流式細胞儀-12.16

1、 流式細胞儀簡介流式細胞儀簡介逄亞楠逄亞楠2013年年12月月17日日 流式細胞儀流式細胞儀 流式細胞儀（流式細胞儀（Flow Cytometry, 簡稱簡稱FCM）是對）是對高速直線流動的細高速直線流動的細胞或生物微粒胞或生物微粒進行快速定量測定和分析的儀器進行快速定量測定和分析的儀器,主要包括樣品的液流主要包括樣品的液流技術、細胞的計數和分選技術技術、細胞的計數和分選技術,計算機對數據的采集和分析技術等。計算機對數據的采集和分析技術等。 流式細胞術（流式細胞術（Flow Cytometry, 簡稱簡稱FCM）是一項快速檢測分析）是一項快速檢測分析單單個粒子個粒子多物理特性的高技術，通常指細

2、胞通過激光束時在液流中的多物理特性的高技術，通常指細胞通過激光束時在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是內部結構，以及相對的熒光強度。特性，即粒子的大小，密度或是內部結構，以及相對的熒光強度。通過光電系統(tǒng)記錄細胞的通過光電系統(tǒng)記錄細胞的散射光信號散射光信號和和熒光信號熒光信號可得知細胞特性可得知細胞特性。= 研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等。微球等。 流式細胞儀的發(fā)展簡史流式細胞儀的發(fā)展簡史 雛形誕生于雛形誕生于19341934年年,Moldavan,Moldavan提出最早的流式細胞儀使提出最早的流式細

3、胞儀使懸浮的單個血紅細胞懸浮的單個血紅細胞流過流過玻璃毛細管玻璃毛細管, ,在亮視野下用顯微鏡進行計數在亮視野下用顯微鏡進行計數, ,并用光電記錄裝置測量的并用光電記錄裝置測量的設想。設想。 19531953年年Crosland -TaylorCrosland -Taylor根據牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律設計了根據牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律設計了流動室流動室。其后經過不斷改進其后經過不斷改進, ,設計了設計了光電檢測設備光電檢測設備和細胞分選裝置、完成了和細胞分選裝置、完成了計算機與計算機與流式細胞儀的物理連接流式細胞儀的物理連接及多參數數據的記錄和分析、開創(chuàng)了細胞的免疫熒及多參數數據的記錄和

4、分析、開創(chuàng)了細胞的免疫熒光染色及檢測技術、推廣流式細胞儀在臨床上的應用。光染色及檢測技術、推廣流式細胞儀在臨床上的應用。 近近2020年來年來, ,隨著流式細胞儀及其檢測技術和的日臻完善隨著流式細胞儀及其檢測技術和的日臻完善, ,人們越來越致力于樣人們越來越致力于樣品制備、細胞標記、軟件開發(fā)等方面的工作品制備、細胞標記、軟件開發(fā)等方面的工作, ,以擴大以擴大FCMFCM的應用領域和使用的應用領域和使用效果。效果。 流式細胞儀的組成流式細胞儀的組成流式細胞儀主要由三部分組成：流式細胞儀主要由三部分組成：流動室和液流系統(tǒng)；流動室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下：其作用如

5、下：液流系統(tǒng)：液流系統(tǒng)：依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)。依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)。光路系統(tǒng)：光路系統(tǒng)：細胞由激光激發(fā)，通過光學濾片產生光信細胞由激光激發(fā)，通過光學濾片產生光信號，并傳送到相應的探測器。號，并傳送到相應的探測器。 電系統(tǒng)：電系統(tǒng)：把光信號轉換為電信號。對于有分選裝置的把光信號轉換為電信號。對于有分選裝置的儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。 BD FACSJazz 流式細胞儀的工作原理流式細胞儀的工作原理 1.待測細胞以待測細胞以單個細胞的懸液單個細胞的懸液，經特異性熒光染料染，經特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動室。色，放入樣品管

6、，吸入流動室。 2. 流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細胞排成單列細胞排成單列由噴嘴中由噴嘴中心噴出，形成心噴出，形成細胞液柱細胞液柱。 3.液柱與激光束相交，細胞上的液柱與激光束相交，細胞上的熒光染料熒光染料被激發(fā)產生被激發(fā)產生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。 (一一)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的作用是液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)區(qū)，其理想狀態(tài)是把細胞傳送到激光束的中

7、心。而且在特，其理想狀態(tài)是把細胞傳送到激光束的中心。而且在特定時間內，應該只有一個細胞或粒子通過激光束。定時間內，應該只有一個細胞或粒子通過激光束。在流動室內細胞液柱聚焦于鞘液中心，細胞在此與激光相在流動室內細胞液柱聚焦于鞘液中心，細胞在此與激光相交。流動室內充滿鞘液，根據交。流動室內充滿鞘液，根據層流原理層流原理，在鞘液的約束下，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液柱。這種同軸流動的設計，使得樣品流和鞘液流形成的流柱。這種同軸流動的設計，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種束始終保持著一種分層鞘流分層鞘流的

8、狀態(tài)，這個過程稱為流體聚的狀態(tài)，這個過程稱為流體聚焦。該原理適用于所有流動室。焦。該原理適用于所有流動室。 (二二)光路系統(tǒng)光路系統(tǒng)-激光光源與光束形成系統(tǒng)激光光源與光束形成系統(tǒng)目前臺式目前臺式FCMFCM，多采用氬離子氣體激，多采用氬離子氣體激光器。激光光器。激光(laser)(laser)是一種相干光源，是一種相干光源，它能提供它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細胞快速流動，每個理想光源。由于細胞快速流動，每個細胞經過光照區(qū)的時間僅為細胞經過光照區(qū)的時間僅為1s1s左右，左右，每個細胞所攜帶

9、熒光物質被激發(fā)出的每個細胞所攜帶熒光物質被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關，因此細胞需要足夠發(fā)光的強度有關，因此細胞需要足夠的光照強度。的光照強度。 激光光束在達到流動室前，先激光光束在達到流動室前，先經過透鏡將其聚焦，形成幾何經過透鏡將其聚焦，形成幾何尺寸約為尺寸約為22m22m66m66m，即短，即短軸稍大于細胞直徑的光斑。這軸稍大于細胞直徑的光斑。這種橢圓形光斑激光能量分布屬種橢圓形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布，為保證樣品中細胞正態(tài)分布，為保證樣品中細胞受到的光照強度一致，須將樣受到的光照強度一致，須將樣本流與激光束正交，且相交于本流與

10、激光束正交，且相交于激光能量分布峰值處。激光能量分布峰值處。 (二二)光路系統(tǒng)光路系統(tǒng)-光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)FCMFCM的光學系統(tǒng)由的光學系統(tǒng)由分光器分光器，若，若干組干組透鏡透鏡、濾光片濾光片組成，它們組成，它們將不同波長的熒光信號分別送將不同波長的熒光信號分別送入到不同的電子測控器。入到不同的電子測控器。雙色反光鏡，分光器的一種，雙色反光鏡，分光器的一種，通過通過反射一定范圍的光，透過反射一定范圍的光，透過其余光來實現分離作用其余光來實現分離作用濾光片，濾光片，能透過一定波長的光能透過一定波長的光，但是沒有反射功能，但是沒有反射功能，放著角度放著角度是與光束成是與光束成9090度度。 “=46

11、0 500 540460 500 540460 500 540LongpassShortpassBandpass濾光片濾光片濾光片濾光片(Filter) ：長通濾片長通濾片 Long Pass Filter, LP 短通濾片短通濾片 Short Pass Filter, SP 帶帶 通濾片通濾片 Band Pass Filter, BP （三）電系統(tǒng)（三）電系統(tǒng)-信號檢測與分析系統(tǒng)信號檢測與分析系統(tǒng)當細胞攜帶熒光素標記物當細胞攜帶熒光素標記物，通過激光照射時，通過激光照射時，產生代表細胞內不同物質、不同波長的熒光信產生代表細胞內不同物質、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間號，這些

12、信號以細胞為中心，向空間360360度立度立體角發(fā)射，產生體角發(fā)射，產生散射光散射光和和熒光信號熒光信號。 流式細胞儀可檢測到的細胞參數流式細胞儀可檢測到的細胞參數顆粒度顆粒度細胞大小細胞大小= 前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）細胞相對大小及其表面積）細胞相對大小及其表面積 = 側向角散射光（側向角散射光（SSCSSC）細胞顆粒度及細胞內細胞器的相）細胞顆粒度及細胞內細胞器的相對復雜性對復雜性 前向角散射光前向角散射光 FSCFALS SensorLaser 側向角散射光側向角散射光SSCFALS Sensor90LS SensorLaser 散射光能被用來區(qū)分不同細胞群體的基本形態(tài)

13、上的散射光能被用來區(qū)分不同細胞群體的基本形態(tài)上的差異差異 - -通常使用通常使用“散點圖散點圖”來看散射光信號來看散射光信號 - -散點圖上的一個點就代表一個細胞顆粒的數據散點圖上的一個點就代表一個細胞顆粒的數據 熒光強度（熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。 有熒光標記的細胞與無熒光標記的區(qū)分開來（陰陽）有熒光標記的細胞與無熒光標記的區(qū)分開來（陰陽） 高高FL細胞與低細胞與低FL細胞區(qū)分開來（強弱）細胞區(qū)分開來（強弱）一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（一般的流式

14、細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可），可測出三個測出三個FL，即，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和和325nm），可測出），可測出6個個FL。 熒光檢測器熒光檢測器FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector 定量染色定量染色 熒光信號大小熒光信號大小 被標記組分含量的定量被標記組分含量的定量 多熒光標記胞內多種組分，實現多參數測量多熒光標記胞內多種組分，實現多參數測量熒光

15、信號與細胞特性熒光信號與細胞特性 FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光細細胞胞懸懸液液異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素得州紅得州紅能量傳遞復合染料能量傳遞復合染料藻膽蛋白類藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料（一）幾種常見的熒光染料 流式細胞儀數據分析流式細胞儀數據分析=數據存儲數據存儲: LIST MODE: LIST MODE=數據顯示數據顯示: : 直方圖直方圖 ( Histogram )( Histogram )二維點圖二維點圖(Dot Plot)(Dot Plot)等高線圖等高線圖(Co

16、ntour Plot)(Contour Plot)密度圖密度圖 (Density)(Density)三維圖（三維圖（3D Plot3D Plot）等）等FSC SSC FL1 FL2Eventvent 210016024585Event 3300650160720 單參數直方圖單參數直方圖 每一個細胞單參數的測量數據可整理成分布統(tǒng)每一個細胞單參數的測量數據可整理成分布統(tǒng)計，以分布直方圖計，以分布直方圖(distribution histogram)(distribution histogram)來顯示。在圖中，來顯示。在圖中，橫坐標表示橫坐標表示熒光信號或散射光信號熒

17、光信號或散射光信號相對強度的值，其單位是道數，相對強度的值，其單位是道數，橫坐標可以是線性的，也可以是對數的，縱坐標一般是橫坐標可以是線性的，也可以是對數的，縱坐標一般是細胞數細胞數 。 雙參數數據雙參數數據的顯示是用于表達來自同一細胞的顯示是用于表達來自同一細胞兩個參數兩個參數與細胞數量的關系，常用的表達方法有二維點圖與細胞數量的關系，常用的表達方法有二維點圖(dot (dot plot)plot)、等高線圖、等高線圖(contour plot)(contour plot)、二維密度圖、二維密度圖(density plot)(density plot)。在二維圖中，。在二維圖中，X X坐標為

18、某細胞一個參坐標為某細胞一個參數的數值，而數的數值，而Y Y坐標為該細胞另一參數的數值。從雙參坐標為該細胞另一參數的數值。從雙參數圖形中可以將各細胞亞群區(qū)分開，同時可獲得細胞數圖形中可以將各細胞亞群區(qū)分開，同時可獲得細胞相關的重要信息。相關的重要信息。 外周全血細胞散射光雙參數點圖外周全血細胞散射光雙參數點圖 等高圖和密度圖分析等高圖和密度圖分析 三維圖分析三維圖分析 細胞結構細胞結構=細胞大小細胞大小=細胞粒度細胞粒度=細胞表面面積細胞表面面積=核漿比例核漿比例=DNA含量與細胞周期含量與細胞周期=RNA含量含量=蛋白質含量蛋白質含量=染色體分析染色體分析 細胞功能細胞功能=細胞表面細胞表面

19、/胞漿胞漿/核的特異核的特異性抗原性抗原=細胞活性細胞活性=細胞內細胞因子細胞內細胞因子=酶活性酶活性=激素結合位點激素結合位點=細胞受體細胞受體=細胞凋亡細胞凋亡流式細胞儀的細胞學應用流式細胞儀的細胞學應用 細胞凋亡研究細胞凋亡研究細胞發(fā)生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其細胞發(fā)生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。和凋亡細胞。主要介紹：主要介紹：PI單染色法和單染色法和PI-Annexin V雙染法雙染法 PI單染色法單染色法（Propidium iodidePropidium iodide碘化丙碘化丙啶），啶）， 圖中圖中2N2N代表代表G0/G1G0/G1期細胞期細胞，4N4N代表代表G2/MG2/M期細胞，期細胞，兩者中間代表兩者中間代表S S期細胞。期細胞。這是以這是以2 2倍體和倍體和4 4倍體細倍體細胞為主的流式胞為主的流式DNADNA圖圖在在G G0 0/G/G1 1峰前出現一個峰前出現一個亞亞二倍體峰二倍體峰，即凋亡峰