流式細(xì)胞儀-12.16

1、 流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介逄亞楠逄亞楠2013年年12月月17日日 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 流式細(xì)胞儀（流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry, 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱FCM）是對(duì)）是對(duì)高速直線流動(dòng)的細(xì)高速直線流動(dòng)的細(xì)胞或生物微粒胞或生物微粒進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的儀器進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的儀器,主要包括樣品的液流主要包括樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分選技術(shù)技術(shù)、細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分選技術(shù),計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱FCM）是一項(xiàng)快速檢測(cè)分析）是一項(xiàng)快速檢測(cè)分析單單個(gè)粒子個(gè)粒子多物理特性的高技術(shù)，通常指細(xì)

2、胞通過激光束時(shí)在液流中的多物理特性的高技術(shù)，通常指細(xì)胞通過激光束時(shí)在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以及相對(duì)的熒光強(qiáng)度。特性，即粒子的大小，密度或是內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以及相對(duì)的熒光強(qiáng)度。通過光電系統(tǒng)記錄細(xì)胞的通過光電系統(tǒng)記錄細(xì)胞的散射光信號(hào)散射光信號(hào)和和熒光信號(hào)熒光信號(hào)可得知細(xì)胞特性可得知細(xì)胞特性。= 研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等。微球等。 流式細(xì)胞儀的發(fā)展簡(jiǎn)史流式細(xì)胞儀的發(fā)展簡(jiǎn)史 雛形誕生于雛形誕生于19341934年年,Moldavan,Moldavan提出最早的流式細(xì)胞儀使提出最早的流式細(xì)

3、胞儀使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞流過流過玻璃毛細(xì)管玻璃毛細(xì)管, ,在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù), ,并用光電記錄裝置測(cè)量的并用光電記錄裝置測(cè)量的設(shè)想。設(shè)想。 19531953年年Crosland -TaylorCrosland -Taylor根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律設(shè)計(jì)了根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律設(shè)計(jì)了流動(dòng)室流動(dòng)室。其后經(jīng)過不斷改進(jìn)其后經(jīng)過不斷改進(jìn), ,設(shè)計(jì)了設(shè)計(jì)了光電檢測(cè)設(shè)備光電檢測(cè)設(shè)備和細(xì)胞分選裝置、完成了和細(xì)胞分選裝置、完成了計(jì)算機(jī)與計(jì)算機(jī)與流式細(xì)胞儀的物理連接流式細(xì)胞儀的物理連接及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和分析、開創(chuàng)了細(xì)胞的免疫熒及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和

4、分析、開創(chuàng)了細(xì)胞的免疫熒光染色及檢測(cè)技術(shù)、推廣流式細(xì)胞儀在臨床上的應(yīng)用。光染色及檢測(cè)技術(shù)、推廣流式細(xì)胞儀在臨床上的應(yīng)用。 近近2020年來年來, ,隨著流式細(xì)胞儀及其檢測(cè)技術(shù)和的日臻完善隨著流式細(xì)胞儀及其檢測(cè)技術(shù)和的日臻完善, ,人們?cè)絹碓街铝τ跇尤藗冊(cè)絹碓街铝τ跇悠分苽?、?xì)胞標(biāo)記、軟件開發(fā)等方面的工作品制備、細(xì)胞標(biāo)記、軟件開發(fā)等方面的工作, ,以擴(kuò)大以擴(kuò)大FCMFCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。效果。 流式細(xì)胞儀的組成流式細(xì)胞儀的組成流式細(xì)胞儀主要由三部分組成：流式細(xì)胞儀主要由三部分組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下：其作用如

5、下：液流系統(tǒng)：液流系統(tǒng)：依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。光路系統(tǒng)：光路系統(tǒng)：細(xì)胞由激光激發(fā)，通過光學(xué)濾片產(chǎn)生光信細(xì)胞由激光激發(fā)，通過光學(xué)濾片產(chǎn)生光信號(hào)，并傳送到相應(yīng)的探測(cè)器。號(hào)，并傳送到相應(yīng)的探測(cè)器。 電系統(tǒng)：電系統(tǒng)：把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。對(duì)于有分選裝置的把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。對(duì)于有分選裝置的儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。 BD FACSJazz 流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀的工作原理 1.待測(cè)細(xì)胞以待測(cè)細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞的懸液?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動(dòng)室。色，放入樣品管

6、，吸入流動(dòng)室。 2. 流動(dòng)室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防流動(dòng)室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細(xì)胞排成單列細(xì)胞排成單列由噴嘴中由噴嘴中心噴出，形成心噴出，形成細(xì)胞液柱細(xì)胞液柱。 3.液柱與激光束相交，細(xì)胞上的液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。熒光。熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。 (一一)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的作用是液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)區(qū)，其理想狀態(tài)是把細(xì)胞傳送到激光束的中

7、心。而且在特，其理想狀態(tài)是把細(xì)胞傳送到激光束的中心。而且在特定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞或粒子通過激光束。定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞或粒子通過激光束。在流動(dòng)室內(nèi)細(xì)胞液柱聚焦于鞘液中心，細(xì)胞在此與激光相在流動(dòng)室內(nèi)細(xì)胞液柱聚焦于鞘液中心，細(xì)胞在此與激光相交。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，根據(jù)交。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，根據(jù)層流原理層流原理，在鞘液的約束下，在鞘液的約束下，細(xì)胞排成單列出流動(dòng)室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細(xì)胞液細(xì)胞排成單列出流動(dòng)室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細(xì)胞液柱。這種同軸流動(dòng)的設(shè)計(jì)，使得樣品流和鞘液流形成的流柱。這種同軸流動(dòng)的設(shè)計(jì)，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種束始終保持著一種分層鞘流分層鞘流的

8、狀態(tài)，這個(gè)過程稱為流體聚的狀態(tài)，這個(gè)過程稱為流體聚焦。該原理適用于所有流動(dòng)室。焦。該原理適用于所有流動(dòng)室。 (二二)光路系統(tǒng)光路系統(tǒng)-激光光源與光束形成系統(tǒng)激光光源與光束形成系統(tǒng)目前臺(tái)式目前臺(tái)式FCMFCM，多采用氬離子氣體激，多采用氬離子氣體激光器。激光光器。激光(laser)(laser)是一種相干光源，是一種相干光源，它能提供它能提供單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細(xì)胞快速流動(dòng)，每個(gè)理想光源。由于細(xì)胞快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1s1s左右，左右，每個(gè)細(xì)胞所攜帶

9、熒光物質(zhì)被激發(fā)出的每個(gè)細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞需要足夠發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞需要足夠的光照強(qiáng)度。的光照強(qiáng)度。 激光光束在達(dá)到流動(dòng)室前，先激光光束在達(dá)到流動(dòng)室前，先經(jīng)過透鏡將其聚焦，形成幾何經(jīng)過透鏡將其聚焦，形成幾何尺寸約為尺寸約為22m22m66m66m，即短，即短軸稍大于細(xì)胞直徑的光斑。這軸稍大于細(xì)胞直徑的光斑。這種橢圓形光斑激光能量分布屬種橢圓形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布，為保證樣品中細(xì)胞正態(tài)分布，為保證樣品中細(xì)胞受到的光照強(qiáng)度一致，須將樣受到的光照強(qiáng)度一致，須將樣本流與激光束正交，且相交于本流與

10、激光束正交，且相交于激光能量分布峰值處。激光能量分布峰值處。 (二二)光路系統(tǒng)光路系統(tǒng)-光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)FCMFCM的光學(xué)系統(tǒng)由的光學(xué)系統(tǒng)由分光器分光器，若，若干組干組透鏡透鏡、濾光片濾光片組成，它們組成，它們將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)分別送將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)分別送入到不同的電子測(cè)控器。入到不同的電子測(cè)控器。雙色反光鏡，分光器的一種，雙色反光鏡，分光器的一種，通過通過反射一定范圍的光，透過反射一定范圍的光，透過其余光來實(shí)現(xiàn)分離作用其余光來實(shí)現(xiàn)分離作用濾光片，濾光片，能透過一定波長(zhǎng)的光能透過一定波長(zhǎng)的光，但是沒有反射功能，但是沒有反射功能，放著角度放著角度是與光束成是與光束成9090度度。 “=46

11、0 500 540460 500 540460 500 540LongpassShortpassBandpass濾光片濾光片濾光片濾光片(Filter) ：長(zhǎng)通濾片長(zhǎng)通濾片 Long Pass Filter, LP 短通濾片短通濾片 Short Pass Filter, SP 帶帶 通濾片通濾片 Band Pass Filter, BP （三）電系統(tǒng)（三）電系統(tǒng)-信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng)當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射時(shí)，通過激光照射時(shí)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間號(hào)，這些

12、信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360360度立度立體角發(fā)射，產(chǎn)生體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光散射光和和熒光信號(hào)熒光信號(hào)。 流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到的細(xì)胞參數(shù)流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到的細(xì)胞參數(shù)顆粒度顆粒度細(xì)胞大小細(xì)胞大小= 前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 = 側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（SSCSSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對(duì)復(fù)雜性對(duì)復(fù)雜性 前向角散射光前向角散射光 FSCFALS SensorLaser 側(cè)向角散射光側(cè)向角散射光SSCFALS Sensor90LS SensorLaser 散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)

13、上的散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異差異 - -通常使用通常使用“散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖”來看散射光信號(hào)來看散射光信號(hào) - -散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù) 熒光強(qiáng)度（熒光強(qiáng)度（FL）：細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射）：細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長(zhǎng)不同。出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長(zhǎng)不同。 有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽）有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽） 高高FL細(xì)胞與低細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱）細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱）一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（一般的流式

14、細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可），可測(cè)出三個(gè)測(cè)出三個(gè)FL，即，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀，大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個(gè)或三個(gè)激光光源（裝有兩個(gè)或三個(gè)激光光源（488nm、633nm和和325nm），可測(cè)出），可測(cè)出6個(gè)個(gè)FL。 熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector 定量染色定量染色 熒光信號(hào)大小熒光信號(hào)大小 被標(biāo)記組分含量的定量被標(biāo)記組分含量的定量 多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測(cè)量多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測(cè)量熒光

15、信號(hào)與細(xì)胞特性熒光信號(hào)與細(xì)胞特性 FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光細(xì)細(xì)胞胞懸懸液液異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素得州紅得州紅能量傳遞復(fù)合染料能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料（一）幾種常見的熒光染料 流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析=數(shù)據(jù)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)存儲(chǔ): LIST MODE: LIST MODE=數(shù)據(jù)顯示數(shù)據(jù)顯示: : 直方圖直方圖 ( Histogram )( Histogram )二維點(diǎn)圖二維點(diǎn)圖(Dot Plot)(Dot Plot)等高線圖等高線圖(Co

16、ntour Plot)(Contour Plot)密度圖密度圖 (Density)(Density)三維圖（三維圖（3D Plot3D Plot）等）等FSC SSC FL1 FL2Eventvent 210016024585Event 3300650160720 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖 每一個(gè)細(xì)胞單參數(shù)的測(cè)量數(shù)據(jù)可整理成分布統(tǒng)每一個(gè)細(xì)胞單參數(shù)的測(cè)量數(shù)據(jù)可整理成分布統(tǒng)計(jì)，以分布直方圖計(jì)，以分布直方圖(distribution histogram)(distribution histogram)來顯示。在圖中，來顯示。在圖中，橫坐標(biāo)表示橫坐標(biāo)表示熒光信號(hào)或散射光信號(hào)熒

17、光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度的值，其單位是道數(shù)，相對(duì)強(qiáng)度的值，其單位是道數(shù)，橫坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的，縱坐標(biāo)一般是橫坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的，縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù) 。 雙參數(shù)數(shù)據(jù)雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示是用于表達(dá)來自同一細(xì)胞的顯示是用于表達(dá)來自同一細(xì)胞兩個(gè)參數(shù)兩個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，常用的表達(dá)方法有二維點(diǎn)圖與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，常用的表達(dá)方法有二維點(diǎn)圖(dot (dot plot)plot)、等高線圖、等高線圖(contour plot)(contour plot)、二維密度圖、二維密度圖(density plot)(density plot)。在二維圖中，。在二維圖中，X X坐標(biāo)為

18、某細(xì)胞一個(gè)參坐標(biāo)為某細(xì)胞一個(gè)參數(shù)的數(shù)值，而數(shù)的數(shù)值，而Y Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的數(shù)值。從雙參坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的數(shù)值。從雙參數(shù)圖形中可以將各細(xì)胞亞群區(qū)分開，同時(shí)可獲得細(xì)胞數(shù)圖形中可以將各細(xì)胞亞群區(qū)分開，同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息。相關(guān)的重要信息。 外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖 等高圖和密度圖分析等高圖和密度圖分析 三維圖分析三維圖分析 細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)=細(xì)胞大小細(xì)胞大小=細(xì)胞粒度細(xì)胞粒度=細(xì)胞表面面積細(xì)胞表面面積=核漿比例核漿比例=DNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期=RNA含量含量=蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量=染色體分析染色體分析 細(xì)胞功能細(xì)胞功能=細(xì)胞表面細(xì)胞表面

19、/胞漿胞漿/核的特異核的特異性抗原性抗原=細(xì)胞活性細(xì)胞活性=細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子=酶活性酶活性=激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)=細(xì)胞受體細(xì)胞受體=細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用流式細(xì)胞儀的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用 細(xì)胞凋亡研究細(xì)胞凋亡研究細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn)，程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。和凋亡細(xì)胞。主要介紹：主要介紹：PI單染色法和單染色法和PI-Annexin V雙染法雙染法 PI單染色法單染色法（Propidium iodidePropidium iodide碘化丙碘化丙啶），啶）， 圖中圖中2N2N代表代表G0/G1G0/G1期細(xì)胞期細(xì)胞，4N4N代表代表G2/MG2/M期細(xì)胞，期細(xì)胞，兩者中間代表兩者中間代表S S期細(xì)胞。期細(xì)胞。這是以這是以2 2倍體和倍體和4 4倍體細(xì)倍體細(xì)胞為主的流式胞為主的流式DNADNA圖圖在在G G0 0/G/G1 1峰前出現(xiàn)一個(gè)峰前出現(xiàn)一個(gè)亞亞二倍體峰二倍體峰，即凋亡峰