金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

1、【GB/T 4789.101994】 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)1主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。2引用標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑3設(shè)備和材料3.1顯微鏡。3.2溫箱：36±1。3.3離心機(jī)。3.4滅菌吸管：1mL、10mL。3.5滅菌試管。3.6滅菌平皿。3.7均質(zhì)器。3.8載玻片。3.9L型涂布棒。3.10酒精燈。3.11接種環(huán)。4培養(yǎng)基和試劑4.1胰酪陳大豆肉湯：按GB 4789.28中4.59規(guī)定。4.27.5%氯化鈉肉湯：按GB 4

2、789.28中4.61規(guī)定。4.3血瓊脂平板：按GB 4789.28中4.6規(guī)定。4.4BairdPrker瓊脂平板：按GB 4789.28中4.60規(guī)定。4.5肉浸液肉湯：按GB 4789.28中4.1規(guī)定。4.6滅菌鹽水。4.7兔血漿：按GB 4789.28中4.63規(guī)定。5檢驗(yàn)程序金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序如下：（圖略）6操作步驟6.1增菌培養(yǎng)法6.1.1檢樣處理稱取25g固體樣品；吸取25mL液體樣品，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。6.1.2增菌及分離培養(yǎng)吸取5mL上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪陳大豆肉湯

3、50mL培養(yǎng)基內(nèi)，置36±1溫箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種血平板和BairdParker平板，36±1培養(yǎng)24h，挑取金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。6.1.3形態(tài)本菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列是葡萄球狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.51m。6.1.4在肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，在胰酪陳大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)，血平板上菌落呈金黃色，也有時(shí)為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdParker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑為23mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接

4、種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無(wú)混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。6.1.5血漿凝固酶試驗(yàn)吸取14新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL，振蕩搖勻，放36±1溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以已知陽(yáng)性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。6.2直接計(jì)數(shù)方法6.2.1吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行十倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別

5、加入三塊BairdParker平板，每個(gè)平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個(gè)平板。如水分不多吸收，可將平板放在36±1溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36±1溫箱培養(yǎng)。6.2.2在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選5個(gè)菌落，分別接種血平板，36±124h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。6.2.3菌落計(jì)數(shù)：將三個(gè)平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽(yáng)性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。附錄A葡萄球菌腸毒素檢驗(yàn)(參考件)A1設(shè)備和材料A1.1均質(zhì)器

6、。A1.2冰箱。A1.3離心機(jī)。A1.4分液漏斗。A1.5透析袋。A1.6振蕩培養(yǎng)箱或普通溫箱：36±1。A1.7滅菌吸管：1mL、10mL。A1.8電線。A1.9載玻片。A1.10三角瓶：250mL。A1.11直徑150mm大平皿(或帶蓋搪瓷盤)。A1.12玻璃紙。A1.13鑷子。A1.14三角棒。A1.15直徑2.5mm打孔器。A1.16有機(jī)玻璃模板。A1.17橡皮圈。A1.18細(xì)滴管。A1.19層析柱：40mm×2025mm。A1.20酶標(biāo)測(cè)定器。A1.21洗瓶。A1.22微量加樣器：200mL、50mL。A2培養(yǎng)基和試劑A2.1腸毒素產(chǎn)毒培養(yǎng)基：按GB 4

7、789.28中4.87規(guī)定。A2.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂。A2.31%瓊脂糖(0.9%生理鹽水配制)溶液。A2.40.2mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液。A2.5三氯甲烷。A2.66mol/L鹽酸溶液。A2.75mol/L氫氧化鈉。A2.8生理鹽水。A2.91%乙酸溶液。A2.100.1%噻嗪紅R或氨基黑B。A2.11硅膠或凡士林。A2.12A、B、C、D型葡萄球菌腸毒素和抗血清。A2.13羧甲基纖維素(CM22或CM11 Whatman)。A2.140.008mol/L pH5.6磷酸鹽緩沖液。A2.150.008mol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液。A2.16酶

8、標(biāo)記A、B、C、D腸毒素抗血清或酶聯(lián)免疫試劑盒。A2.170.1mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液。A2.180.05%0.02mol/L pH7.2吐溫20緩沖液。A2.19鄰苯二胺酶底物。A2.202 mol/L硫酸。A3檢驗(yàn)程序A3.1從菌株中檢測(cè)腸毒素從菌株中檢測(cè)腸毒素程序見圖A1：（圖略）A3.2從食物檢樣中提取和檢測(cè)腸毒素A3.2.1微玻片法檢測(cè)腸毒素(濃縮法層析法)程序見圖A2：（圖略）A3.2.2酶聯(lián)免疫法檢測(cè)腸毒素程序見圖A3：（圖略）A4腸毒素檢測(cè)A4.1從菌株中提取腸毒素方法A4.1.1液體透析培養(yǎng)法：用寬2.5cm、長(zhǎng)80cm的透析袋裝入6

9、0mL產(chǎn)毒培養(yǎng)基，兩端扎緊，將透析袋裝入250mL三角瓶?jī)?nèi)，加入15mL滅菌生理鹽水，透析袋兩端留在瓶口，用棉塞塞好，121高壓滅菌30min，待測(cè)的菌株接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面(試管18mm×180mm)，37C培養(yǎng)24h，用生理鹽水5mL，洗下菌落，傾入上述培養(yǎng)瓶中，每個(gè)菌種種一瓶，37振蕩培養(yǎng)48h，振速為100次/min。吸出菌液離心，8000r/min 30min，取上清液做雙相瓊脂擴(kuò)散，如為陰性，再裝入透析袋內(nèi)，用電風(fēng)扇吹，或用多聚乙二醇，濃縮至12mL，再做瓊脂擴(kuò)散。A4.1.2固體透析培養(yǎng)法：向直徑150mm的滅菌平皿或帶蓋搪瓷盤中傾入滅菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基約100120m

10、L，凝固后表面鋪一滅菌玻璃紙，待測(cè)菌株接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，37培養(yǎng)24h，用約3mL滅菌鹽水洗下菌苔，傾在玻璃紙上，用滅菌三角棒涂滿平皿，37培養(yǎng)48h，加入1020mL滅菌生理鹽水，用滅菌三角棒刮取菌苔，吸取菌液離心，以下步驟同液體透析培養(yǎng)法。A4.2從食品中提取腸毒素方法A4.2.1直接濃縮法：取食品樣品100g，加入無(wú)菌0.2mo1/L pH7.5磷酸鹽緩沖液，均質(zhì)成勻漿，置4浸泡1824h，用紗布過濾將濾液離心8000r/min20min，取上清液，放入分液漏斗中，加入10mL三氯甲烷，振搖10min，靜置，將底層三氯甲烷棄去(如不分層，可8000r/min離心20min)。加

11、入6mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至4.5，8000r/min離心20min，取上液，加5mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)pH至7.5，離心取上清液，裝入透析袋或玻璃紙，用電扇吹干，或放多聚乙二醇上濃縮至12mL，做微玻片雙向瓊脂擴(kuò)散。A4.2.2層析法：如需提取較純腸毒素，可將上述濃縮液用蒸餾水洗下，裝入透析袋，以0.008mol/LpH5.6磷酸鹽緩沖液平衡，加入CM層析柱內(nèi)，流速12mL/min，用0.008mol/L pH5.6磷酸鹽緩沖液洗脫，再用0.2mol/LpH6.8磷酸鹽緩沖液洗脫出腸毒素。洗脫液裝入透析袋內(nèi)，用電扇或多聚乙二醇濃縮至1mL，做微玻片雙向瓊脂擴(kuò)散，檢測(cè)腸毒素。A

12、4.3雙向瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)腸毒素A4.3.1微玻片法：將在95%乙醇中浸泡的載片用潔凈紗布擦干，吸取溶化的0.2%瓊脂糖(蒸餾水配制)滴在載玻片上，使剩余的瓊脂糖流下，放無(wú)塵的環(huán)境中干燥，先將一層薄塑料板放在載玻片上，然后將帶孔的有機(jī)玻璃模板邊緣涂一層薄的硅膠或凡士林，放在塑料板上，兩邊用橡皮圈系緊固定，吸取1%瓊脂糖，立即從模板中間孔加入載玻片和模板之間，直至充滿瓊脂糖，凝固后再將孔中瓊脂糖用注射器針頭挑去，在中間孔滴加抗血清，四周滴加菌株產(chǎn)毒液或食品提取液，放入加有濕棉球的容器內(nèi)，放25301824h觀察結(jié)果?？稍跓艄馍?，并對(duì)著暗的背景觀察，在抗血清和提取液之間呈現(xiàn)明顯沉淀線。如沉淀線只能微弱

13、可見時(shí)，可進(jìn)行染色。A4.3.2玻片法：吸取溶化的1%瓊脂糖2.5mL，鋪在潔凈載玻片上，凝固后用直徑2.5mm的金屬打孔器打成幅射型，孔距為2.5mm，中心孔加入腸毒素抗血清，周圍六個(gè)孔加入菌株或食品的腸毒素提取液，放入有滴加2/10000三氮化鈉濕棉球的容器內(nèi)，以保持濕度。置25301820h，觀察結(jié)果，在抗血清的提取物之間有明顯沉淀線即為陽(yáng)性。A4.3.3染色法：用微玻片法取下膠帶和有機(jī)玻璃模板，玻片法可直接將玻片放入蒸餾水中浸泡48h，中間換23次水，在下述各液中浸10min，10%乙酸中含1%噻嗪紅R(或氨基黑)；1%乙酸；1%乙酸含1%甘油，如脫色不凈，可繼續(xù)浸泡。取出后蓋一濾紙，

14、吸去多余液體，在室溫或35烘干。陽(yáng)性者沉淀被染料顏色，可長(zhǎng)期保存。（圖略 ）A4.4酶聯(lián)免疫法檢測(cè)腸毒素(雙抗體法)A4.4.1包被抗體：用0.1mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋腸毒素抗血清使成5g/mL，加入洗凈的苯乙烯凹孔板內(nèi)，每孔0.2mL，置36±130min，棄去上液。A4.4.2洗滌：用0.05%0.02mol/LpH7.2吐溫20緩沖液洗滌5次。A4.4.3加入檢樣：如為液體，可直接加入0.2mL，固體樣品取100g，加入0.2mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液100mL，均質(zhì)后取過濾液0.2mL。A4.4.4洗滌：同A4.4.2。A4.4.5每孔內(nèi)加入酶抗體0.2mL，置36±130min，同