黃酮提取工藝設(shè)計(jì)思路

1、黃酮提取工藝設(shè)計(jì)思路1、黃酮類(lèi)化合物含量測(cè)定的原理在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下，黃酮類(lèi)化合物與鋁鹽生成螯合物，加入氫氧化鈉溶液后顯紅橙色。黃酮類(lèi)化合物能與金屬離子絡(luò)合產(chǎn)生有色反應(yīng)，于波長(zhǎng)510nm附近有吸收，可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)采用在堿性條件下，亞硝酸鹽存在時(shí)，硝酸鋁與黃酮形成紅色絡(luò)合物，在波長(zhǎng)510nm附近有吸收可進(jìn)行比色分析。在中性或弱堿性及硝酸鈉存在條件下，黃酮類(lèi)化合物與鋁鹽生成鰲合物，加入氫氧化鈉溶液后顯紅橙色，硝酸鈉還原黃酮，加硝酸鋁絡(luò)合，加氫氧化鈉使黃酮類(lèi)化合物開(kāi)環(huán)，生成2-OH查耳酮而顯色。利用黃酮類(lèi)化合物中的3羥基、4羥基、5羥基、4羰基或鄰二位酚羥基，與Al3進(jìn)

2、行絡(luò)合反應(yīng)，在堿性條件下生成紅色絡(luò)合物的原理測(cè)定其含量2、測(cè)定波長(zhǎng)的確定取樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL，加70 %的乙醇至5 mL, 然后加入5 %的NaNO2 溶液1 mL, 室溫放置6min, 再加入10 %的Al(NO3)3 1mL, 混勻, 室溫放置6 min, 加入4%的NaOH 10mL, 用水稀釋至25 mL,混勻, 放置15 min, 在分光光度計(jì)上掃描波長(zhǎng)從400 nm600 nm 之間的吸收度, 結(jié)果在510nm 波長(zhǎng)處有最大吸收值。配合物在Kmax1= 354nm 及Kmax2= 510nm有兩個(gè)吸收峰, 經(jīng)實(shí)驗(yàn)后得出Kmax1= 354nm波長(zhǎng)處得到的工作曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系及精密

3、度數(shù)據(jù)均不佳, 故本實(shí)驗(yàn)選取Kmax2= 510 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。3、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱(chēng)取105干燥恒重蘆丁對(duì)照品50mg, 加乙醇適量, 使之充分溶解, 用乙醇定容到100mL, 搖勻, 制得蘆丁溶液。精確量取蘆丁溶液20mL, 置于50mL容量瓶中, 用水稀釋至刻度, 搖勻, 即得對(duì)照品溶液。每1mL溶液含蘆丁對(duì)照品0.2mg。或精密稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg, 置50mL容量瓶中, 加無(wú)水乙醇20mL, 輕搖使充分溶解,定容, 搖勻, 得0. 2mg /mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。精確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5mg，用70%乙醇溶解，于50 mL容量瓶中定容，即得每1mL溶液含蘆丁對(duì)照品0.1mg蘆

4、丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。稱(chēng)取約20mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于稱(chēng)量瓶中置105烘箱下烘干至恒重,干燥器中冷卻，精確稱(chēng)取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇定容至100 ml為標(biāo)準(zhǔn)液。4、樣品溶液的測(cè)定方法4.1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制精確量取對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL, 分別置于25mL容量瓶中。分別加水至6mL, 加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL, 混勻, 放置6min; 加10%硝酸鋁溶液1.0mL, 搖勻, 放置6min; 加1% 氫氧化鈉溶液10.0mL, 再加水至刻度, 搖勻, 放置15min。用分光光度法在510nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo), 濃度為橫坐標(biāo),

5、用最小二乘法對(duì)直線(xiàn)進(jìn)行回歸計(jì)算，令回歸方程為：y=ax+b，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 得回歸線(xiàn)方程: Y = 11. 321 43X + 0. 00343( r= 0.9998), 在840g/mL的范圍內(nèi)，濃度與吸收度有良好的線(xiàn)性關(guān)系。分別取0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL的0. 1mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支比色管中，分別加入0. 3 mL 5%亞硝酸鈉，放置6 min，加0. 3 mL 10%硝酸鋁后放置6 min,，再加1. 0mol/L NaOH 4.0mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，放置12min得測(cè)定液。以空白溶液作參比,在= 510nm處測(cè)吸光度

6、,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液濃度(C)與吸光度(D)的回歸方程D = bC + k。精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 ml分別置于6支具塞試管中，各補(bǔ)70%乙醇至5. 0ml，加5%亞硝酸鈉溶液0. 3 ml,，搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁溶液0. 3ml,搖勻，放置6 min后，再加4%氫氧化鈉溶液4. 0ml，加水0. 4ml，搖勻，放置15 min后，在510 nm處測(cè)吸光度-濃度值，所得吸光度-濃度曲線(xiàn)見(jiàn)圖，回歸方程如下: A =12. 721 0C - 0. 02903，相關(guān)系數(shù)r = 0. 9998。4.2、樣品處理取采回的新鮮蘆蒿葉，洗凈，參考相關(guān)

7、文獻(xiàn)，在105烘至約八成干,剪成約1 cm長(zhǎng)度，用粉碎機(jī)粉碎，再在105烘至恒重。采用Soxhlet提取法，以無(wú)水乙醚為脫脂劑,于43水浴中脫脂至充分除去樣品中脂類(lèi)和脂溶性色素。取出樣品濾紙包，先置通風(fēng)處晾干，再將濾紙包置烘箱中130 烘干，放入干燥器中冷卻備用。4.3、樣品處理方法濕熱法：將鮮葉置于高壓反應(yīng)釜加壓蒸30min，另取鮮葉常壓蒸30min。將陰干葉置于高壓反應(yīng)釜加壓蒸15min，另取陰干葉常壓蒸15min。氧化法：（1）H2O2法：將鮮葉、陰干葉分別用用2倍量H2O2浸泡10min（H2O2濃度1%、溫度50）、10min（2%、40）、30min（0.5%、30）、30min（

8、2%、50）、60min（0.5%、40）、60min（1%、30）。（2）KMnO4法：將鮮葉、陰干葉分別用用2倍量KMnO4浸泡10min（KMnO4濃度1%、溫度50）、10min（2%、40）、30min（0.5%、30）、30min（2%、50）、60min（0.5%、40）、60min（1%、30）。4.3、樣品溶液的測(cè)定、分光光度法精確量取樣品溶液5. 0 mL, 置于25 mL容量瓶中, 按照2.1中方法進(jìn)行操作, 在510nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1; 再精確量取樣品溶液5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 加水至刻度, 搖勻, 在510nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A2。取2次吸光度

9、的差值, 由回歸線(xiàn)方程計(jì)算樣品中黃酮類(lèi)化合物的提取率。、HPLC 法取上述樣品總黃酮提取液濃縮物，用甲醇溶解，進(jìn)樣前用0.45 m 濾膜過(guò)濾。高效液相色譜儀：LC- 9A(日本SHMADZU) ；色譜柱：Dima Technologies(C18 迪馬公司)，規(guī)格：250 mm×4.6 mm；柱溫為室溫；流速1 mL/min；檢測(cè)器：SPD-10A；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 L；流動(dòng)相：80%甲醇。在進(jìn)柱之前，流動(dòng)相要經(jīng)過(guò)0.45m 的有機(jī)膜過(guò)濾，并超聲脫氣30 min。5、溶劑選擇分別稱(chēng)取樣品1g，以提取溫度90，提取時(shí)間2 h ，分別利用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、

10、石油醚為溶劑，料液比1:50(g/mL)為提取條件進(jìn)行常壓回流提取，以此結(jié)果進(jìn)行比較。6、線(xiàn)性范圍、回歸方程和檢出限總黃酮的線(xiàn)性范圍在1.040g/ml 之間，所得回歸方程為y=0.0033x0.0109，相關(guān)系數(shù)為0.9995，檢出限為1.0g/ml。7、顯色劑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品提取液1.0mL, 同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣品測(cè)定的操作，分別于配制后每隔5min測(cè)定其吸光度考察反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示其RSD值為0. 5097% , 說(shuō)明樣品溶液在1h內(nèi)穩(wěn)定。8、加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)取已測(cè)得黃酮類(lèi)化合物提取率的樣品溶液2.0mL, 加入0.2mg/mL的蘆丁對(duì)照液1. 0mL, 按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定

11、, 計(jì)算回收率。加樣回收率為99. 12%, RSD 值為2. 135%。表明, 該方法對(duì)黃花菜中黃酮類(lèi)化合物提取率測(cè)量的準(zhǔn)確度較高?；厥章? (混合后測(cè)得的總黃酮含量-樣品中總黃酮含量)/蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100%。分別取0.2g含總黃酮的樣品于兩支15ml具塞比色管中，各加入4ml乙醇，其中1管加入0.100mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為加標(biāo)測(cè)定管，另1管作為本底管，再按最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行樣品處理，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法進(jìn)行計(jì)算，重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算回收率。由表8可知，該方法的回收率為95%104%，證明該方法的準(zhǔn)確度較好。取5個(gè)10mL比色管，在已知黃酮含量的蓖麻葉和蓖麻花提取液中分別加入0.2mg/m

12、L蘆丁對(duì)照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL樣液，分別測(cè)定黃酮含量，根據(jù)所得的總黃酮含量減去加入的標(biāo)量，再除以樣品所含的總黃酮量即可計(jì)算出回收率?；厥章?= 樣品加標(biāo)準(zhǔn)樣測(cè)得總黃酮含量樣品中總黃酮含量/加入標(biāo)準(zhǔn)液總蘆丁的含量×100%序號(hào)樣品測(cè)定值（mg/ml）加標(biāo)量/mg加標(biāo)后測(cè)定值mg /ml回收率/%平均回收率/%RSD/%10.200020.200030.200040.200050.20009、精密度實(shí)驗(yàn)取5份同一樣品溶液各5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，計(jì)算其平均含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。其RSD 值平均為0.162%

13、, 測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差很小, 說(shuō)明儀器的精密度較高, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。在正交試驗(yàn)得出的最佳條件下，樣品用超聲波提取后測(cè)定總黃酮提取量，重復(fù)試驗(yàn)5 次，計(jì)算保健食品總黃酮提取量為（5.370±0.092）mg，RSD 為1.717%，證明該方法的精密度較好。按微波提取法同時(shí)制備5份試樣液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法對(duì)試樣液中總黃酮含量進(jìn)行平行測(cè)定。 精密稱(chēng)取車(chē)前草供試品3份，每份測(cè)試3次,結(jié)果見(jiàn)表2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3. 20 %(m =3)。精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1mL，共5 份，分別置于10mL試管中，按.2 節(jié)操作，計(jì)算吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。10、重現(xiàn)性試驗(yàn)。取同一批大白口蘑樣品6份，

14、在最佳條件下進(jìn)行萃取，分別測(cè)定各自的總黃酮含量，結(jié)果表明，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%。在同一實(shí)驗(yàn)室、不同時(shí)間對(duì)樣品葉中總黃酮含量進(jìn)行5次重復(fù)測(cè)定。11、金屬離子的干擾實(shí)驗(yàn)銀杏葉提取物作為生物活性物質(zhì), 許多金屬離子對(duì)它的測(cè)定都有一定影響。本實(shí)驗(yàn)選取常見(jiàn)的Zn2+ 、Fe3+ 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明Zn2+ 對(duì)反應(yīng)無(wú)影響, 加入1 mL 100Lgöm L Fe3+ 溶液, 掃描發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)510 nm 無(wú)吸收峰, 由此可知Fe3+ 對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定影響很大。本實(shí)驗(yàn)選擇EDTA做掩蔽劑。12、黃酮類(lèi)化合物的定性檢測(cè)12.1、三氯化鋁反應(yīng)取8支試管，分別加入少許經(jīng)上述各提取方法所得的樣品，用95%乙

15、醇完全溶解，每只試管中再加1%三氯化鋁乙醇溶液12 mL，觀察顏色變化情況。在三氯化鋁反應(yīng)中，原來(lái)的黃色加深，并有黃色或黃綠色熒光，原因是與鋁離子產(chǎn)生了螯合物而呈現(xiàn)出鮮黃色。濾紙上無(wú)明顯顏色變化，紫外燈下顯鮮黃色熒光，可能不含4-羥基黃酮醇和7，4-二羥基黃酮醇等黃酮類(lèi)化合物。黃色或黃綠色：有黃酮類(lèi)化合物。12.2、鹽酸-鎂粉還原反應(yīng)將經(jīng)上述各提取方法所得的樣品分別溶于盛有95%乙醇的試管中，待完全溶解后加少許鎂粉，再加數(shù)滴濃鹽酸,觀察顏色變化情況。在鹽酸- 鎂粉還原反應(yīng)中,溶液呈現(xiàn)出橙黃色或紫紅色,這是由于黃酮類(lèi)化合物被還原生成花色苷元及其二聚物。試液呈現(xiàn)紅色，可能含黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、

16、二氫黃酮醇等黃酮類(lèi)化合物。取樣品液5mL，加入少許鎂粉振搖，滴加數(shù)滴濃鹽酸，微熱2min。并作空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)（在樣品液中僅加入濃鹽酸進(jìn)行觀察）?？捎^察到在用粗提取液進(jìn)行預(yù)試時(shí)，加入濃鹽酸后升起的泡沫顏色呈紫紅色，溶液顯橙紅色，表明樣品液中有黃酮類(lèi)物質(zhì)存在。橙紅色：黃酮類(lèi)化合物。取自制的黃酮樣品少許置于試管中，加5%vol的乙醇2mL，在水浴中加熱溶解，滴加2滴濃HC1，再加鎂粉約50mg，即產(chǎn)生劇烈的反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中溶液顏色逐漸由黃色變?yōu)槌燃t色。此現(xiàn)象表明被測(cè)物為黃酮類(lèi)物質(zhì)。12.3、四氫硼鈉反應(yīng)取8支試管，分別加入少許經(jīng)上述各種方法提取所得到的樣品，用95%乙醇完全溶解后加數(shù)滴四氫硼鈉，觀察顏

17、色變化情況。在四氫硼鈉反應(yīng)中，溶液由淺黃色變?yōu)榧t色或紫紅色，此反應(yīng)是二氫黃酮類(lèi)化合物的專(zhuān)屬反應(yīng)。12.4、與堿反應(yīng)試液變黃色，可能含二氫黃酮、黃酮醇等黃酮類(lèi)化合物。棕黃色，空氣氧化變褐色：有黃酮醇類(lèi)或查耳酮。4%氫氧化鈉反應(yīng)，棕色，有黃酮類(lèi)化合物。12.5、鋁鹽反應(yīng)取樣品提取液5 mL，加入0.3mL 5% NaNO2，充分混勻，混勻后靜置5min，加入0.3mL 10% Al(NO3)3，混勻后靜置6min，加入2mL1 mol/L NaOH，混勻，靜止10min?？捎^察到有磚紅色的顏色產(chǎn)生，表明提取液中有黃酮類(lèi)物質(zhì)。黃色：有黃酮類(lèi)化合物。12.6、濃氨水反應(yīng)提取物乙醇溶液點(diǎn)在濾紙上,置于濃

18、氨水上方30 s, 紫外燈下觀察, 顯黃色熒光斑點(diǎn)。棕黃色，有黃酮類(lèi)化合物。12.7、1%三氯化鐵反應(yīng)藍(lán)色：黃酮類(lèi)化合物。12.8、1%醋酸鉛反應(yīng)黃色沉淀：黃酮類(lèi)化合物。12.9、濃硫酸反應(yīng)橙色：黃酮類(lèi)化合物。12.10、熔點(diǎn)測(cè)定取提取的蓮子心黃酮樣品，經(jīng)多次重結(jié)晶提純，測(cè)其熔點(diǎn)230230.5。12.11、紅外光譜圖的比較取精制的黃酮樣品和黃酮（蘆?。?duì)照品，溴化鉀壓片法繪制紅外光譜圖。測(cè)試條件：掃描范圍4000cm-1400cm-1；分辨率4cm-1，掃描次數(shù)3213、總黃酮提取量即得率和提取率計(jì)算13.1、總黃酮提取量即得率計(jì)算Y C×V1×（V2/V3）/m式中，Y

19、 為黃酮含量（mg/g），C為測(cè)定液黃酮濃度（mg/mL），V1為測(cè)量時(shí)定容的體積（mL），V2為提取液體積（mL），V3為測(cè)量時(shí)取液體積（mL），m 為提取時(shí)原料質(zhì)量（g）?？傸S酮得率X（%）n×C×V/m×100%式中：n為提取液稀釋倍數(shù)；C為提取液中總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為果渣的重量，mg；X總黃酮得率。P =C ×V ×n/W ×V1 ×103 ×100式中:P總黃酮類(lèi)物質(zhì)含量, g/100 g;C從回歸方程計(jì)算得樣品中黃酮類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量, mg;n稀釋倍數(shù);V 濃縮液的體積, mL;

20、V1 測(cè)定體積, mL;W投料量, g。13.2、總黃酮提取率計(jì)算提取率= 提取的總黃酮質(zhì)量/原料質(zhì)量×原料中總黃酮含量 ×100%14、單因素試驗(yàn)14.1、乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響取樣品1g 左右，分別加入0%、10%、20%、30%、40%、50%60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，在100條件下快速萃取法提取5min，測(cè)定提取液黃酮含量，并計(jì)算得率。14.2、不同提取溫度取樣品1g，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，分別20、30、40、50、60、70、80、90、100于用快速萃取法提取5min，測(cè)定提取液黃酮含量，并計(jì)算得率。14.3、不同提取時(shí)間取樣品1g，乙醇體

21、積分?jǐn)?shù)60%，在100分別快速萃取30min、60min、90min、120min、150min、180min，測(cè)定提取液黃酮含量，并計(jì)算得率。14.4、不同粒度取樣品1g，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，分別于20目、40目、60目、80目、100目、120目用快速萃取法提取5min，測(cè)定提取液黃酮含量，并計(jì)算得率。14.5、提取次數(shù)取樣品1g，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在100快速萃取1 0mi n ，分別萃取1 、2 、3 、4 、5次，測(cè)定提取液黃酮含量，并計(jì)算得率。14.6、料液比取樣品1g，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，分別于1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80用快速

22、萃取法提取5min，測(cè)定提取液黃酮含量，并計(jì)算得率。15、超聲波提取總黃酮15.1、乙醇溶液濃度對(duì)總黃酮提取的影響15.2、超聲溫度對(duì)總黃酮提取的影響15.3、超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響15.4、料液比對(duì)總黃酮提取的影響15.5、提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取的影響15.6、目數(shù)對(duì)總黃酮提取的影響15.7、間隙/ 超聲時(shí)間的選擇15.8、浸泡時(shí)間選擇16、微波提取總黃酮16.1、乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響16.2、液固比對(duì)黃酮提取率的影響16.3、微波功率對(duì)黃酮提取率的影響16.4、微波輔助提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響16.5、0103%的非離子表面活性劑B對(duì)黃酮提取率的影響（椰油酰胺甜菜堿(CAB)，十

23、二烷基硫酸鈉( K12 ) ，十六烷基三甲氯(溴)化銨(1631)，椰油?；掖及?6501)，三乙醇胺，椰子油醇醚羧酸鈉(CES)， 椰油酰胺丙基甜菜(CAB - 35)，十二烷基苯磺酸鈉(LAS)，十二烷基硫酸銨(K12A) 、吐溫80( Tween 80)、十二烷基三甲基氯化銨( DTAC)）16.6、提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取量的影響17、超高壓提取總黃酮17.1、乙醇濃度17.2、壓力17.3、料液比17.4、處理時(shí)間17.5、提取次數(shù)18、驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)篩選得到的最佳提取條件A3B2C3D2，平行提取3次，計(jì)算總黃酮的提取率。結(jié)果見(jiàn)表4。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，根據(jù)最佳的提取條件所得的總黃酮的提取率

24、均大于正交設(shè)計(jì)中總黃酮的提取率，因此本最佳工藝條件合理，同時(shí)也表明此工藝具有較好的穩(wěn)定性。19、粗總黃酮的純化19.1、樹(shù)脂預(yù)處理用40目篩在水中篩選出大小合適、分布均勻的樹(shù)脂,將新的D101/AB-8大孔吸附樹(shù)脂用2 倍體積的95%乙醇浸泡24h, 并不時(shí)攪動(dòng), 使樹(shù)脂充分溶脹。將樹(shù)脂置于玻璃色譜柱( 30mm×500mm) 中, 用95%乙醇淋洗, 檢測(cè)流出液, 直至淋洗后流出液與水混合( 15) 后不再出現(xiàn)白色混濁, 用大量重蒸餾水洗去乙醇至無(wú)醇味，用4倍體積5%的HCl溶液浸泡3-4h，用去離子水洗至中性，再加入大約4倍體積的5%的NaOH溶液浸泡3-4h，再用純化水洗至中性

25、，備用。19.2、樹(shù)脂的吸附和解吸: 將已預(yù)處理的D101 大孔吸附樹(shù)脂裝入柱中, 將按最佳工藝提取的黃酮粗提液回收乙醇, 調(diào)至濃度為0.5 mg / mL上柱, 以0.5 mL/min流速吸附后用3倍柱床體積純化水洗至流出液無(wú)色, 再用4倍量70%的乙醇解吸, 得解吸液。19.3、產(chǎn)品的處理解吸液真空干燥至恒重, 稱(chēng)定質(zhì)量。按方法測(cè)定吸光度, 根據(jù)回歸方程計(jì)算解吸液中總黃酮含量。按下式計(jì)算黃酮的純度: 黃酮的純度(%) = W/ W0×100%。式中, W 為解吸液中黃酮的含量( g) ,W0為解吸液干燥后的質(zhì)量( g) 。大孔吸附樹(shù)脂對(duì)臘梅花總黃酮的吸附率的測(cè)定：稱(chēng)取預(yù)處理好的樹(shù)

26、脂2.0g于具塞磨口三角瓶中，準(zhǔn)確加入臘梅花黃酮類(lèi)水溶液30ml, 在室溫下置于振蕩器上振蕩24h，充分吸附后，測(cè)定濾液中剩余黃酮的濃度，按照下式計(jì)算吸附率：吸附率(%) = ( C1- C2 ) / C1×100式中, C1為吸附前濃度(mg/L) ; C2為吸附后剩余液的濃度(mg/L)。大孔吸附樹(shù)脂對(duì)臘梅花總黃酮的脫附率的測(cè)定：取上述得到的飽和樹(shù)脂, 準(zhǔn)確加入50 ml95%的乙醇，在室溫下置于振蕩器上振蕩24h，充分解脫后, 測(cè)定濾液中黃酮的濃度，按照下式計(jì)算脫附率:脫附量= C3V1 / m脫附率( %) = 脫附量/ 吸附量×100式中, C3為解脫后溶液的濃度

27、(mg/ L) ; V1為解脫劑的體積( L) ; m為樹(shù)脂的質(zhì)量( g)。20、抗氧化活性試驗(yàn)20.1、清除羥自由基能力的測(cè)定在15 mL試管中依次加入FeSO4，H2O2，搖勻，然后加入水楊酸，搖勻，于37 水浴中加熱15 min，取出，510nm處測(cè)定吸光度A1，在加入一定濃度的樣品溶液1 mL，搖勻，水浴繼續(xù)加熱15min后取出，510nm處測(cè)定吸光度A2。通過(guò)計(jì)算精制前后產(chǎn)品的自由基清除效果來(lái)對(duì)比精制的效果。清除率=（A1-A2）/A1×100 %20.2、清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定1）PBS 緩沖溶液的配制：取氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g, 磷酸氫二鈉1.44

28、g, 磷酸二氫鉀0.24 g 溶解在800mL 蒸餾水中，調(diào)整pH值至8.2，最后定容至1000mL。2）測(cè)定方法：在10 mL 容量瓶中加入5 mL PBS 緩沖液（pH=8.2）,1 mL 的黃酮溶液，在45恒溫水浴中放置20 min 后，加入1 mL 的25 預(yù)熱鄰苯三酚溶液（45 mmol/L）,迅速混勻，每隔60 s 在510 nm 處測(cè)定溶液的吸光度，并與空白溶液相比較，根據(jù)公式即可計(jì)算出被測(cè)物抑制O2-·的累積作用能力。抑制率=（A 對(duì)照-A 樣品）/A 對(duì)照×100 %20.3、清除自由基效能力的測(cè)定DPPH法配置5 種不同濃度的黃酮溶液，分別吸取樣液2.0

29、 mL，加入DPPH 溶液（2×10-4 mg/mL）2.0 mL，搖勻、靜置30 min，以70 %乙醇為對(duì)照，在510 nm 處測(cè)定試液的吸光度A1。同時(shí)取待測(cè)樣液2.0 mL 與70 %乙醇2.0 mL 進(jìn)行混合，以70 %乙醇為對(duì)照，在510 nm 處測(cè)定試液的吸光度A2。最后，將DPPH 溶液2.0 mL 與70 %乙醇2.0 mL 混合，以70 %乙醇為對(duì)照，在510 nm處測(cè)定試液的吸光度A3。每組測(cè)定3 次，求取平均值，按下述公式計(jì)算樣品的抑制率。抑制率=1-（A1-A2）/A3×100 %精確稱(chēng)取0.0394g 的DPPH.，加入50mL 的無(wú)水乙醇，充分振蕩，此時(shí)濃度為2mmol/L，吸取1mLDPPH 溶液用無(wú)水乙醇定容到10mL，放入冰箱中待用。取0.2mmol/L DPPH. 溶液2.5mL，用無(wú)水乙醇定容于10mL 容量瓶中，室溫下置于30min，測(cè)定其在479nm 處的吸光度A。取2mL 經(jīng)純化后的蠶沙類(lèi)黃酮提取液和0.2mmol/L 的DPPH。溶液2ml，用無(wú)水乙醇定容于10mL 容量瓶中，室溫下放置30min，測(cè)定其在479nm 處