生物樣品分析方法的基本要求

1、 第四節(jié) 生物樣品分析方法的基本要求 在測(cè)定生物樣品中藥物及其代謝物時(shí)，一般要在測(cè)定前進(jìn)行樣品的前處理，即進(jìn)行分離、純化、濃集。一、常用品種的種類(lèi)、采集和貯藏 生物樣品包括各種體液和組織，常用是血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液。（一）血樣 血漿（plasma)和血清（serum)是最常用的生物樣品。 測(cè)定血中藥物濃度通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細(xì)胞的全血中的藥物濃度。 一般認(rèn)為，當(dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，血漿中藥物濃度與藥物在作用點(diǎn)的濃度緊密相關(guān)，即血漿中的藥物濃度反映了藥物在體內(nèi)（靶器官）的狀況，因而血漿濃度可作為作用部位藥物濃度的可靠指標(biāo)。 1.取樣： 供測(cè)定的

2、血樣應(yīng)能代表整個(gè)血藥濃度，因而應(yīng)待藥物在血液中分布均勻后取樣。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可直接從動(dòng)脈或心臟取血。 對(duì)于病人，通常采取靜脈血，有時(shí)根據(jù)血藥濃度和分析方法靈敏度。也可用毛細(xì)管采血。 2.制備： 血漿的制備 將采取的血液置含有抗凝劑（如：肝素、草酸鹽等）的試管中，混合后，離心，分離血細(xì)胞，上清液即為血漿。 肝素是一種含硫酸鹽的粘多糖，常用其鈉鹽、鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白。一般lml的全血需加0.10.2mg的肝素，加入血樣后立即輕輕旋搖，但勿太猛烈，以免導(dǎo)致血細(xì)胞破裂。 血清的制備 血清是由血液中纖維蛋白原等影響下，引起血液凝結(jié)而析出的澄清黃色液體，經(jīng)離

3、心其量約為全血量的30一50。在室溫高時(shí)，血凝過(guò)程進(jìn)行得很快，宜在血凝后半小時(shí)內(nèi)分離血清。當(dāng)室溫低時(shí)，血凝過(guò)程較慢，可將血液置37溫度下加速血清析出。 血漿及血清中的藥物濃度測(cè)定值通常是相同的。 全血也應(yīng)加入抗凝劑混勻，防止凝血。對(duì)大多數(shù)藥物來(lái)說(shuō)血漿濃度與紅細(xì)胞中的濃度成正比，所以測(cè)定全血也不能提供更多的數(shù)據(jù)。由于全血的凈化較血漿和血清麻煩，特別是溶血后，血色素等可能會(huì)給測(cè)定帶來(lái)影響。3.特點(diǎn)： 血樣的采取量受到限制、間隔時(shí)間，采集方法：一般取1ml2m1。用注射器、毛細(xì)管或微量采血管采取。血樣的采血時(shí)間間隔應(yīng)隨測(cè)定目的的不同而異。 采取血樣后，應(yīng)及時(shí)分離血漿或血清，并立即進(jìn)行分析。如不能立即

4、測(cè)定時(shí)，應(yīng)完全密塞后保存，短期冷藏（4），長(zhǎng)期冷凍（-20）保存。（二）唾液 唾液的采集應(yīng)盡可能在刺激少的安靜狀態(tài)下進(jìn)行。一般在漱口后15min收集。 采集后立即測(cè)量其除去泡沫部分的體積。放置后分為泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三層。分層后離心分離，取上清液作為藥物濃度測(cè)定的樣品。 可集中、單一部位采集。 唾液中含有粘蛋白，為阻止粘蛋白的生成，應(yīng)將唾液在4以下保存，解凍后攪勻后再用，否則會(huì)產(chǎn)生誤差。 優(yōu)點(diǎn)：可以不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制，很容易地反復(fù)采集，采集時(shí)無(wú)痛苦無(wú)危險(xiǎn)；有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物濃度。缺點(diǎn)： 唾液是各腺體分泌的的混合液體，其組成發(fā)生經(jīng)時(shí)變動(dòng)；因此，唾液中的

5、藥物濃度與血漿中的游離型藥物濃度相比就容易變動(dòng)； 唾液中藥物濃度與血漿中藥物濃度的比值(S/P)只有少數(shù)藥物是恒定值； 有些與蛋白結(jié)合率較高的藥物，藥物在唾液中的濃度比血漿濃度低得多，需要高靈敏度的分析方法才能檢測(cè)； 對(duì)有些患者（如癲痛二昏迷）不能采集唾液樣品。（三）尿液 尿藥測(cè)定主要用于藥物劑量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究。 體內(nèi)藥物清除主要是通過(guò)尿液排出，藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物（conjugates）等形式排出。 尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及鹽類(lèi)。 尿液中藥物濃度較高，收集量可以很大，也方便，但尿液濃度通常變化較大，應(yīng)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)排入尿中

6、藥物的總量，這就需要測(cè)定在規(guī)定時(shí)間內(nèi)的尿液體積及尿藥濃度，時(shí)間尿以外的尿不可能推斷全尿中藥物的排泄?jié)舛群退幬锟偭俊?測(cè)定尿中藥物的總量時(shí)，將一定時(shí)間內(nèi)（如8h;12h或24h等）排泄的尿液全部?jī)?chǔ)存起來(lái)，并記錄其體積，取其一部分測(cè)定藥物濃度，然后乘以尿量求得排泄總量。采集的尿液時(shí)，需用量筒準(zhǔn)確地測(cè)量?jī)?chǔ)尿量，并做好記錄。 缺點(diǎn)：尿液中藥物濃度與血藥濃度相關(guān)性差；受試者的腎功能正常與否直接影響藥物排泄，因而腎功能不良者不宜采集尿樣；嬰兒的排尿時(shí)間難于掌握；尿液不易采集完全并不易保存。 采集的尿樣應(yīng)立即側(cè)定。若收集24h的尿液不能立即測(cè)定時(shí)，應(yīng)加入防腐劑置冰箱中保存。常用防腐劑有：甲苯等，短時(shí)冷藏；長(zhǎng)

7、時(shí)冷凍。二 生物樣品分析其前處理技術(shù) 主要應(yīng)考慮生物樣品的種類(lèi)，被測(cè)定藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面的問(wèn)題。 樣品的分離、純化技術(shù)應(yīng)該依據(jù)生物樣品的類(lèi)型。例如，血漿或血清需除蛋白，使藥物從蛋白結(jié)合物中釋出；唾液樣品則主要采用離心沉淀除去粘蛋白；尿液樣品常采用酸或酶水解使藥物從綴合物中釋出。 根據(jù)被測(cè)定藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及藥理性質(zhì)、存在形式、濃度范圍等，采取相應(yīng)的前處理方法。 87頁(yè)圖4-4大致反映了檢測(cè)方法與樣品前處理要求的相互關(guān)系。（一）去除蛋白質(zhì)目的： 可使結(jié)合型的藥物釋放出來(lái)，以便測(cè)定藥物的總濃度； 去除蛋白質(zhì)也可預(yù)防提取過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)泡，減少乳化的形成，以及可以保護(hù)儀器性能，延長(zhǎng)使用期

8、限。去除蛋白質(zhì)方法： 1.加入與水相混溶的有機(jī)溶劑 加入水溶性的有機(jī)溶劑，可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物釋放出來(lái)。常用的水溶性有機(jī)溶劑有：乙睛、甲醇等。含藥物的血漿或血清與水溶性有機(jī)溶劑的體積比為1:（1-3)時(shí)，就可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去，采用超速離心機(jī)（10000r/min )離心便可將析出的蛋白質(zhì)完全沉淀。 2.加入中性鹽 使溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化。中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。 常用的中性鹽：飽和硫酸胺等。鹽析的方法與有機(jī)溶劑提取法常并用，藥物的回收率高。 3.加入強(qiáng)酸 當(dāng)pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以

9、陽(yáng)離子形式存在，加入強(qiáng)酸，可與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子形成不溶性鹽而沉淀。常用的強(qiáng)酸有：10%三氯醋酸等。含藥物血清與強(qiáng)酸的比例為1:0.6混合，高速離心,就可除去蛋白質(zhì)，取上清液作為樣品。在酸性下分解的藥物不宜用本法除蛋白。 4.加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑當(dāng)pH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，金屬陽(yáng)離子與蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基形成不溶性鹽而沉淀。常用的沉淀劑有：CUS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含藥物血清與沉淀劑的比例為1:2混合，高速離心、分離后得上清液。5.酶解法 在測(cè)定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物時(shí)，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。（二）綴合物的水解 尿中藥物多數(shù)呈

10、綴合狀態(tài)。 含羥基、羧基、氨基和巰基的藥物。可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷綴合物； 含酚羥基、芳胺及醇類(lèi)藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸形成硫酸酯綴合物。 由于綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機(jī)溶劑提取，常用酸水解或酶水解的方法。 酸水解時(shí)，可加入適量的鹽酸液。 對(duì)于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶一硫酸酯酶的混合酶。（三）分離、純化與濃集 1.液液提取法（liquid-liquid extraction; LLE)多數(shù)藥物是親脂性的，在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血樣或尿樣中含有的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物

11、質(zhì)。因而用有機(jī)溶劑提取一次即可除去大部分雜質(zhì)。 應(yīng)用本法時(shí)要考慮所選有機(jī)溶劑的特性、有機(jī)溶劑相和水相的體積及水相的pH值等。 對(duì)所選用的有機(jī)溶劑，要求對(duì)被測(cè)組分的溶解度大：沸點(diǎn)低，易于濃集、揮散；與水不相混溶以及無(wú)毒、化學(xué)穩(wěn)定、不易乳化等。最常用的溶劑是乙醚和氯仿等。 提取時(shí)所用的有機(jī)溶劑要適量。一般有機(jī)相與水相（體液樣品）容積比為1：1或2:1。 生物樣品一般多在堿性下提取，多數(shù)藥物是親脂性的堿性物質(zhì)，生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)多是酸性的。 當(dāng)堿性藥物在堿性pH不穩(wěn)定時(shí)，則在近中性pH處用氯仿和異丙醇提取。 提取時(shí)于水相（體液樣品）中加入有機(jī)溶劑后，一般只提取一次。如有必要還須將第一次提取分離出

12、的含藥物有機(jī)相再用一定pH的水溶液反提取（back extraction），然后再?gòu)乃鄬⑺幬锾崛〉接袡C(jī)相。 液-液提取法的優(yōu)點(diǎn)在于它的選擇性，這是依賴(lài)于有機(jī)溶劑的選擇。極性大的藥物使用離子對(duì)試劑（ion pair reagent）的離子對(duì)提取法（ion pair extraction method）。2.液-固提取法（liquid-solid extraction，LSE）也為一種柱色譜法。將具有吸附、分配及離子交換性質(zhì)的、表面積大的擔(dān)體作為萃取劑填入小柱，以溶劑淋洗后，將生物樣品通過(guò)，使其藥物或雜質(zhì)保留在擔(dān)體上，用適當(dāng)溶劑洗去雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑將藥物洗脫下來(lái)。 LSE具有優(yōu)點(diǎn)：LSE較少引

13、入雜質(zhì)；消除了LLE的主要缺陷乳化現(xiàn)象；提取效率高，可用少量生物樣品進(jìn)行分析；柱為可棄型，廢棄物易從實(shí)驗(yàn)室移走；在最后洗脫中多數(shù)采用以水為主的溶劑系統(tǒng)，大大增加了安全性；最大的優(yōu)點(diǎn)為處理樣品速度快，并在室溫下操作，尤其適于處理?yè)]發(fā)性及對(duì)熱不穩(wěn)定的藥物。常用于填充柱的擔(dān)體大致分為兩類(lèi)： 1.親水性的硅藻土，有機(jī)溶劑沖洗藥物 2.疏水活性炭、聚苯乙烯或C18化學(xué)鍵合硅膠，吸附親酯性藥物，然后用有機(jī)溶劑分離藥物。3.被測(cè)組分的濃集的方法： 末次提取時(shí)加入的提取液盡量少，然后直接測(cè)定。 氮?dú)饬鞔蹈?減壓法揮去溶劑（四）化學(xué)衍生化 分離前將藥物進(jìn)行化學(xué)衍生化的目的是：使藥物變成具有能被分離的性質(zhì)提高檢測(cè)

14、的靈敏度增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性；提高對(duì)光學(xué)異構(gòu)體分離的能力等。 藥物分子中含有活潑H者均可被化學(xué)衍生化，如含一COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能團(tuán)的藥物都可被衍生化。 1.GC中化學(xué)衍生化法 藥物的化學(xué)衍生化前處理對(duì)GC十分必要，衍生化可使藥物分子中的極性基團(tuán)，如羥基、氨基、羧基等變成無(wú)極性的、易于揮發(fā)的藥物，從而使GC溫度不必很高即可適合GC分析要求，主要的衍生化反應(yīng)有烷基化（alkylations）、?；╝cylations）、硅烷化（silylations）等。其中以硅烷化用得最廣泛。 常用的烷基化試劑：碘庚烷、疊氮甲烷、氫氧化三甲基苯胺（TMAH）等； 常用的?；噭阂宜?/p>

15、酐、丙酸酐等； 硅烷化試劑：三甲基氯硅烷（咖CS）、雙-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、雙-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（IMTS）等。 具有光學(xué)異構(gòu)體藥物的分離也可采用不對(duì)稱(chēng)試劑，使其生成非對(duì)映異構(gòu)體衍生物，然后用GC法或HPLC法進(jìn)行分析測(cè)定。常用的不對(duì)稱(chēng)試劑有：（S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。2. HPLC中化學(xué)衍生化法 衍生化的目的是為了提高藥物檢測(cè)靈敏度。 化學(xué)衍生化包括柱前衍生化和柱后衍生化兩種方法。 柱前衍生化分析前盡可能將藥物進(jìn)行精制后再衍生化。 柱后衍生化是藥物經(jīng)色譜柱分離之后進(jìn)行的，所以可形成對(duì)檢測(cè)器具有高靈敏度的衍生物，從而

16、提高了選擇性。HPLC法常用的衍生化試劑有鄰苯二醛、丹酰氯、熒胺等。三、生物樣品定量分析方法驗(yàn)證（一）特異性 證明所測(cè)定的物質(zhì)是原形藥物或特定的活性代謝物（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 回歸方程相關(guān)系數(shù)r0.9900。在線性范圍內(nèi)濃度測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度。（三）精密度與準(zhǔn)確度（三）精密度與準(zhǔn)確度 藥典附錄藥典附錄藥物制劑人體生物利藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則規(guī)規(guī)定考察定考察3 3個(gè)濃度的精密度和準(zhǔn)確度。個(gè)濃度的精密度和準(zhǔn)確度。 一般一般RSDRSD應(yīng)小于應(yīng)小于15%15%，在，在LOQLOQ附近附近RSDRSD應(yīng)小于應(yīng)小于20%20%。 批內(nèi)精密度：是同一次測(cè)定的批內(nèi)精密度：是同一次測(cè)定的精密度。所得精密度。所得RSD應(yīng)爭(zhēng)取達(dá)到應(yīng)爭(zhēng)取達(dá)到5以?xún)?nèi)，但不能超以?xún)?nèi)，但不能超10。 批間精密度：是不同次測(cè)定的批間精密度：是不同次測(cè)定的精密度。所得精密度。所得RSD應(yīng)控制在應(yīng)控制在15以以?xún)?nèi)。內(nèi)。 回收率一般應(yīng)在回收率一般應(yīng)在85%115%范圍內(nèi)，在范圍內(nèi)，在LOD附近應(yīng)在附近應(yīng)在80%一一120范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。（四）最低定量限 最低定量限LOQ至少能滿足測(cè)定3 -5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度或Cmax的1/10一1/20時(shí)的藥物濃度。（五）樣品穩(wěn)定性 在室溫、