谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備

1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備及動力學(xué)研究及動力學(xué)研究 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： （一）（一）親和層析法制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶親和層析法制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶 （二）測定酶活力、米氏常數(shù)和最大反（二）測定酶活力、米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度應(yīng)速度 （三）（三）Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量，計(jì)酚法測定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算比活力算比活力（一）測定酶活力的原理（一）測定酶活力的原理 酶促反應(yīng)速度：酶促反應(yīng)速度：酶促反應(yīng)體系復(fù)雜，影響酶促反應(yīng)速度的因素很多，包括底物濃度、酶濃度、產(chǎn)物濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等影響因素。酶促反應(yīng)速度通常用在一定條件下，以單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示，用產(chǎn)物濃

2、度對反應(yīng)時間作圖，得到酶促反應(yīng)速度曲線。 從圖中可以看到，反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時間的延長，由于底物濃度降低，產(chǎn)物反饋抑制，逆反應(yīng)速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反應(yīng)速度逐漸下降，最后完全停止。在測定酶促反應(yīng)速度時，要避免以上干擾因素，必須在酶促反應(yīng)初期進(jìn)行，在最初這段時間內(nèi)的反應(yīng)速度稱之為反應(yīng)初速度，在過量的底物存在下，反應(yīng)初速度與酶濃度成正比。在酶促反應(yīng)速度曲線上，過原點(diǎn)做切線，其斜率即為初速度。 酶促反應(yīng)速度的單位是：濃度/單位時間。 酶活力酶活力 是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力單位定義為：在一定條件下，一定時間內(nèi)，將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量，酶活

3、力的大小即酶含量的多少。通常用最適條件下酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度來衡量酶活力的大小，酶催化的反應(yīng)速度越大，酶活力越高，反之，酶活力越低，所以酶活力的測定就是測定酶促反應(yīng)的速度，即單位時間內(nèi)底物或產(chǎn)物的濃度變化。 國際單位國際單位 酶活力單位統(tǒng)一用國際單位（international unit，簡寫為IU）來表示，規(guī)定：在最適反應(yīng)條件（25，最適緩沖液離子強(qiáng)度和pH值，最適底物濃度）下，每分鐘內(nèi)催化1 mol底物轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)物所需要的酶量為一個國際單位，即1IU = 1mol/min。 比活力比活力 為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示。酶的比活力在酶學(xué)研究

4、中用來衡量酶的純度，對于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。利用比活力的大小可以用來比較酶制劑中單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力，是表示酶的純度高低的一個重要指標(biāo)。 酶活力的測定酶活力的測定 酶活性的測定應(yīng)貫穿于酶分離純化過程的始終。在酶的分離純化過程中的每一個步驟前后，通過測定酶活力，了解總活力的回收和比活力提高的倍數(shù)，為我們選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x純化的方法和條件提供直接的依據(jù)。酶分離純化的效果可以用總活力的回收率和比活力提高的倍數(shù)作為指標(biāo)，總活力損失少、比活力提高倍數(shù)多即為有效的純化方法。 酶活力的測定一般是通過測定酶促反應(yīng)的速度而確定，而酶催化的反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)產(chǎn)物的增加量或底物的減少量來表示

5、。測定方法主要是根據(jù)產(chǎn)物或底物的物理化學(xué)特性來決定具體的測定方法，分光光度法具有操作簡便，時間短，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是一種最重要的酶活力的測定方法。 本實(shí)驗(yàn)采用1-氯2，4-二硝基苯（CDNB）和還原型谷胱甘肽作為酶的底物，分光光度法記錄酶促反應(yīng)生成產(chǎn)物GS-DNB引起的光吸收增加值，通過在340nm連續(xù)測定反應(yīng)過程中產(chǎn)物光吸收值的變化，做出光吸收時間曲線，從而計(jì)算出酶活力。反應(yīng)式為：（二）測定（二）測定K Kmm 和和V V的原理的原理 Km和最大反應(yīng)速度是酶的特征常數(shù)，不同的酶Km和 V不同，受底物、pH、溫度、離子強(qiáng)度等因素的影響。將米氏方程的形式加以改變，可以得到幾種方程形式，在特定條件

6、下測得不同底物濃度S時相應(yīng)的初速度v，用作圖法測定Km和V。米氏方程是從單底物酶促反應(yīng)推導(dǎo)出來的，但實(shí)際上這種反應(yīng)很少。在多底物反應(yīng)中，如果只有一種底物濃度發(fā)生變化，其他底物濃度保持不變，那么就可以將它看成單底物反應(yīng)，利用米氏方程的幾種形式測定Km和V值。 本實(shí)驗(yàn)采用終止法，即在酶和底物反應(yīng)達(dá)到預(yù)定的時間（1min）時，立即加入強(qiáng)酸終止酶促反應(yīng)，在這段反應(yīng)時間里產(chǎn)物的生成量基本呈線性增加，用這段反應(yīng)時間內(nèi)的平均速度代替反應(yīng)初速度，利用作圖法，可以很方便地求出Km和V。 dabc操作步驟操作步驟實(shí)驗(yàn)用具（一組）：實(shí)驗(yàn)用具（一組）： 加樣器(200L)：CDNB、GSH(60mmol/L)、酶 1

7、mL注射器（塑料）：TCA （測定Km和V 時使用） 比色杯：2個 秒表：1塊（測定Km和V 時使用） 試劑（一臺）：試劑（一臺）： PB：40m L CDNB、GSH（60mmol/L）、TCA：小離心管 GSH（2mmol/L）：10m L調(diào)整分光光度計(jì)的參數(shù)：調(diào)整分光光度計(jì)的參數(shù)： wavelength：338nm delay time：30秒 cycles：8 （一）酶活力的測定（一）酶活力的測定 室溫條件下測定，調(diào)好紫外分光光度計(jì)，取兩個比色杯，按室溫條件下測定，調(diào)好紫外分光光度計(jì)，取兩個比色杯，按下表加樣：下表加樣：010.1mol/L PB(pH6.5)2.9mL2.9mL*60

8、mmol/L CDNB50L50L60mmol/L GSH 50L50L混勻，放入分光光度計(jì)校零 酶液0 x L加入酶同時按“run”，立即混勻，進(jìn)行反應(yīng)測定步驟1.兩個比色杯分別加入PB 、底物CDNB和GSH（60mmol/L），混勻；2. 放在分光光度計(jì)中的空白和“1”位上，注意光路方向，按“zero base”，等待儀器校零；3. 將“1”位上的比色杯拿出，加入酶的同時按“run”，立即混勻，放入分光光度計(jì)中；4. 儀器自動讀8個數(shù)（30s讀一次），共反應(yīng)4min。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1. 酶液的稀釋：酶液的稀釋：取部分酶液用PB稀釋510倍，混勻。2. 磷酸緩沖液：磷酸緩沖液：加入PB的

9、量與酶量有關(guān)，要求終體積為3mL。 3. 加酶量加酶量：要求A340nm/min（第二個數(shù)）在0.20.5之間，否則需要調(diào)整加酶量重新測定。4. 空白：空白：第二組或重做時，空白比色杯不動，只需將“1”位上比色杯重新測定。5. 重做：重做：只需將“1”位比色杯洗凈，加入緩沖液和底物，混勻，校零，加酶，“run”，混勻，測定。數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理1. 做出時間-光吸收關(guān)系曲線，過原點(diǎn)做切線，求出A340nm/min，計(jì)算酶活力。2. 酶活力的定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)催化1 mol底物轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)物所需要的酶量為一個單位，即1IU = 1mol/min。計(jì)算公式為： 式中A為每分鐘光吸收的變化值

10、，v為酶促反應(yīng)體積(3mL)，為產(chǎn)物的消光系數(shù)(9.6L/mmolcm)，L為比色杯的光程(1cm)。LvAIUGST )(活力單位活力單位 （二）（二）Km和和V的測定的測定 取六支試管，按下表加樣：取六支試管，按下表加樣：0123452mmol/L GSH/mL00.150.300.601.20 2.4060mmol/L CDNB/L5050505050500.1mol/L PB/mL2.852.702.552.251.65 0.45酶液/Lxxxxxx反應(yīng)1min后加入50%的TCA 100L終止反應(yīng)A340nm/min測定步驟測定步驟 1. 每根試管加入CDNB、GSH（2mmol/L）、PB后，加入酶，同時用秒表計(jì)時，立即混勻，靜置，1分鐘時加入50%的TCA，混勻，終止反應(yīng)； 2. 將儀器 delay time調(diào)為0，cycles調(diào)為1，空白同酶活性測定，用0試管溶液放在“1”位上校零，測定其他各管的吸光值。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1. 酶液的稀釋：酶液的稀釋： 酶的稀釋倍數(shù)與酶活力測定一致 。2. 磷酸緩沖液：磷酸緩沖液：加入PB的量與酶量有關(guān)，要求終體積為3mL。 3. 加酶量加酶量：根據(jù)前面酶活力的測定決定加酶量，使A340nm/min在0.050.5之間。4. 儀器參數(shù)調(diào)整：儀器參數(shù)調(diào)整：將delay time調(diào)為0，cycles調(diào)為1。5. 空