鼠傷寒沙門氏菌微粒體酶試驗(yàn)

1、毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課鼠傷寒沙門氏菌微粒體酶試驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌微粒體酶試驗(yàn)Ames test公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理教研室公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理教研室高淑英高淑英毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課原原 理理鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌野生型（原養(yǎng)型）野生型（原養(yǎng)型）人工方法正向誘變鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型（異養(yǎng)型）組氨酸缺陷型（異養(yǎng)型）誘變物作用回復(fù)突變 AmesAmes是檢測(cè)遺傳毒理學(xué)的體外試是檢測(cè)遺傳毒理學(xué)的體外試驗(yàn)，檢測(cè)終點(diǎn)是基因突變驗(yàn)，檢測(cè)終點(diǎn)是基因突變毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課TA1537TA1538TA1535R R因子因子R R因子因子R R因子因子TA9

2、7TA98TA100TA102移碼突變移碼突變堿基置換突變堿基置換突變移碼突變、堿移碼突變、堿基置換突變基置換突變實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)菌株毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課深粗糙深粗糙（rfa）特性特性2紫外線敏感（紫外線敏感（UvrB）特性）特性3抗氨芐青霉素（抗氨芐青霉素（R因子）特性因子）特性4自發(fā)回變特性自發(fā)回變特性5組氨酸需求特性組氨酸需求特性1毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課1、組氨酸需求特性、組氨酸需求特性有細(xì)菌生長(zhǎng)有細(xì)菌生長(zhǎng)空白空白空白空白組氨酸組氨酸- -生物素生物素賴氨酸賴氨酸空白空白37 24h0.1ml0.1ml菌液菌液頂層頂層底層底層毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課2、深粗糙（

3、、深粗糙（rfa）特性）特性0.1ml0.1ml菌液菌液頂層頂層普通培養(yǎng)基普通培養(yǎng)基抑菌環(huán)抑菌環(huán)濾紙片（有結(jié)晶紫）濾紙片（有結(jié)晶紫）3724h24h毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課3、紫外線敏感特性、紫外線敏感特性普通培養(yǎng)基普通培養(yǎng)基15W紫外燈紫外燈33cm，8s37，24h毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課4、抗氨卞青霉素（抗氨卞青霉素（R R因子）因子）特性特性37，24h青霉素青霉素普通培養(yǎng)基普通培養(yǎng)基毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課5、自然回變特性、自然回變特性0.1ml0.1ml菌液菌液頂層頂層底層底層37，24h毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課菌株菌株基因型基因型組氨酸組氨酸缺陷缺

4、陷脂多糖脂多糖屏蔽缺失屏蔽缺失抗氨卞抗氨卞西林西林抗四環(huán)抗四環(huán)素素uvrBuvrB修修復(fù)缺陷復(fù)缺陷自發(fā)回變自發(fā)回變（-S9-S9）TA97TA97+ + + +- -+ +90-18090-180TA98TA98+ + + +- -+ +30-5030-50TA100TA100+ + + +- -+ +120-200120-200TA102TA102+ + + +- -+ +240-320240-320毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則受試物最低劑量為每皿受試物最低劑量為每皿0.1g0.1g一般選用一般選用4545個(gè)劑量個(gè)劑量 每個(gè)劑量應(yīng)做每個(gè)劑量應(yīng)做2 2或或3 3個(gè)平

5、行平皿個(gè)平行平皿 設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性（溶劑）對(duì)照設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性（溶劑）對(duì)照 受試物最高劑量為每皿受試物最高劑量為每皿5mg5mgAmesAmes試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課將頂層培養(yǎng)基倒入底層培養(yǎng)基中，凝將頂層培養(yǎng)基倒入底層培養(yǎng)基中，凝固后放入濾紙片，將受試物點(diǎn)在紙片固后放入濾紙片，將受試物點(diǎn)在紙片上放入底層，上放入底層，3737培養(yǎng)培養(yǎng)48h48h觀察結(jié)果觀察結(jié)果將受試物將受試物0.1ml0.1ml、菌液、菌液0.1ml0.1ml分別加入分別加入頂層培養(yǎng)基中，倒入底層培養(yǎng)基中，頂層培養(yǎng)基中，倒入底層培養(yǎng)基中，凝固后凝固后3737培養(yǎng)培養(yǎng)48h48h觀察結(jié)果觀察結(jié)果Am

6、esAmes試驗(yàn)方法及結(jié)果評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法及結(jié)果評(píng)價(jià)點(diǎn)樣紙片周圍長(zhǎng)出一點(diǎn)樣紙片周圍長(zhǎng)出一圈密集的圈密集的His+His+回變菌回變菌落者，受試物即為陽(yáng)落者，受試物即為陽(yáng)性致突變物質(zhì)。性致突變物質(zhì)。背景菌生長(zhǎng)良好受試物背景菌生長(zhǎng)良好受試物每皿回變菌落數(shù)增加一每皿回變菌落數(shù)增加一倍以上并有劑量倍以上并有劑量- -反應(yīng)反應(yīng)關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果具有重關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果具有重現(xiàn)性即可認(rèn)為該受試物現(xiàn)性即可認(rèn)為該受試物為誘變陽(yáng)性。為誘變陽(yáng)性。 毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課S-9S-9混合液的制備過(guò)程混合液的制備過(guò)程暴露肝臟，暴露肝臟，KCLKCL灌注灌注斷頭處死大鼠、放血、去皮斷頭處死大鼠、放血、去皮取出肝臟，加入取

7、出肝臟，加入KCLKCL剪碎剪碎制成勻漿，制成勻漿，9000g9000g離心離心取上清、分裝、凍存取上清、分裝、凍存毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課S-9S-9混合液的組成成分混合液的組成成分肝勻漿肝勻漿S-9 100 l 0.4mol/L MgCl2 20 l1.66mol/LKCl 20 l0.05mol/L 6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 100 l0.025mol/L 輔酶輔酶(NADPH) 160 l0.2mol/L 磷酸緩沖液磷酸緩沖液 500 l 加滅菌水加滅菌水 至至 1ml毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課毒理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課安全措施與廢棄物處理應(yīng)有專門的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)有良好的通風(fēng)設(shè)備。應(yīng)有專門的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)有良好的通風(fēng)設(shè)備。 試驗(yàn)者必須注意個(gè)人防護(hù)，盡量減少接觸污染的機(jī)會(huì)。試驗(yàn)者必須注意個(gè)人防護(hù)，盡量減少接觸污染的機(jī)會(huì)。 受試的致癌物與致突變物的廢棄處理，原則上按放射性受試的致癌物與致突變物的廢棄處理，原則上按放射性核素廢棄物處理方法進(jìn)行。