的。定的目的。 （3）野外取樣方法）野外取樣方法 準備好裝有冰塊的保溫瓶，放入一定量的戊二醛固定液和緩準備好裝有冰塊的保溫瓶，放入一定量的戊二醛固定液和緩沖液。取材時，可先取比標準體積稍大的組織塊，放入固定液內，沖液。取材時，可先取比標準體積稍大的組織塊，放入固定液內，帶到實驗室后再切成標準塊。帶到實驗室后再切成標準塊。切切 片片 染染 色色 切片染色通常采用鈾切片染色通常采用鈾鉛雙染色的方法。鉛雙染色的方法。 染色時間：文獻或資料上推薦一般為鈾染染色時間：文獻或資料上推薦一般為鈾染15153030分鐘；鉛分鐘；鉛染染10101515分鐘。分鐘。 由于由于H7650H7650透射電鏡具有高反差功能以及配備了高靈敏度透射電鏡具有高反差功能以及配備了高靈敏度的底插式的底插式CCDCCD，圖片反差強，因而，在切片染色時間上需要做一，圖片反差強，因而，在切片染色時間上需要做一個適當?shù)恼{整。個適當?shù)恼{整。 對于生物樣品而言，染色要根據(jù)樣品的特性、觀察目的以對于生物樣品而言，染色要根據(jù)樣品的特性、觀察目的以及溫度等因素，染色時間要有所不同