核酸分子雜交

1、核酸分子雜交定義 具有一定互補序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補配對原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程叫核酸分子雜交。種類按反應支持物可分為固相雜交和液相雜交兩種：固相雜交應用較廣，包括Southern blot、Northern blot 、Spot blot、in situ hybridization等。DNA HybridizationDe- and re-nature DNA DS using temperature variation一. 核酸探針制備及標記 核酸探針（probe）是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段，因而可檢測樣品中特定的基因序列。探針 根據(jù)核酸探針的來源及

2、性質(zhì)有雙鏈DNA、單鏈DNA、單鏈RNA和人工合成的寡核苷酸探針等。用于分子雜交的核酸探針均須進行標記，帶有示蹤物，與靶基因雜交后，才能檢測顯示出雜交體信號。標記物有放射性同位素和非放射性同位素兩大類。3H、35S和32P是三種較常用的放射性同位素標記物，非放射 性 同 位 素 標 記 物 較 常 用 的 是 生 物 素（biotin）、地高辛（digoxigenin，DIG）和熒光素等。(一)缺口平移標記法（Nick translation） 原理 在未標記的DNA探針溶液中加入一定量的胰DNA酶（DNase），DNA聚合酶和標記的三磷酸核苷。DNase在DNA雙鏈上隨機切開若干個帶有3-O

3、H末端的單鏈缺口，而DNA聚合酶發(fā)揮53核酸外切酶活性從5-末端標記 切除單核苷酸；同時又具有從53的聚合作用，將標記的三磷酸核苷按53方向重新修補缺口，此新合成DNA的兩條鏈均勻地被摻人標記物。該法適合于各種環(huán)狀或線性雙鏈DNA探針標記。標記 試劑 1.10缺口平移緩沖液 0.5mol/LTris-Cl(pH7.2） 0.1mol/LMgSO4 1.0mmol/L二硫蘇糖醇(DTT) 500g/ml牛血清白蛋白(BSA) 標記 2.未標記脫氧三磷酸核苷（dNTP）溶液：dTTP、dCTP、d GT P 溶 于 5 0 m m o l / L Tr i s - C l ( p H 7 . 2

4、) ， 終 濃 度 為20mmol/L。 3.DNase（10ng/ml）：溶于含50g/mlBSA、1mmol/LDTT、50%（V/V）乙二醇的溶液。 4.DNA聚合酶（5U/l）：溶于50mmol/LTris-Cl(pH7.2)。 5.-32PdATP：3000Ci/mmol、10Ci/l。操作步驟 1.加樣：冰浴下依次加入下列試劑并混勻： 10缺口平移緩沖液2.5l 未標記的dNTP混合液1.0l DNA（0.51g)5.0l -32PdATP5.0l DNase（振蕩混勻）2.5l DNA聚合酶（振蕩混勻）0.5l 雙蒸去離子水至體積25l操作步驟 2.反應：于1416水浴23小時。

5、加1l0.5mol/LEDTA（pH8.0)終止反應。 3.分離：標記完畢的反應液加至TE緩沖液平衡的SephadexG-50柱上（柱床體積為0.730mm）。加樣完畢后，用TE緩沖液洗脫，分管收集洗脫液，每管約200l。再每管取5l點樣于濾紙上液閃計數(shù)。主峰為純化的標記探針，尾峰為未被結(jié)合的游離標記核苷酸。將主峰部分收集，20儲存。 操作步驟 4.結(jié)合率的計算： 主峰計數(shù)（CPM） 結(jié)合率=x100% 主峰計數(shù)（CPM）+尾峰計數(shù)（CPM） 一般結(jié)合率在2030%。（二）5末端標記法 原理 DNA5末端的磷酸根，用堿性磷酸酶去磷酸化，再用T4多核苷酸激酶將-32PATP的-32P轉(zhuǎn)移到DNA

6、5端的羥基上。試劑 1.5T4多核苷酸激酶緩沖液 0.5mol/LTris-Cl(pH7.6） 0.1mol/LMgCl2 50mmol/LDTT 1mmol/L精脒（Spermidine） 2.T4多核苷酸激酶溶液（1U/l） 3.堿性磷酸酶（25U/ml）操作步驟 1.DNA去磷酸化：在Eppendorf管內(nèi)加5lDNA，25l50mmol/LTris-Cl(pH8.0）和20l堿性磷酸酶，37反應3060分鐘。然后用酸變性堿性磷酸酶，用乙醚提取。再加1/10體積3.0mol/L醋酸鈉，用乙醇沉淀。 2.將0.1mCi-32PATP放入小離心管，凍干。 3.轉(zhuǎn)32P到DNA上：在含有-32

7、PATP的小離心管內(nèi)，依次加入38l去磷酸的DNA，10l多核苷酸激酶緩沖液，3l多核苷酸激酶，在37反應3040分鐘。 4.分離：加等體積飽和酚，離心510分鐘后，取上清液到另一個小離心管內(nèi)，再加500l乙醚，混勻，離心，棄去上層含有殘留酚溶液，加1/10體積3.0mol/L醋酸鈉。然后加雙倍體積冷乙醇混合在-70中15分鐘，或-20中2小時，沉淀DNA。操作步驟（三）隨機引物標記法 原理 隨機引物是指含有各種可能排列組合順序的寡核苷酸混合物。目前實驗室中常用的隨機引物多是人工合成，其長度為6個核苷酸。標記的方法是將雙鏈DNA變性成單鏈DNA，再與隨機引物退火雜交，在四種脫氧三磷酸核苷存在下

8、，由大DNA聚合酶大片段（Klenow片段）催化，從引物的3末端開始按53方向合成與模板DNA互補的DNA鏈，如有-32PdNTP或其他示蹤物的摻人，就可產(chǎn)生標記的DNA探針。原理 隨機引物是指含有各種可能排列組合順序的寡核苷酸混合物。目前實驗室中常用的隨機引物多是人工合成，其長度為6個核苷酸。標記的方法是將雙鏈DNA變性成單鏈DNA，再與隨機引物退火雜交，在四種脫氧三磷酸核苷存在下，由大DNA聚合酶大片段（Klenow片段）催化，從引物的3末端開始按53方向合成與模板DNA互補的DNA鏈，如有-32PdNTP或其他示蹤物的摻人，就可產(chǎn)生標記的DNA探針。操作步驟 1.在Eppendorf管中

9、，將TE溶解的30100ng純化的雙鏈DNA與15ng隨機引物混合（總體積不超過14l），置沸水中變性3分鐘，再立即置冰浴中冷卻； 2.迅速離心10秒，使溶液聚集于試管底部，冰浴中放置；3.冰浴中在一微量離心管中依次加入下列試劑并混勻： 10Klenow緩沖液2.5l 10dNTP2.5l Klenow片段1.0l -32PdCTP5.0l 4.將上述混合液加入到變性模板DNA隨機引物溶液中。 5室溫放置3小時以上。操作步驟 6加1l0.5mol/LEDTA（pH8.0)終止反應，并用TE緩沖液稀釋反應液至100l，20保存?zhèn)溆?。操作步驟（四）光化生物素法 原理 光化生物素是一種化學合成的生物

10、素衍生物，分子中含有可光照活化的疊氮代硝苯基，生成活潑N基團，后者易與DNA或RNA中的伯胺基發(fā)生結(jié)合反應，生成光化生物素標記核酸探針。 材料 1.光化生物素：在暗室中用滅菌雙蒸水配成1mg/ml，分裝后，避光下20可穩(wěn)定保存46個月。 2.正丁醇或仲丁醇 3.特種光源：LYQ12-100鹵鎢燈操作步驟 1.暗室安全燈下，在Eppendorf管中加入125g待標記核酸（0.51.0g/mlDNA或RNA），兩倍量的光化生物素（即250g），補水至50l。將反應管敞開插入冰模中，距鹵鎢燈光源10cm，強光照射30分鐘。加100lTE緩沖液。此后操作在正常光線下。 2.加100l正丁醇（或仲丁醇）

11、，抽提兩次，去上層正丁醇； 3.加1/10體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2倍體積冷無水乙醇，混勻后置20過夜。 4.離心的沉淀經(jīng)干燥后，溶于適量的0.1mol/LEDTA或滅菌雙蒸水中，濃度為50g/ml，分裝后20避光保存。操作步驟（五）DIG標記探針 DIG標記是德國BoehringerMannheim公司發(fā)展的一種非放射性標記方法。Digoxigenin-11dUTP可以通過隨機引物標記結(jié)合到DNA探針或通過DNA體外轉(zhuǎn)錄標記到RNA探針，或通過3尾端標記結(jié)合到寡聚核苷酸探針。然后與抗地高辛抗體（antidigonigeninalkalinephosphatase）進行免疫反應，

12、通過化學呈色檢測。DIG標記法與前述同位素酶促標記法基本相同。二.斑點雜交 原理 將DNA或RNA變性后直接點樣吸附于固相支持濾膜上，然后用標記探針與之雜交，洗滌去除未反應探針，采用放射自顯影或顯色反應檢測顯示雜交信號，分析結(jié)果。 本節(jié)主要介紹用-32P標記DNA探針及光化生物素標記DNA探針檢測DNA與RNA的斑點雜交方法。材料1 器材同位素探測儀自動光密度掃描儀真空抽濾加樣器X光膠片盒（帶增感屏）2.試劑 20SSC（3mol/LNaCl、0.3mol/L檸檬酸三鈉）：稱取175.32gNaCl，加700ml雙蒸水，充分溶解后，加88.2g檸檬酸三鈉，溶解后加雙蒸水至1000ml，8磅高壓

13、滅菌15分鐘。 去離子甲酰胺：稱取11g離子交換樹脂（Bio-BadAG501-X8，2025目）與110ml甲酰胺混合，室溫下攪拌30分鐘，用Waterman濾紙過濾2次，分裝后20保存。 胰腺癌飲食： 硫酸葡聚糖（1mg/ml）：稱取1mg硫酸葡聚糖干粉，溶于1ml滅菌水，20保存。 50Denhardt溶液（1%BSA、1%PVP-40、1%Ficoll-400）：分別稱取1gBSA，1gPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮），1gFicoll-400（水溶性聚蔗糖），用少量雙蒸水溶解混合，加雙蒸水至100ml。過濾除菌，20保存。2.試劑 變性鮭魚精DNA（10mg/ml）：稱取鮭魚精DNA（

14、Sigma，型，鈉鹽）10mg放入滅菌管中，加入100mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA緩沖液1ml，用超聲波處理至液體透亮，完全溶解，分裝后20保存。臨用前置沸水浴中3分鐘，然后迅速在冰浴中冷卻。預雜交液中應含100g/mlDNA經(jīng)變性并打斷的鮭魚精DNA。 卵白素-堿性磷酸酶（Avidin-AKP，100U/100l）：以0.4%TritonX-100PBS液配制。使用液中Avidin-AKP濃度為12U/1ml。2.試劑 底物緩沖液：100mmol/LTris-Cl（pH9.5）、1mol/LNaCl、5mmol/LMgCL2。 底物顯色液 1）50mg/mlBCIP：

15、10mgBCIP溶于200l二甲基酰胺。 2）75mg/mlNBT：15mgNBT溶于200l70%二甲基酰胺（H2O配制）。 3）底物顯色液：5ml底物緩沖液+10lBCIP+10lNBT2.試劑操作步驟 -32P標記DNA探針的斑點雜交 1.樣膜的制備 (1)、核酸樣品的預變性 所取DNA及RNA樣品的量視情況而定，一般可加1020g。 1）DNA樣品：樣品DNA溶于水或TE緩沖液，置沸水浴510分鐘，并于冰浴中迅速冷卻，使其變性。 2）RNA樣品：在Eppendorf管加入下列試劑： RNA樣品10l 20SSC2l 甲醛7l 甲酰胺20l 混勻置68溫育15分鐘，并迅速入冰浴中至少5分

16、鐘。操作步驟 (2)尼龍膜的預處理：戴上干凈手套，取尼龍膜按需要剪成合適大小，并剪掉一角作為點樣順序標記。如采用手工點樣，用鉛筆在尼龍膜上按0.81cm2的面積標上小格。用蒸餾水浸濕，再浸入6SSC溶液中至少30分鐘，將膜取出自然涼干后待用。操作步驟(3)點樣 可根據(jù)情況選用手工直接點樣或用真空抽濾加樣器點樣。點樣 1)手工直接點樣：用微量移液器將經(jīng)變性處理的核酸樣品依次點到尼龍膜的標記點上。斑點直徑不要過大，應控制在0.5cm2以內(nèi)。單個樣品分少量多次點樣，邊點樣邊風干。點樣 2)斑點（狹縫）真空抽濾加樣器點樣：常規(guī)方法清洗加樣器后，用0.1mol/LNaOH清洗點樣器，滅菌三蒸水充分沖洗，

17、如為RNA樣品則還應用DEPC處理的水充分沖洗。將尼龍膜濕潤后覆蓋在加樣器支持墊上（或為預先濕潤的濾紙），小心排除氣泡，尼龍膜覆蓋不到的部分需用Parafilm膜封閉；重新安裝好加樣器，接通真空泵。加樣孔內(nèi)加滿10SSC，真空抽濾至所有液體被抽干；關(guān)閉真空泵，然后重復抽濾一次。點樣 上述經(jīng)預變性處理的樣品中加入2倍體積20SSC，分別加至各孔，真空抽濾。待全部液體抽干后，再加10SSC抽濾兩次。待10SSC抽干后再維持真空5分鐘，使尼龍膜干燥。點樣 (4)固定：點樣后的樣膜，置濾紙上，室溫自然干燥，然后80烘烤2小時固定核酸樣品。固定的樣膜封存于塑料袋內(nèi)待用（20可保存若干月）。2.預雜交 (

18、1)配制預雜交液：終濃度為6SSC、50%去離子甲酰胺、5Denhardt液、0.5mg/ml鮭魚精DNA和0.5%SDS。 (2)將封存樣膜的塑料袋剪一斜角開口，加少量的2SSC使其濕潤，棄余液。按150200l/cm2膜，加入預雜交液，去除袋內(nèi)氣泡，熔封塑料袋斜角開口處。將此塑料袋置恒溫搖床或雜交爐中，42溫育24小時。3.雜交 (1)探針變性：-32P標記的探針如為雙鏈DNA，則需經(jīng)變性處理。將標記好的探針置沸水浴中5分鐘，然后迅速置冰浴中。 (2)配制雜交液：終濃度為6SSC、50%去離子甲酰胺、5Denhardt液、0.1mg/ml鮭魚精DNA、0.5%SDS和放射性同位素探針0.5

19、ng/l。雜交 (3)雜交：從水浴中取出塑料袋，剪去一角，棄預雜交液，加入雜交液（按80l/cm2膜）及-32P標記探針。小心排除氣泡，重新封好口。為防止污染，應將塑料袋外再套另一塑料袋。將雜交袋置恒溫搖床或雜交爐中，42溫育1620小時。4.洗膜 雜交溫育結(jié)束后，剪開雜交袋一角，將雜交液倒入放射性廢物容器中，剪開袋取出膜，放進裝有2SSC0.1%SDS的盤中，室溫搖晃漂洗5分鐘。根據(jù)需要選擇不同方法洗膜，去除非特異性的同位素。洗膜 (1)高嚴謹性漂洗：依次按下列條件漂洗： 2SSC0.1%SDS室溫，215分鐘； 0.1SSC0.1%SDS室溫，215分鐘； 0.1SSC0.1%SDS55，

20、215分鐘；洗膜 (2)低嚴謹性漂洗：依次按下列條件漂洗： 6SSC0.1%SDS室溫，215分鐘； 2SSC0.1%SDS室溫，215分鐘； 1SSC0.1%SDS55，215分鐘。5.放射性自顯影 樣膜經(jīng)漂洗后，置干凈濾紙上，吸去膜上多余水分，外面裹一層保險膜。暗室安全燈下，在膠盒中壓上2張X光膠片，樣膜上下各1張，蓋上膠片盒80放射自顯影。時間視雜交強度而定，24小時10天不等。取出膠片盒，恢復至室溫。按常規(guī)沖洗X光片：顯影15分鐘,停顯1分鐘,定影5分鐘,流動水沖洗10分鐘，自然干燥。6.結(jié)果觀察 根據(jù)曝光點（或狹縫）的有無、強弱，可以判定目的基因的有無及量的多少。利用自動灰度掃描儀掃

21、描曝光點（狹縫），計算積分光密度值，可以進行半定量分析。（二）光敏生物素標記DNA探針的點雜交 1.樣膜的制備 按-32P標記DNA探針的斑點雜交方法進行。 2.預雜交 按-32P標記DNA探針的斑點雜交方法進行。 預雜交液中各組份的終濃度為：5SSC、50%去離子甲酰胺、5Denhardt液、50mmol/LNa2HPO4（pH7.0）、5mmol/LEDTA、0.5mg/ml鮭魚精DNA。3.雜交 (1)探針變性：將標記的光化生物素DNA探針加入0.5mlEppendorf管中，置沸水中510分鐘，立即置于冰浴中，使保持單鏈狀態(tài)。雜交 (2)配制雜交液：各組分終濃度為5SSC、50%去離子

22、甲酰胺、1Denhardt液、20mmol/LNa2HPO4（pH7.0）、5%硫酸葡聚糖、0.1mg/ml鮭魚精DNA、光敏生物素標記DNA探針20100ng/ml組成。雜交 (3)雜交：參見-32P標記DNA探針的斑點雜交。4.洗膜 取出樣膜置含2SSC0.1%SDS溶液中漂洗5分鐘。再按下列條件洗膜：2SSC0.1%SDS100ml，室溫，320分鐘；0.1SSC0.1%SDS100ml，65，330分鐘；將樣膜置干凈濾紙上，室溫自然干燥，封入塑料袋內(nèi)（不立即顯色可存放于20至少1個月）。5.顯色 (1)封閉：將3%BSA溶液加入塑料袋內(nèi)，于42溫育封閉1小時。顯色 (2)酶聯(lián)顯色反應：

23、棄封閉液，再加入適當稀釋的Avidin-AKP，置室溫1530分鐘，不時輕微振蕩。隨后依次按下列條件洗膜：100mmol/LTris-HCl（pH7.5）、1mol/LNaCl；100mmol/LTris-HCl（pH9.5）、1mol/LNaCl、5mmol/LMgCl2。將膜轉(zhuǎn)入新塑料袋中，加入新配制的底物顯色液，在暗環(huán)境中室溫下顯色，時間1560分鐘。6.結(jié)果判定 出現(xiàn)藍紫色斑點（狹縫）者為陽性，未著色為陰性。根據(jù)著色的深淺可以判定目的基因的多少。三. Sourthern印跡雜交 原理 Sourthern印跡雜交是分析DNA的一種方法，從細胞或組織中提取高分子量的DNA，用一種或多種限制

24、性內(nèi)切酶消化，通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得片段，從凝膠中按原來位置和順序吸印轉(zhuǎn)移到固相支持膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，然后再與同位素或非同位素標記探針雜交，最后經(jīng)放射自顯影或顯色反應進行檢測。 以-32P標記DNA探針檢測DNA為例，介紹Sourthern印跡雜交方法。材料 （一）器材 同位素探測儀 自動光密度掃描儀 真空核酸轉(zhuǎn)移裝置 紫外照相裝置 X光膠片盒（帶增感屏） （二）試劑及配制 1.0.2mol/LHCl 2.變性液:0.5mol/LNaOH 1.5mol/LNaCl 3.中和液:1mol/LTris-Cl（pH7.4） 1.5mol/LNaCl 4、轉(zhuǎn)移液:20SSC；或2

25、0SSPE 5、1mol/LTris-Cl（pH7.5）1.5mol/LNaCl操作步驟 （一）瓊脂糖凝膠電泳分離基因組DNA限制性酶切片段 1、在滅菌Eppendorf管中依次加入下列試劑并混勻（以常用的30l反應體積為例）： 0.5g/l基因組DNA20l 雙蒸去離子水5l 10緩沖液3l 限制性內(nèi)切酶（10U/l）2l 2、12000g離心數(shù)秒，使管壁上的液珠離心至管底，以保證反應體系體積準確。 3、置37水浴保溫36小時。 4、加入1/5體積的0.5mol/LEDTA終止反應。 5、依常規(guī)方法進行DNA的瓊脂糖凝膠電泳。 （二）DNA的轉(zhuǎn)移與固定 基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和瓊脂糖

26、凝膠電泳后，可將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移至固相支持膜上，方法主要有毛細管洗脫法及真空轉(zhuǎn)移法。 1、毛細管洗脫法 （1）電泳結(jié)束后照相，然后切去凝膠的邊角作為標記。 （2）將膠置于0.2mol/LHCl中處理10分鐘，如果檢測的DNA片段1kb，可適當延長時間（1020分鐘）。當膠中溴酚藍由藍轉(zhuǎn)成桔黃時，說明膠已處理完成。 （3）棄去HCl溶液，用去離子水漂洗2次。隨后浸泡于數(shù)倍體積的變性液中1545分鐘后（此時溴酚藍重新變?yōu)樗{色），換用中和液處理1530分鐘。 （4）取一瓷盤，加入轉(zhuǎn)移液，上置一塊略大于凝膠的玻璃板作為平臺，玻璃板表面鋪一張新華二號濾紙，濾紙的兩邊浸沒在轉(zhuǎn)移液中，去除玻璃板與濾紙之間

27、的所有大小氣泡。 （5）根據(jù)膠的大小載剪固相支持膜及濾紙片（35張），同樣剪去膜的一角作標志（也可用鉛筆在膜下端寫上有關(guān)資料，如時間、樣品及所用酶等）。 （6）將膜平鋪在去離子水表面，直到濾膜從下到上濕透為止，然后將其轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移液中，至少5分鐘。操作時戴手套，用平頭鑷。 （7）將經(jīng)轉(zhuǎn)移液浸泡的濾紙片12張鋪到轉(zhuǎn)移臺上，驅(qū)逐氣泡。倒上少許轉(zhuǎn)移液，用大小適合的薄塑料板將膠從中和液中托起，將加樣孔先接觸轉(zhuǎn)移臺，自一端起將膠滑放到濾紙上，注意不要留下氣泡。將浸泡好的膜放在膠上，使膜的上端對齊加樣孔。放上23層預先浸泡過轉(zhuǎn)移液的濾紙片，放上吸水紙堆至1015cm高，上面加一塊平板，然后壓上0.5kg左右的

28、重物。 （8）轉(zhuǎn)移持續(xù)824小時，每當紙巾浸濕后更換新的紙巾。小片段轉(zhuǎn)移快，大片段轉(zhuǎn)移需要時間較長。 （9）轉(zhuǎn)移完畢，移去吸水紙，用平頭鑷將膜取出，在6SSC溶液中浸泡濾膜5分鐘，用濾紙印吸干后，夾在兩層干凈濾紙片中，置于80烤0.52小時。封入塑料袋中保存?zhèn)溆谩?2、真空轉(zhuǎn)移法 （1）安裝真空轉(zhuǎn)移裝置 1)根據(jù)膠的大小做好塑料膜窗口，其大小略小于凝膠，每邊應有310mm的重合，讓膠將窗口嚴密地封住。但不能大于10mm，否則加入液體后，膠容易漂起來。 2)將多孔濾板安放在裝置的下槽內(nèi)，四邊套緊氣密圈，再放上塑料膜窗口。 3)將上框放上，壓住窗口塑料膜的四邊，夾緊四角上的鎖定夾。 （2）依次放上

29、轉(zhuǎn)移膜及瓊脂糖凝膠 1)膜的準備：將硝酸纖維素膜或尼龍膜裁剪成每邊少于窗口邊緣0.51.0mm。 2)用水浸濕，再用20SSC漂浮轉(zhuǎn)移膜2030分鐘，尼龍膜可不預處理。 3)將膜放在窗口內(nèi)，務(wù)使每邊留下1mm左右的空隙。 4)用一張大小合適的薄塑料片托住凝膠，將加樣孔與窗口對齊平放，然后使膠滑落在膜上，覆蓋住窗口。 5)啟動真空泵，使凝膠吸壓在膜和塑料窗口上，檢查密封效果。 （3）脫嘌呤處理：用巴氏吸管加0.2mol/LHCl于凝膠上，使覆蓋整個凝膠，使真空泵負壓在2030Mbar維持1020分鐘，至溴酚藍完全變色為止。吸去凝膠上面的HCl。 （4）變性處理：同法加入變性液覆蓋整塊凝膠，使真空

30、泵負壓在2030Mbar維持1020分鐘，至溴酚藍顏色完全復原為止。吸去凝膠上面的變性液。 （5）中和處理：同法加入中和液覆蓋整塊凝膠，使真空泵負壓在2030Mbar維持1020分鐘，吸去凝膠上面的中和液。 （6）轉(zhuǎn)移：從凝膠中央小心加入20SSC溶液，直至覆蓋住整塊 凝 膠 ， 液 面 最 好 達 2 倍 凝 膠 的 厚 度 。 真 空 負 壓 為 5 0 55Mbar，轉(zhuǎn)移時間依照凝膠的厚度、濃度而定，凝膠的厚度和濃度越高，所需時間越長，一般持續(xù)轉(zhuǎn)移3060分鐘。 （7）固定：轉(zhuǎn)移結(jié)束，依次移去上框、剩余的20SSC、凝膠及真空墊圈，取出轉(zhuǎn)移膜，不要浸泡或沖洗，轉(zhuǎn)移面朝上放在濾紙上晾干。將

31、膜夾在兩層濾紙中間，80干烤固定12小時，封入塑料袋中保存?zhèn)溆谩?（三）預雜交、雜交、洗膜、放射自顯影和結(jié)果分析 按-32P標記DNA探針的斑點雜交方法進行。Diagnosis of Sickle-Cell Anemia四. Northern印跡雜交技術(shù) 原理 Northern印跡雜交的基本原理是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉(zhuǎn)移到尼龍膜等固相膜載體上，用放射性同位素標記的DNA或RNA特異探針對固定于膜上的mRNA進行雜交，洗膜去除非特異性雜交信號，經(jīng)放射自顯影，對雜交信號進行分析。將雜交的mRNA在電泳中的遷移位置與標準分子量進行比較，即可知道細胞中特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小

32、，對雜交信號的強弱比較，可了解該基因表達mRNA的強弱。 以甲醛瓊脂糖變性膠電泳分離RNA，介紹RNANorthern印跡雜交。 材料 （一）器材 同位素探測儀 自動光密度掃描儀 真空核酸轉(zhuǎn)移 紫外照相裝置 X光膠片盒（帶增感屏） （二）試劑及配制 1、5甲醛電泳緩沖液 0.1mol/L3-N-瑪琳（N-morpholincpropane-sulfonicacid，MOPS）（pH7.0） 25mmol/LNaAC 5mmol/LEDTA（pH8.0） 將20.9gMOPS溶于800ml經(jīng)0.1%焦炭酸二乙脂（DEPC）處理的水中，加8.3ml3mol/L乙酸鈉，20ml0.5molEDTA(

33、pH8.0)，用DEPC處理的水定容至1L，0.2m微孔濾膜過濾除菌，避光保存于4。溶液見光變?yōu)樯铧S色不能再用。 2、甲醛凝膠加樣緩沖液 50%甘油 1mmol/LEDTA（pH8.0) 0.25%溴酚藍 0.25%二甲苯青FF 用0.1%DEPC37處理過夜，高壓滅菌，保存于室溫。 3、溴化乙錠溶液 0.5g/ml溴化乙錠 0.1mol/L乙酸銨 方法 （一）甲醛變性電泳分離RNA樣品 1、電泳槽的無RNA酶處理：電泳槽用去污劑洗干凈，蒸餾水沖洗，無水乙醇漂洗干凈，3%H2O2處理10分鐘，最后用DEPC處理過的三蒸水沖洗數(shù)遍。 2、配制1%瓊脂糖變性膠： 5甲醛電泳緩沖液20ml 0.1%

34、DEPC水80ml 瓊脂糖1g 加熱至膠完全溶化后，冷卻至60，加入5.4ml37%甲醛，混勻并置通風櫥內(nèi)，將凝膠傾倒入電泳槽上，于室溫放置30分鐘或更長時間，使凝膠凝固。 3、RNA樣品處理 在Eppendorf管中加入下列試劑： RNA樣品9l 5甲醛電泳緩沖液4l 甲醛7l 甲酰胺20l 總體積40l，混勻后65溫育15分鐘，并迅速置冰浴中至少5分鐘。5000g離心5秒使管內(nèi)所有液體集中于管底。加4l甲醛凝膠加樣緩沖液混合待用。 4、電泳：制備的凝膠先預電泳5分鐘，再將樣品加至凝膠加樣孔中，同時加入已知大小的RNA混合物作為分子量標準參照物，按34V/cm電壓進行電泳。電泳過程中，每隔1

35、2小時，將正負極槽內(nèi)液體混合后繼續(xù)電泳。 5、電泳結(jié)果觀察：電泳結(jié)束后（溴酚藍遷移出約78cm），切下分子量標準參照物的凝膠條，浸入溴化乙錠溶液中染色3045分鐘。在凝膠旁放置一透明尺，在紫外燈下照相，便于以后測量照片上每個RNA條帶至加樣孔的距離。以RNA片段大小的對數(shù)值對RNA條帶的遷移距離作圖，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算雜交后所檢出的RNA分子的大小。 （二）變性RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜 上述經(jīng)甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳分離的RNA樣品，應盡快轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，方法主要有毛細管洗脫法及真空轉(zhuǎn)移法。 1、毛細管洗脫法 （1）凝膠的預處理：將凝膠移至一個干烤過的平皿內(nèi)，將邊緣多余部分用眼科解剖刀切去

36、，在加樣孔一側(cè)切去一角作凝膠方位標記。并用經(jīng)DEPC處理的三蒸水淋洗數(shù)次，除去甲醛。 （2）取一瓷盤，加入20SSC溶液，上置一塊略大于凝膠的玻璃板作為平臺，玻璃板表面鋪一張新華二號濾紙，濾紙的兩邊浸沒在20SSC溶液中，去除玻璃板與濾紙之間的所有氣泡。 （3）把凝膠底向上翻轉(zhuǎn)覆蓋在濾紙上，去除二層之間出現(xiàn)的氣泡。用保鮮膜圍繞在凝膠周邊，但不覆蓋凝膠，作為屏障以阻止液體自池邊直接流至凝膠上方的紙巾中。 （4）裁剪一張尼龍膜，其長與寬大于凝膠11.5cm，并剪下一角做記號以定濾膜方位。先將膜在20SSC中至少潤濕20分鐘，然后放置在凝膠表面上，二層之間不可有氣泡存在。 （5）將兩張與尼龍膜一樣大

37、小經(jīng)20SSC溶液潤濕過的濾紙，覆蓋在尼龍膜上，去除氣泡。（6）把一疊約510cm高同濾紙大小一樣的吸水紙放置在濾紙上，在吸水紙上再放一塊玻璃板和約500g的重物。 （7）上述程序就緒，RNA轉(zhuǎn)移即開始進行，需持續(xù)1824小時。如果吸水紙過于潮濕，應換新的吸水紙。 （8）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的吸水紙和濾紙，取出尼龍膜，不必沖洗、浸泡，轉(zhuǎn)移面朝上置一張濾紙上晾干。將膜夾在兩張濾紙中間，80干烤固定12小時，封入塑料袋中保存待用。 2、真空轉(zhuǎn)移法 （1）凝膠的預處理：具體程序同毛細管洗脫法。 （2）真空轉(zhuǎn)移槽預處理：常規(guī)去污劑清洗，三蒸水漂洗數(shù)次，再用DEPC處理的三蒸水沖洗數(shù)次后備用。 （3

38、）在轉(zhuǎn)移槽的支持網(wǎng)上置放經(jīng)2SSC濕潤過的新華二號濾膜二張，去除支持網(wǎng)與濾膜間的氣泡。 （4）裁剪一張尼龍膜，每邊應比凝膠大11.5cm，于2SSC中浸泡20分鐘，平放在濾紙上，去除所有氣泡。 （5）選取合適大小的真空墊圈（每邊略小于凝膠11.5cm），覆蓋住尼龍膜，調(diào)整尼龍膜的位置，使其處于真空墊圈的中間。 （6）將凝膠放置到真空墊圈上，檢查凝膠四邊，要與墊圈嚴密重疊。排除所有氣泡。 （7）加上上框，固定真空墊圈。打開真空泵，調(diào)整到613kPa的壓力。 （8）小心加入20SSC溶液覆蓋凝膠，持續(xù)轉(zhuǎn)移3小時。 （9）轉(zhuǎn)移結(jié)束，依次移去上框、剩余的20SSC、凝膠及真空墊圈，取出尼龍膜，不要浸泡

39、或沖洗，轉(zhuǎn)移面朝上放在濾紙上晾干。將膜夾在兩層濾紙中間，80干烤固定12小時，封入塑料袋中保存待用。 （三）預雜交、雜交、洗膜和放射自顯影 按-32P標記DNA探針的斑點雜交方法進行。 （四）分析結(jié)果：根據(jù)曝光顯示的條帶，對照RNA分子量標準參照物條帶的遷移距離圖，即可查出凝膠電泳中相應的RNA位置，從而知道基因轉(zhuǎn)錄的RNA的大小。利用自動光密度掃描儀掃描曝光的條帶，計算條帶的積分光密度值，以內(nèi)參照RNA條帶的積分光密度為校正值，可以確定不同樣品基因轉(zhuǎn)錄的表達強度。五.原位雜交 原理 原位雜交（insituhybridization,ISH）是將分子雜交與組織化學相結(jié)合的一項技術(shù),也稱原位雜交

40、組織化學（insituhybridizationhistochemistry，ISSH）。它是利用標記的DNA或RNA為探針，在組織、細胞及染色體上檢測特異的DNA或RNA序列的雜交技術(shù)。其基本原理是含互補順序的標記DNA或RNA片段即探針， 在適宜的條件下與細胞內(nèi)特定的DNA或RNA形成穩(wěn)定的雜交體。根據(jù)所用的探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標記物是否能直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法指用放射性同位素、熒光素或一些酶標記的探針與組織細胞內(nèi)靶核酸所形成的雜交體可分別通過放射自顯影、 熒光顯微術(shù)或顯

41、色的酶促反應等直接檢測。間接法指用半抗原標記探針，而探針與組織細胞內(nèi)靶核酸形成的雜交體則通過免疫組織化學法對半抗原的定位間接地顯示。 本節(jié)主要介紹用-32P標記DNA探針檢測冰凍組織切片中DNA及以地高辛標記DNA探針檢測石蠟包埋組織切片中DNA的原位雜交方法。 試劑 1、0.2mol/LHCL：1.72ml濃HCL，加ddH2O至100ml。 2、0.2%TritonX-1000.1mol/LPBS：1000ml0.1mol/LPBS液中加入TritonX-1002ml，混勻，高壓滅菌。 3、蛋白酶K溶液: 1mol/LTris-HCl（pH8.0）10ml 0.5mol/LEDTA(pH8

42、.0）10ml 加滅菌水至100ml 使用前加入蛋白酶K儲存液（0.5mg/ml，-20保存），使蛋白酶K的終濃度為1g/ml。 4、4%多聚甲醛0.1mol/LPBS(pH7.4)：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500800ml0.1mol/LPBS(pH7.4），加熱至60左右，持續(xù)攪拌使粉末完全溶解，常需滴加少許1mol/LNaOH才能使溶液清亮，再加0.1mol/LPBS至1000ml，充分混勻。 5、預雜交液 50%去離子甲酰胺 2SSC 10%硫酸葡聚糖 5Denhardt溶液 0.5mg/ml變性鮭魚精DNA 6、-32P標記的DNA探針 7、地高辛標記的DNA探針 8

43、、緩沖液： 順丁烯二酸（馬來酸）0.1mol/L NaCL0.15mol/L 用10mol/LNaOH將pH調(diào)至7.5（20），高壓滅菌后備用。 9、緩沖液 先制備阻斷劑儲存液；取試劑盒中阻斷劑按10%（W/V)加入緩沖液，混勻，用微波爐加熱使其完全溶解，高壓消毒后4或-20保存。取上述10%的阻斷劑儲存液用緩沖液按1：10稀釋即制成緩沖液。 10、緩沖液pH9.5（20） Tris-Cl100mmol/L NaCl100mmol/L MgCl250mmol/L 11、緩沖液pH8.0(20) Tris-Cl10mmol/L EDTA1mmol/L 12、底物顯色液 緩沖液15ml+52.5l

44、BCIP+67.5lNBT -32P標記DNA探針的原位雜交 （一）冰凍切片預處理 1.新鮮取材組織置液氮冷凍的異戊烷中。 2.恒冷箱切片（215m），置預處理的玻片上。 3.4%多聚甲醛室溫下固定1560分鐘。 4.PBS洗210分鐘，43烤片過夜。 5.0.2mol/LHCl室溫作用10分鐘，0.1%0.3%TritonX-100作用1530分鐘。 6.0.2%甘氨酸的PBS室溫作用10分鐘。 7.蛋白酶K1g/ml37孵育1530分鐘。 8.0.2%甘氨酸的PBS室溫作用10分鐘。 9.PBS-5mmol/LMgCl2洗210分鐘。 10.逐級酒精脫水，空氣干燥或直接37烤干保存。 （二

45、）預雜交 1、切片用2SSC浸泡15分鐘。再用4SSC配制（V/V）的50%去離子甲酰胺37孵育15分鐘。 2、每張切片加預雜交液20l，雜交溫度下（如42）孵育30分鐘2小時。 （三）雜交 吸棄預雜交液，每張切片加雜交液20l（含0.5ng/l-32P標記DNA探針），加蓋硅化的蓋玻片。玻片放置濕盒中，95100變性10分鐘。取出反應盒，立即入冷水中放置15分鐘，再轉(zhuǎn)入42溫箱中雜交1218小時，不要超過24小時。 （四）洗滌 雜交完畢，于2SSC溶液中輕輕去除蓋玻片。 2SSC洗滌，室溫，12分鐘； 1SSC50%去離子甲酰胺洗滌，37，210分鐘； 0.1SSC洗滌，40，230分鐘。

46、（五）同位素標記探針顯色法 1、暗室中將分裝的核乳膠溶液（約10ml）小瓶置45水浴中浸泡至少1小時，使核乳膠完全熔成液態(tài)。 2、組織切片垂直浸入熔化的核乳膠液中1分鐘，使核乳膠均勻流布在標本上（垂直進入和垂直提出的速度要均勻，提出后拭去背面及下端的核乳膠）。 3、暗室中切片于45電熱板上，干燥12小時。 4、切片裝入暗盒內(nèi)，周圍以膠帶封固，4曝光（3H標記探針28周，35S標記探針14周，32P標記探針710天）。 5、取出切片暗盒，室溫放置至少1小時（勿啟封），使其緩慢回升至室溫。 6、在暗室中（可留安全燈）將切片置入Kodax19顯影液35分鐘，水沖洗片刻后，置KodaxF24定影液中35分鐘（水溫、顯影液及定影液溫度最好為1820）。 7、自來水沖洗載片1520分鐘后，以1%蘇木精染液染510分鐘。 8、鹽酸酒精中提插2下，再用自來水沖洗510分鐘返藍。 9、0.5%1%伊紅染液復染1分鐘；70%、80%、95%、100%系列乙醇脫水；二甲苯透明、樹脂膠封片、光鏡檢查。 （六）觀察結(jié)果 陽性標記物呈黑色顆粒位于藍染的細胞核或紅染的細胞質(zhì)內(nèi)。 地高辛標記DNA探針的原位雜