酵母菌的形態(tài)觀察與微生物大小的測定

1、酵母菌的形態(tài)觀察, 死活細胞鑒別,微生物測量技術,顯微鏡直接計數(shù)法一、實驗目的1觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學習區(qū)分酵母菌死活細胞的實驗方法；掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細菌的區(qū)別。 2了解目鏡測微尺和鏡臺測微尺的構造及使用原理，掌握測定微生物細胞大小的方法 .3. 了解血球計數(shù)板的構造和使用方法,學會用血球計數(shù)板對酵母細胞進行計數(shù)。二、實驗原理染色：美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型。因此，具有還原能力的酵母細胞是無色的，而死細胞或代謝作用微弱的衰

2、老細胞則呈藍色或淡藍色。 測量：微生物細胞的大小是微生物重要的形態(tài)特征之一，由于菌體微小，只能在顯微鏡下測量。用于測量微主物細胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把 10 mm長度刻成 100等分。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上(此處正好與物鏡放大的中間物像重疊)用于測量經(jīng)顯微鏡放大后的細胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測 微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。計數(shù)：每一個大方格邊長為1mm，

3、則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為01mm，所以計數(shù)室的容積為01mm3。在計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。下面以一個大方格有25個中方格的計數(shù)板為例進行計算：設五個中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個大方格中的總菌數(shù)因1ml=1cm3=1000mm3，三、實驗儀器1 菌種: 培養(yǎng)48h的酵母菌染色液和試劑：0.05%、0.1%呂氏堿性美藍3 器材：顯微鏡、血球計數(shù)板、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、蓋玻片、吸水紙、計數(shù)器、移液器、擦鏡紙。四、實

4、驗方法目微尺的校正：把Olympus目鏡的下部羅圈旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野中看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度，計數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。因為鏡臺測微尺的刻度每格長10m，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的實際長度。用同法分別校正在低倍鏡下和高倍鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。酵母菌形態(tài)觀察及死活細胞鑒別）制片：在一個載玻片上分別滴0

5、.05%、0.1%呂氏堿性美藍各1滴，無菌操作取酵母菌，在染液中分別混勻，蓋上蓋玻片，靜置5分鐘。）鏡檢：在顯微鏡高倍鏡下觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式。）計數(shù)死活細胞：死細胞為染為蘭色的細胞，活細胞為無色細胞，分別計數(shù)，并隔5-15分鐘檢測一下死活細胞數(shù)，比較其死活細胞的比例變化。 細胞大小的測定：移去鏡臺測微尺，換上酵母菌染色片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測徽尺來測量酵母菌菌體的長，寬各占幾格（不足一格的部分估計到小數(shù)點后一位數(shù)）。測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。一般測量菌體的大小要在同一個標本片上測定1020個菌體，才能代表該菌的大小。待測微生

6、物需用培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌體進行測定。顯微鏡直接計數(shù)酵母菌液濃度：）酵母菌液的制備：無菌操作用接種環(huán)從斜面中取一環(huán)酵母菌，置于無菌水中振蕩制成菌懸液）加樣品：將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的吸頭將酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。 ）顯微鏡計數(shù)：靜置5分鐘后，將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內約有510個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格（可選4個角和中央的中格

7、）中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算樣品的含菌量。五、實驗結果繪圖說明酵母菌形態(tài)及出芽方式。目鏡測微尺校正結果（填表）0.1%美蘭在40倍物鏡下12345678910平均值寬度/196.0215.6245.0264.6294.0176.4147.0313.6245.0127.4222.5長度/205.8245.0333.2313.6294.0205.8196.0352.8284.2235.2245.9酵母菌大小測定結果（填表）微生物名稱目鏡測微尺每格代表長度表長度/u

8、m寬長菌體大小范圍目鏡測微尺格數(shù)寬度/um目鏡測微尺格數(shù)長度/um酵母菌103.39643.9543.39×3.95um顯微鏡直接計數(shù)實驗結果（填表并計算濃度）：各中格中菌數(shù)AB菌數(shù)ml二室平均12345第一室60867272076862433921169600000170500000第二室71270967065068734281171400000六 思考題為什么目測尺使用前必須校正？答：目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把 10 mm長度刻成 100等分。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上(此處正好與物鏡放大的中間物像重疊)用于測量經(jīng)顯微鏡放大后的細胞物

9、象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測 微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。不同美藍濃度和作用時間對酵母菌死活細胞的比例有何影響？答：0.05%的美藍溶液中酵母菌死活細胞的比例大約為1：40.1%的美藍溶液中酵母菌死活細胞的比例大約為2：3通過實驗觀察，時間越長酵母菌死活細胞的比例越大40倍目鏡下菌的顏色第一組（剛蓋上蓋玻片）第二組（5分鐘后）第三組（10分鐘后）0.1%的美蘭溶液下酵母菌個數(shù)藍色（死）5579113透明（活）10896460.05%的美蘭溶液下酵母菌個數(shù)藍色（死）264970透明（活）205182154由數(shù)據(jù)可知，高濃度美蘭溶液（0.1%）第一組死活比例，死細胞占總體的33.7% 第二組死活比例，死細胞占總體的45.1% 第三組死活比例，死細胞占總體的71.1%0.05%的美蘭溶液（低濃度） 第一組死活比例，死細胞占總體的9.6% 第二組死活比例，死細胞占總體的21.1% 第三組死活比例，死細胞占總體的31.3%根據(jù)你實驗的體會，說明用血球計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面？應如何盡量少誤差，力求準確？答：1、向計數(shù)室中加菌懸液時產(chǎn)生氣泡避免方法：將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上