酵母雙雜交實驗步驟

1、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡介一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設(shè)計原理報告質(zhì)粒p8op-LacZ的GAL4 UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄活性為零，該基因的篩選標(biāo)志為URA3，可以作為有自主復(fù)制能力的質(zhì)粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于表達(dá)DNA-BD(202個氨基酸殘基組成的LexA蛋白)與目標(biāo)蛋白(釣餌，Bait)的融合蛋白，該融合體的表達(dá)受酵母強(qiáng)啟動子ADH1的調(diào)控，選擇與報告基因的操縱子LexA×8結(jié)合。質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為TRP1

2、，在其供外源基因插入的多克隆位點(EcoR I與Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(來自于E.coli的88個氨基酸殘基組成的B42蛋白)等幾種編碼序列，共同組成可以啟動報告基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的激活成份。在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個報告基因Leu，它與LacZ報告基因具有相同的操縱子-LexA，但兩者啟動子不同。根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復(fù)合物同時具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。分別將待測蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD質(zhì)粒載體的多克隆位點中，然后共同轉(zhuǎn)入

3、含有報告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，通過檢測報告基因的表達(dá)情況，就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強(qiáng)弱。如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫，則可用X從該文庫中篩選出能與其相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的組成1.  載體質(zhì)粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文庫2.  酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侶菌株）3.  大腸桿菌菌株：E.col

4、i KC8株4.  對照質(zhì)粒：質(zhì) 粒   用 途pLexA-53，pB42AD-T  陽性對照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白  陽性對照pLexA-Lam(LaminC蛋白少與其它蛋白相互作用)  假陽性檢測質(zhì)粒5.  引物：pLexA測序引物及pB42AD測序引物。三、酵母雙雜交實驗的基本流程1.  將報告基因p8op-LacZ轉(zhuǎn)化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。2.  同時構(gòu)建或擴(kuò)增DNA文庫，

5、并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。3.  構(gòu)建DNA-BD/靶蛋白質(zhì)粒pLexA-X，作為釣餌(bait)。4.  將上述釣餌質(zhì)粒pLexA-X轉(zhuǎn)化EGY48(p8op-LacZ)細(xì)胞株，用SD/-His/-Ura篩選；并用固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活報告基因的活性，以及對酵母細(xì)胞是否具有殺傷毒性。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒  選擇培養(yǎng)基  克隆生長情況  說 明  (含有Gal/Raf)   &#

6、160;pLexA-Pos  SD/-His，-Ura  藍(lán)  陽性對照pLexA  SD/-His，-Ura  白  陰性對照PlexA-X  SD/-His，-Ura  白  沒有直接激活活性PlexA-X  SD/-His，-Ura  藍(lán)  具有直接激活活性PlexA-X  SD/-His，-Ura  菌落不能生

7、長  酵母細(xì)胞毒性4-1.  如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信號作用。b能夠自動激活報告基因，則設(shè)法去除其激活活性部位、或者將LacZ報告基因整合入基因組，減少4-2.  如果pLexA-X雖然不會自動激活報告基因，但對酵母宿主細(xì)胞有毒性，則需要與純化的文庫DNA同時轉(zhuǎn)化酵母。5.  如果pLexA-X既不會自動激活報告基因，也不具有毒性，則可以與純化的文庫DNA同時、或順序轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn) 化  質(zhì) 粒  SD固體培養(yǎng)基  Lac

8、Z表型對照1  pLexA-Pos  Gal/Raf/-His/-Ura  藍(lán)對照2  pLexA-53  Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu  藍(lán)  pB42AD-T    實 驗  pLexA-X  Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu  待測  pB42AD-文庫  

9、0; 5-1.  用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽性共轉(zhuǎn)化子，并擴(kuò)增，使宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒在誘導(dǎo)前達(dá)到最大拷貝數(shù)。-半乳糖苷酶無表達(dá)。b5-2.  上述重組子轉(zhuǎn)至含X-gal的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，觀察LacZ及Leu報告基因的表達(dá)情形，藍(lán)色克隆即為陽性。白色克隆為假陽性，說明Leu雖有表達(dá)，但5-3.  同時用LacZ、Leu兩個報告基因的目的，是為了盡可能消除實驗的假陽性誤差，譬如：AD融合蛋白不與目標(biāo)蛋白結(jié)合，而直接與啟動子序列結(jié)合域結(jié)合等情況。由于2

10、個報告基因的啟動子不同，出現(xiàn)上述假陽性的幾率就大大減少了。5-4.  將藍(lán)色陽性克隆進(jìn)行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫質(zhì)粒。6.  陽性克隆的篩選6-1.  隨機(jī)選取50個陽性克隆，擴(kuò)增、抽提酵母質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化E.coli KC8宿主菌，抽提大腸桿菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫質(zhì)粒。6-2.  如果重復(fù)的插入序列較多，可另取50個陽性克隆來分析。最后得到數(shù)種片段大小不同的插入序列，再轉(zhuǎn)化新的宿主細(xì)胞，檢測是否仍為陽性克隆。7. 用質(zhì)粒自然分選法(Natural Segregation

11、)篩除只含有AD-文庫雜合子的克隆7-1.  將初步得到的陽性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2天，含有HIS3編碼序列的BD-靶質(zhì)粒在含有外源His培養(yǎng)基中，將以10-20左右的頻率隨機(jī)丟失。C孵育2-3天。°7-2.  將上述克隆，轉(zhuǎn)鋪固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ura，307-3.  再挑取生長的單克隆，轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫雜合子的重組子。7-4.  將His表型缺陷的克隆轉(zhuǎn)化固

12、體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以驗證AD-文庫能否直接激活報告基因的表達(dá)，棄去陽性克隆，保留陰性克隆。8.  酵母雜合試驗(Yeast Mating)確定真陽性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其對應(yīng)的YM4271宿主細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的質(zhì)?；蛭膸霥NA，通過雜合實驗確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫確實具有相互作用的真陽性克隆。質(zhì)粒1(in YM4271)  質(zhì)粒2(in EGY48)  LacZ表型  Leu表型pLexA  pB42AD 

13、60;白  不能生長pLexA-靶DNA  pB42AD  白  不能生長pLexA  pB42AD-文庫  白  不能生長pLexA-靶DNA  pB42AD-文庫  藍(lán)  真 陽 性pLexA-Lam  pB42AD-文庫  白  不能生長9. 陽性克隆的進(jìn)一步篩選和確證9-1.  擴(kuò)增初步確定的陽性克隆，抽提酵母

14、DNA。該DNA為混合成份，既含有酵母基因組DNA，也含有3種轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。9-2.  將上述DNA電轉(zhuǎn)化E.coli KC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，具有不同復(fù)制起始調(diào)控序列的質(zhì)粒不相容；同時利用營養(yǎng)缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含有AD-文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才能生長，將其擴(kuò)增、并抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定。9-3.  用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫DNA一一對應(yīng)、共轉(zhuǎn)化只含有報告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴(kuò)增，并與后面的誘導(dǎo)板形成對照，說明報告基因的表達(dá)與誘導(dǎo)AD融合蛋白的表達(dá)有

15、關(guān)，再確證LacZ、Leu報告基因的表達(dá)。9-4.  擴(kuò)增與靶DNA相互作用的文庫DNA，進(jìn)行序列分析及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)、功能研究。10. 對雙雜交系統(tǒng)陽性結(jié)果的進(jìn)一步研究10-1.  用不同的雙雜交系統(tǒng)驗證10-1-1.  將載體 pLexA與pB42AD互換后進(jìn)行雙雜交實驗。10-1-2.  選擇不同的雙雜交系統(tǒng)，如：以GAL4轉(zhuǎn)錄激活子為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)。10-1-3.  將文庫質(zhì)粒移碼突變后，再與靶質(zhì)粒作用，報告基因是否仍能被激活。-半乳糖苷酶水平，比較作用強(qiáng)度變化。b10-1-4.

16、0; 去除或突變特定結(jié)合位點，定量檢測10-2.  用試劑盒提供的引物測定插入片段的DNA序列，證明其編碼區(qū)域。10-3.  用其它的檢測方法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來證明雙雜交系統(tǒng)篩選的蛋白之間的具有相互作用。10-4.  進(jìn)一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功能關(guān)系構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的擴(kuò)增1.  自-80冰箱取出含有cDNA文庫的甘油菌，置于冰浴中緩慢化凍。2.  用新鮮的LB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中將上述甘油菌1:106和1:108稀釋。lml加入90m3.

17、0; 取稀釋菌液各10 90mm)；37倒置培養(yǎng)過夜或30培養(yǎng)24-36hr，計數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fLB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中振蕩混勻，涂布LB/Amp平板(4.  確定待擴(kuò)增的cDNA文庫滴度(cfu/ml)=克隆數(shù)×108(1:106稀釋)或克隆數(shù)×1010(1:108稀釋)。5.  按照>150mm)，共100塊；37倒置培養(yǎng)過夜。f2-4×104cfu/平板的濃度，涂布LB/Amp平板(6.  在超凈工作臺上，在所有生長菌落的平板上加適量LB培養(yǎng)液，將菌落刮下，轉(zhuǎn)入2000

18、ml LB/Amp培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)2-4hr。7.  留取適量培養(yǎng)菌液以50%無菌甘油稀釋至25%終濃度，分裝，保存于-80。8.  其余培養(yǎng)菌液離心8000xg×10min，4收集細(xì)菌；用質(zhì)粒DNA純化試劑盒大量抽提質(zhì)粒DNA。LB液體培養(yǎng)基，121，15lb/in2滅菌15minA.  bacto-Tryptone  10.0gB.  bacto-Yeast Extract  5.0gC.  NaCl  10.0gD

19、.  ddH2O   1000 ml* LB固體培養(yǎng)平板為含有1.5%瓊脂(Agar)LB培養(yǎng)基。* LB/Amp培養(yǎng)基為含有Amp g/ml的LB培養(yǎng)基。m50-100構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的純化1.  質(zhì)粒DNA提取緩沖液名 稱  緩 沖 液  配 方g/ml RNasemP1  懸浮緩沖液  50mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA；100 AP2  裂解緩沖液  200mM NaOH

20、；1% SDSP3  中和緩沖液  3.0M Kac(pH5.5)QBT  平衡緩沖液  750mM NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%異丙醇；0.15% Triton X-100QC  洗滌緩沖液  1.0 M NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%異丙醇QF  洗脫緩沖液  1.25 M NaCl；50mM Tris-HCl(pH8.5)；15%異丙醇2.  培養(yǎng)菌液離心6000xg&

21、#215;10min，4，每500ml培養(yǎng)物(下同)的沉淀重懸于50ml P1緩沖液。3.  加入50ml P2緩沖液，倒置4-6次混勻，室溫孵育5min。4.  加入4預(yù)冷的50ml P3緩沖液，快速倒置4-6次混勻，冰浴30min(其間再倒置混勻4-6次)。5.  將上述混合液再倒置混勻，離心12000xg×30min，4，保留上清。6.  上清再離心12000xg×15min，4，留上清。7.  將上清液上樣于經(jīng)35ml QBT緩沖液平衡的QIAGEN-tip層析柱。8

22、.  以100ml QC緩沖液洗滌層析柱2次。9.  以35ml QF緩沖液洗脫吸附于層析柱上的DNA。10.  以0.7倍體積異丙醇沉淀DNA，離心12500xg×30min，4，小心去除上清。11.  以7ml 70%乙醇洗滌沉淀DNA，離心12500xg×10min，4，小心去除上清。12.  將沉淀的質(zhì)粒DNA溶于5ml TE(pH8.0)緩沖液，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，用2.5倍體積無水乙醇；1/10體積3.0M NaAc(pH5.2)，于-20靜置過夜。13.&#

23、160; 離心12500xg×20min，4，去除上清，沉淀用70%乙醇洗滌，超凈臺風(fēng)干。l)，保存于-20。mg/管(用于1次轉(zhuǎn)化反應(yīng)，約40m14.  干燥的DNA溶于適量體積TE，定量，分裝100-200構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞1.  將酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接種于5.0ml SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0ml SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115，10lb/i

24、n2滅菌15minA.  Difco Nitrogen  0.67gB.  葡萄糖  2.00gC.  10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)  10.0mlD.  20×His  5.0mlE.  20×Leu  5.0mlF.  20×Trp  5.0mlG.  ddH2O

25、60; 100.0ml   2.  將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(約50ml)，30恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5(約3hr)。YPD液體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15minA.  Polypepton  6.0gB.  bacto-Yeast Extract  3.0gC.  葡萄糖  6.0gD.  ddH2O  &

26、#160;300 ml3.  室溫離心5000xg×5min，棄上清；加入15-25ml ddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。4.  準(zhǔn)備下列試劑  2×轉(zhuǎn)化反應(yīng)  10×TE  10×LiAc  50% PEG  ddH2Olml  /  120ml  15mA.  

27、1×TE/LiAc  0.15ml  15l  /ml  960ml  120mB.  PEG/LiAc  1.20ml  120lml  /  /  900mC.  1×TE  1.00ml  1005.  分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，振蕩混勻。lmg)  3-

28、5mA.  pLexA-X(0.1B.  10mg/ml lmSperm DNA*(0.1mg)  10   * 新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。 l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m6.  每管加入100lm7.  各加入600 PEG/LiAc，振蕩混勻，30恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm8.  各加入70 DMSO緩和倒置混勻。42熱休克15min，迅速插入冰浴。9. 

29、0;室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清；以0.3ml 1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板，30倒置培養(yǎng)3-5天。     SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.  Difco Nitrogen  1.34gB.  葡萄糖  4.00gC.  10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)  20.0mlD.

30、60; 20×Leu  10.0mlE.  20×Trp  10.0mlF.  Agar  4.00gG.  ddH2O 90-100mm)f  200.0ml   鋪8-10塊平板(附表1. 不同規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞  Small Scale*  Large Scale  Library Scale轉(zhuǎn) 化 反 應(yīng)  20&#

31、160; 1  1(1)  SD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌  100ml  100ml  300ml(2)  YPD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌  300mla  300mla  1000mla(3)  TE或ddH2O洗滌酵母細(xì)胞  15mlc  25-50mlb  500mla(4)  準(zhǔn)備 A. 1×TE/

32、LiAc緩沖液  1.5mld  1.0mld  8.0mlcB. PEG/LiAc緩沖液  12.0mlc  6.0mlc  100.0mlbC. 1×TE緩沖液  6.0mlc  10.0mlc  10.0mlcm  0.1gd  mg×20  10-50mB. AD vector  0.1C. l &#

33、160;2.0mlml×20  200mSperm DNA(10mg/ml)  10  1×TE/LiAc重懸感受態(tài)細(xì)胞  1.5mlc  1.0mlc  8.0mlbl×20  1.0ml  8.0mlm酵母感受態(tài)細(xì)胞  100(7)  PEG/LiAc緩沖液  0.6ml×20  6.0ml  

34、60.0mll  7.0mlml×20  700m  DMSO  70(9)  室溫離心后棄上清  13000xg×10sec  2000xg×5min  2000xg×5min(10)  1×TE重懸感受態(tài)細(xì)胞  0.3ml×20  6.0ml  10.0ml150mm×50f150mm

35、×30  f90mm×20  f鋪固體選擇培養(yǎng)基平板  注: * 即為“構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞”* 在不同容積的無菌離心管中進(jìn)行，a: 300或500ml；b: 50ml；c: 15ml；d: 1.5ml 文庫cDNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母感受態(tài)細(xì)胞1.  以生長于SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板上的含有構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA及報告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作為宿主菌，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。2.  將酵母宿主

36、菌接種于5.0ml SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0ml SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，30恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15minA.  Difco Nitrogen  0.67gB.  葡萄糖  2.00gC.  10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)  10.0mlD.  20&#

37、215;Leu  5.0mlE.  20×Trp  5.0mlF.  ddH2O   100.0ml   3.  將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(約50ml)，30恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5(約3hr)。YPD液體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15minA.  Polypepton  6.0gB.  bacto-

38、Yeast Extract  3.0gC.  葡萄糖  6.0gD.  ddH2O   300 ml4.  室溫離心5000xg×5min，棄上清；加入15-25ml ddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。5.  準(zhǔn)備下列試劑  1×轉(zhuǎn)化反應(yīng)  10×TE  10×LiAc 

39、60;50% PEG  ddH2Olml  /  800ml  100mA.  1×TE/LiAc  1.0ml  100l  4.8ml  /ml  600mB.  PEG/LiAc  6.0ml  600C.  1×TE  10.0ml  1.0ml

40、60; /  /  9.0ml6.  取1.0ml用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入下列成份，振蕩混勻。lmg)  40mA.  pB42AD-Library(50-100B.  10mg/ml lmHerring DNA*(2.0mg)  200   * 新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。 7.  加入6.0ml PEG/LiAc，振蕩混勻，30恒溫，250rpm

41、振蕩培養(yǎng)30min。lm8.  加入700 DMSO緩和倒置混勻。42熱休克15min，迅速插入冰浴。9.  室溫離心2000xg×5min，盡量棄上清。10.  以6.0ml 100mm，每稀釋度各×2)，30倒置培養(yǎng)3-5天，確定轉(zhuǎn)化效率在2×106cfu以上有效。fl稀釋不同倍數(shù)，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板(m1×TE重懸沉淀細(xì)胞，取10150mm×30)，30倒置培養(yǎng)3-5天。fl涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板(m11. 

42、60;按每板200     SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.  Difco Nitrogen  13.40gB.  葡萄糖  40.00gC.  10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)  200.0mlD.  20×Leu  100.0mlE.  Agar  

43、;40.00gF.  ddH2O 150mm)f  2000.0ml   鋪30塊平板(12.  在超凈工作臺上，在所有生長菌落的平板上各加5ml TE(pH7.0)緩沖液，將菌落刮下。13.  離心棄上清，加入10-20ml TE緩沖液重懸沉淀菌，加入等體積的無菌65%甘油-MgSO4緩沖液，混勻，分裝1.0ml/管，保存于4 1周或-801年以上。   65%甘油-MgSO4緩沖液: 65%甘油；100mM MgSO4；25mM Tris-HCl(pH8.0)A.

44、0; 甘油  65.00mlB.  MgSO47H2O  2.465gC.  2.0 M Tris-HCl(pH8.0)  1.25mlD.  ddH2O   100.00ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的篩選1.  經(jīng)過選擇培養(yǎng)基篩選的含有DNA-BD載體、文庫DNA及報告基因的酵母感受態(tài)細(xì)胞，用無菌TE稀釋至1:104、1:106和1:108等不同濃度。90mm)，30倒置培養(yǎng)3-5天，計數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fl，涂布SD/-

45、Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板(m2.  取上述稀釋菌液各1003.  確定待進(jìn)一步鑒定的酵母菌滴度(cfu/ml)=克隆數(shù)×105(1:104稀釋)、克隆數(shù)×107(1:106稀釋)或克隆數(shù)×109(1:108稀釋)。4.  按照以前實驗確定的文庫轉(zhuǎn)化效率的5-10倍的總量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30倒置培養(yǎng)3-5天。5.  挑取顯藍(lán)色的菌落，再接種于SD/-Ura，-Hi

46、s，-Trp固體培養(yǎng)基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以進(jìn)一步確證。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基A.  SD/Gal/Raf  3.79gB.  10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)  10.0mlC.  Agar  2.00gD.  ddH2O   85.0ml滅菌(115，10lb/in2)15min ，冷卻至50

47、，加入下列成份后鋪板E.  10×BU   10.0mlF.  20mg/ml X-gal  0.4ml   90-100mm)f鋪5-6塊平板(10×BU緩沖液，121，15lb/in2滅菌15minA.  Na2HPO412H2O  9.30gB.  NaH2PO42H2O  3.90gC.  ddH2O   100.0ml20mg/ml X-GalA.

48、  X-Gal  40mgB.  DMF  2ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA的提取1.  挑取經(jīng)過酵母選擇/誘導(dǎo)培養(yǎng)基初步鑒定的酵母單菌落，接種于5.0-10.0ml SD/-Trp液體培養(yǎng)基，30恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)20hr。SD/-Trp液體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15minA.  Difco Nitrogen  0.67gB.  葡萄糖  2.00gC.  

49、;10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)  10.0mlD.  20×His  5.0mlE.  20×Leu  5.0mlF.  20×Ura  5.0mlG.  ddH2O   100.0ml  2.  室溫離心5000xg×1min，棄上清，收菌。l酵母裂解液，振蕩重懸沉淀酵母菌。m3.  

50、;加入200   酵母裂解液: 2% Triton X-100；1% SDS；100mM NaCl；10mM Tris-HCl(pH8.0)；1mM EDTAA.  10% Triton X-100  20.0mlB.  10% SDS  10.0mlC.  NaCl  0.58gD.  Tris  0.12gE.  EDTANa22H2O  0.04gF. 

51、0;1.0M HCl調(diào)pH8.0   G.  ddH2O   100.0ml4.  加入下列試劑，充分振蕩5min；液氮凍存10min，室溫復(fù)融；再充分振蕩5min。A.  經(jīng)酸處理的玻璃珠(Sigma)  0.20gB.  苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)  0.2ml5.  室溫離心12000xg×10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml 離心管中，加入下列試劑，于-70凍存30-60 min。A.

52、  3 M NaAc(1/10 lmV)  20lmB.  無水乙醇(2.5V)  5006.  離心12500xg×10 min，4，棄上清；70%乙醇洗滌沉淀，于 37烘箱或超凈臺干燥DNA；將干燥的沉淀DNA重溶于 l無菌ddH2O中，保存于-20。m20-30酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化大腸桿菌1.  在冰浴條件下，取待轉(zhuǎn)化DNA l感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。mg)，加入100ml(5pg-0.5m1.0WF，200m2. 

53、0;將上述混合液加入間距0.1cm的樣品杯中，電轉(zhuǎn)化(1.8kV，25。3.  迅速加入1ml新鮮的LB培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，37恒溫，150rpm振蕩孵育30-60min。4.  將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布M9/DO(-Trp)固體培養(yǎng)板，37倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(16-22hr)。5.  按常規(guī)方法擴(kuò)增上述陽性轉(zhuǎn)化菌，堿裂解法少量抽提質(zhì)粒DNA，酶切篩選AD載體上含有插入片段的陽性克隆，保存其于25%甘油，待進(jìn)一步驗證。     M9/DO-Trp固體培養(yǎng)基，115，10lb/i

54、n2滅菌15minA.  葡萄糖  1.2g B.  Agar  6.0gC.  5×M9緩沖液  60 ml D.  10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)  30 mlE.  20×His  15 mlF.  20×Leu  15 mlG.  20×Ura &#

55、160;15 mlH.  ddH2O   165 ml冷卻至50左右，加入下列成份，混勻鋪板I.  1.0M Thiamine-HCl(Vit.B1)  0.3 mlJ.  100mg/ml Amp  0.3 ml   90-100mm)f鋪10-15塊平板(大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(電轉(zhuǎn)化)1.  挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的E.coli KC8單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜(約12-14hr

56、)。2.  將2.5 ml新鮮菌液接種于500ml SOB培養(yǎng)液中，37恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6(約2.5-3hr)。     SOB液體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15minA.  bacto-Tryptone  10.00gB.  bacto-Yeast Extract  2.50gC.  NaCl  0.25gD.  KCl  0.0

57、9gE.  MgCl26H2O  1.02gF.  ddH2O   500.0ml3.  將培養(yǎng)菌液收集于離心管中，冰水浴15-20min。4.  離心6000xg×10min，4，棄盡上清；以5ml 預(yù)冷的無菌ddH2O重懸沉淀菌；再加入500ml預(yù)冷的無菌ddH2O洗滌細(xì)菌。5.  重復(fù)上述步驟1次，以充分去除培養(yǎng)基中殘余的鹽離子成份。6.  用40-50ml 預(yù)冷的無菌10% 甘油重懸沉淀細(xì)菌，轉(zhuǎn)移至50ml 無菌離心管

58、中；離心6000xg×10min，4，棄盡上清；重復(fù)此步驟1次。7.  以等體積(約1.5-2.0ml) 預(yù)冷的無菌10% 甘油重懸上述沉淀的感受態(tài)細(xì)胞，分裝0.5ml/管(5-6次轉(zhuǎn)化反應(yīng))，保存于-80備用。酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的確證1.  以含有報告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作為轉(zhuǎn)化宿主菌。2.  將酵母宿主菌接種于5.0ml SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0ml SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-

59、Ura液體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15minA.  Difco Nitrogen  0.67gB.  葡萄糖  2.00gC.  10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)  10.0mlD.  20×His  5.0mlE.  20×Leu  5.0mlF.  20×Trp  5.0mlG.&#

60、160; ddH2O   100.0ml   3.  將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(約50ml)，30恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5(約3hr)。YPD液體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15minA.  Polypepton  6.0gB.  bacto-Yeast Extract  3.0gC.  葡萄糖  6.0gD. 

61、 ddH2O   300 ml4.  室溫離心5000xg×5min，棄上清；加入15-25ml ddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。5.  準(zhǔn)備下列試劑  20×轉(zhuǎn)化反應(yīng)  10×TE  10×LiAc  50% PEG  ddH2Ol  /  1.2mlml 

62、60;150mA.  1×TE/LiAc  1.5ml  150B.  PEG/LiAc  12.0ml  1.2ml  1.2ml  9.6ml  /C.  1×TE  10.0ml  1.0ml  /  /  9.0ml6.  分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。A.

63、  pLexA lmg)  3-5mor pLexA-X(0.1lmg)  3-5mB.  pB42AD-Y(0.1C.  10mg/ml Sperm lmDNA*(0.1mg)  10   * 新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。 l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m7.  每管加入100lm8.  各加入600 PEG/LiAc，振蕩混勻，30恒溫，250rpm振蕩

64、培養(yǎng)30min。lm9.  各加入70 DMSO緩和倒置混勻。42熱休克15min，迅速插入冰浴。10.  室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清；以0.3ml 1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板，30倒置培養(yǎng)3-5天。   SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.  Difco Nitrogen  3.35gB.  葡萄糖  10.00gC.  10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)  50.0mlD.  20×Leu  25.0mlE.  Agar  10.00gF.  ddH2O   500.0ml   90-100mm)f鋪20-25塊平