蛋白質(zhì)組學(xué)WB

1、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室易發(fā)平易發(fā)平碩士生學(xué)位課程：蛋白質(zhì)組學(xué)碩士生學(xué)位課程：蛋白質(zhì)組學(xué)-5候選蛋白質(zhì)的驗(yàn)證候選蛋白質(zhì)的驗(yàn)證蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)酶解酶解肽的混合物肽的混合物PMF搜索引擎Search engine 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果搜索結(jié)果驗(yàn)證驗(yàn)證蛋白質(zhì)組研究路線蛋白質(zhì)組研究路線RNAi實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程免疫熒光法免疫熒光法授課內(nèi)容授課內(nèi)容4流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)免疫印跡法免疫印跡法免疫組化法免疫組化法1231候選蛋白質(zhì)的驗(yàn)證候選蛋白質(zhì)的驗(yàn)證一一1蛋白質(zhì)與生物大分子蛋白質(zhì)與生物大分子的相互作用的相互作用二二下一講下一講免疫印跡法免疫印跡法blotting

2、實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 印跡法印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。 1975年，年，英國英國 Edwin Mellor Southern建立了將建立了將DNA轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特雜交檢測特定的定的DNA片段的方法，稱為片段的方法，稱為Southern印跡法印跡法。免疫印跡法免疫印跡法Southern Blotting Northern blottingWestern BlottingEaste

3、rn BlottingSouthwestern blottingfar-western blotting2D電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)膜，特異的探針去檢測電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)膜，特異的探針去檢測 SDS-PAGE分離蛋白分離蛋白,轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜,尿素去除尿素去除SDS,蛋白復(fù)性蛋白復(fù)性,特定特定DNA探針檢測。探針檢測。與目標(biāo)蛋白結(jié)合的非抗體蛋白質(zhì)檢測與目標(biāo)蛋白結(jié)合的非抗體蛋白質(zhì)檢測檢測對象是檢測對象是DNA檢測對象是檢測對象是RNA檢測對象是特定蛋白質(zhì)檢測對象是特定蛋白質(zhì)檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾 檢測檢測DNA和蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)相互作用 檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用檢測蛋白質(zhì)之間的

4、相互作用堿基互補(bǔ)配對堿基互補(bǔ)配對 對對象象已已知知確確定定對象對象未知未知免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 基本原理基本原理在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測?？乖贵w之間特異的免疫反應(yīng)?？乖贵w之間特異的免疫反應(yīng)。 免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 一般流程一般流程l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備S

5、DS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳免疫印跡法免疫印跡法成功的要素成功的要素科學(xué)的對照科學(xué)的對照免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 流程詳解流程詳解l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳（1）免疫印跡法免疫印跡法之之 蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白1.1.水溶液提取法水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶針對

6、水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。鹽析。鹽析沉淀出的蛋白質(zhì)一般保持著天然構(gòu)象。常用的中性鹽是硫酸銨。沉淀出的蛋白質(zhì)一般保持著天然構(gòu)象。常用的中性鹽是硫酸銨。 細(xì)胞裂解液：細(xì)胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin ， pH8.0 免疫印跡法免疫印跡法蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備2

7、.低溫有機(jī)溶劑提取法低溫有機(jī)溶劑提取法蛋白質(zhì)處在一定量的有機(jī)溶劑中，分子間極性基團(tuán)蛋白質(zhì)處在一定量的有機(jī)溶劑中，分子間極性基團(tuán)的靜電引力增強(qiáng)，水化作用降低，蛋白質(zhì)聚集而沉的靜電引力增強(qiáng)，水化作用降低，蛋白質(zhì)聚集而沉淀。對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)淀。對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。該法沉淀蛋溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。該法沉淀蛋白質(zhì)的選擇性較高，不需脫鹽。白質(zhì)的選擇性較高，不需脫鹽。免疫印跡法免疫印跡法蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備3.水溶性多聚物沉淀法水溶性多聚物沉淀法 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（）、葡聚糖（DEX）等溶于

8、水中，）等溶于水中，蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)與多聚物分子中的氧或氫氧根結(jié)合，蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)與多聚物分子中的氧或氫氧根結(jié)合，形成二者的復(fù)合體，從溶液中沉淀析出。改變多聚物形成二者的復(fù)合體，從溶液中沉淀析出。改變多聚物的濃度可分段沉淀出不同的蛋白質(zhì)。的濃度可分段沉淀出不同的蛋白質(zhì)。4. 通過層析或電洗脫法、色譜等制備目的蛋白通過層析或電洗脫法、色譜等制備目的蛋白2-DE 分離蛋白分離蛋白免疫印跡法免疫印跡法蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備病病 毒毒細(xì)細(xì)胞胞葉葉綠綠體體細(xì)胞膜細(xì)胞膜protein2-DE鑒定鑒定驗(yàn)證驗(yàn)證免疫印跡法免疫印跡法目的蛋白質(zhì)的量較多目的蛋白質(zhì)的量較多，至少占總蛋白量的至少占總蛋白量的1

9、%，常為，常為5%-9%，使純化易于進(jìn)行。，使純化易于進(jìn)行?？衫萌诤系鞍踪|(zhì)的特性進(jìn)行純化?？衫萌诤系鞍踪|(zhì)的特性進(jìn)行純化。利用標(biāo)示物利用標(biāo)示物（tag）的特性，用親合層析柱，可快速分離純化融）的特性，用親合層析柱，可快速分離純化融合蛋白質(zhì)，最后切除合蛋白質(zhì)，最后切除tag即可。很多表達(dá)載體已帶有即可。很多表達(dá)載體已帶有tag的的DNA序列。序列。重組蛋白的特點(diǎn)重組蛋白的特點(diǎn)免疫印跡法免疫印跡法包含體的形成。包含體的形成。主要出現(xiàn)在大腸桿菌等原核生物中，溶解度很主要出現(xiàn)在大腸桿菌等原核生物中，溶解度很小的蛋白都進(jìn)入包含體中，包含體中的蛋白質(zhì)主要是外來性的小的蛋白都進(jìn)入包含體中，包含體中的蛋白質(zhì)

10、主要是外來性的重組蛋白。離心的方法先收集包含體，再從中分離蛋白。重組蛋白。離心的方法先收集包含體，再從中分離蛋白。分泌蛋白質(zhì)的生成。分泌蛋白質(zhì)的生成。目的蛋白前加入信號肽序列，可使真核細(xì)目的蛋白前加入信號肽序列，可使真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，因其中的蛋白質(zhì)種類較少而胞內(nèi)表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，因其中的蛋白質(zhì)種類較少而使目的蛋白的分離純化得以簡化。大腸桿菌等有細(xì)胞壁的細(xì)胞使目的蛋白的分離純化得以簡化。大腸桿菌等有細(xì)胞壁的細(xì)胞可分泌至周質(zhì)中，收集細(xì)胞后，改變滲透壓，同時(shí)加入少量溶可分泌至周質(zhì)中，收集細(xì)胞后，改變滲透壓，同時(shí)加入少量溶菌酶破壞細(xì)胞壁，提取周質(zhì)后，純化目的蛋白。菌酶破壞細(xì)胞

11、壁，提取周質(zhì)后，純化目的蛋白。重組蛋白的特點(diǎn)重組蛋白的特點(diǎn)免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 蛋白樣品的定量蛋白樣品的定量生物化學(xué)所學(xué)的方法都可以。凱氏定氮法、生物化學(xué)所學(xué)的方法都可以。凱氏定氮法、雙縮脲法、福林雙縮脲法、福林-酚法和紫外吸收法。酚法和紫外吸收法。免疫印跡法免疫印跡法蛋白樣品的定量蛋白樣品的定量紫外吸收法紫外吸收法：蛋白質(zhì)在：蛋白質(zhì)在280nm左右有吸收高峰（因色氨酸和左右有吸收高峰（因色氨酸和酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量各異，因此各異，因此A280值不同。值不同

12、。Bradford法法 （適合小分子多肽）（適合小分子多肽） 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。(上樣量上樣量)免疫印跡法免疫印跡法蛋白樣品的定量蛋白樣品的定量凱氏定氮法：凱氏定氮法：蛋白質(zhì)中氮在濃硫酸作用下生成銨鹽，與濃蛋白質(zhì)中氮在濃硫酸作用下生成銨鹽

13、，與濃NaOH作用，產(chǎn)生氨氣，吸收于標(biāo)準(zhǔn)硼酸溶液中，用標(biāo)準(zhǔn)酸作用，產(chǎn)生氨氣，吸收于標(biāo)準(zhǔn)硼酸溶液中，用標(biāo)準(zhǔn)酸直接滴定，測出含氮量，按蛋白質(zhì)恒定的含氮量（直接滴定，測出含氮量，按蛋白質(zhì)恒定的含氮量（16%），），換算出蛋白的含量。換算出蛋白的含量。福林福林-酚法酚法（Lowry法）：蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸、蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸殘基與半胱氨酸殘基與Cu2+結(jié)合，生成復(fù)合物，進(jìn)而還原酚試劑結(jié)合，生成復(fù)合物，進(jìn)而還原酚試劑的磷鉬酸，生成藍(lán)色化合物，用比色法測定。的磷鉬酸，生成藍(lán)色化合物，用比色法測定。免疫印跡法免疫印跡法蛋白樣品的定量蛋白樣品的定量BCA法法 （適合微量、含少量化學(xué)物質(zhì)的

14、樣品）（適合微量、含少量化學(xué)物質(zhì)的樣品）1 靈敏度高，檢測濃度下限達(dá)到靈敏度高，檢測濃度下限達(dá)到25g/ml，最小檢測蛋白量，最小檢測蛋白量達(dá)到達(dá)到0.5g，待測樣品體積為，待測樣品體積為1-20l 。 2 不受絕大部分樣品中去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，如：不受絕大部分樣品中去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，如：SDS，Triton X-100，Tween 。 3 在在20-2000g/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。 4 檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法。檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法。 5 會受螯合劑和較高濃度還原劑的影響：如會受螯合劑和較高濃度

15、還原劑的影響：如EDTA、DTT、巰、巰基乙醇?；掖肌Ｆ渌唐坊脑噭┖幸部蓽y蛋白含量。其他商品化的試劑盒也可測蛋白含量。免疫印跡法免疫印跡法蛋白樣品的定量蛋白樣品的定量試劑：考馬斯亮藍(lán)工作液，試劑：考馬斯亮藍(lán)工作液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（鹽酸，雙蒸水，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（ 將將10mg/ml蛋白溶液稀釋至蛋白溶液稀釋至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）。）管號管號012345678ddH2O905055606570758085蛋白標(biāo)蛋白標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)液04035302

16、52015105HCl101010101010101010免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 流程詳解流程詳解l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDS-PAGE（2）之之 SDS-PAGEWestern Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)免疫印跡法免疫印跡法SDS-PAGE 原理原理蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)進(jìn)行PAGE時(shí)，其遷移率取決于所帶的凈電荷時(shí)，其遷移率取決于所帶的凈電荷量以及分子的大小、形狀等因素。如在膠中加入量以及分子的大小、形狀等因素。如在膠中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使蛋白分

17、子中的二硫鍵還原。和巰基乙醇后，巰基乙醇使蛋白分子中的二硫鍵還原。 SDS使蛋白的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分使蛋白的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。大量的復(fù)合物。大量的SDS結(jié)合后，結(jié)合后，各種蛋白都帶上相同的負(fù)電荷，大大超過了蛋白原有各種蛋白都帶上相同的負(fù)電荷，大大超過了蛋白原有的電荷量，因而原有的電荷差別可忽略。所以，的電荷量，因而原有的電荷差別可忽略。所以，蛋白蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的分子質(zhì)量質(zhì)的遷移率主要取決于它的分子質(zhì)量。免疫印跡法免疫印跡法SDS-PAGE 凝膠成份凝膠成份丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺（亞甲

18、雙丙烯酰胺（Bis） 聚合而成的分子篩，孔徑大小由二者的總濃度及聚合而成的分子篩，孔徑大小由二者的總濃度及Bis的濃度決定。的濃度決定。Bis一定的情況下，總濃度越高，孔一定的情況下，總濃度越高，孔徑越小。徑越小。免疫印跡法免疫印跡法SDS-PAGE 凝膠成份凝膠成份TEMED過硫酸銨（過硫酸銨（APS）(時(shí)間時(shí)間) TEMED 及及APS激發(fā)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成。分子氧阻止鏈的延激發(fā)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成。分子氧阻止鏈的延長，防礙聚合作用。所以凝膠液需排氣，在水或水飽合異丁長，防礙聚合作用。所以凝膠液需排氣，在水或水飽合異丁醇隔絕空氣的條件下反應(yīng)。醇隔絕空氣的條件下反應(yīng)。SDS配膠的配膠的Tris緩沖液緩

19、沖液Tris-甘氨酸電泳緩沖液甘氨酸電泳緩沖液免疫印跡法免疫印跡法凝膠濃度（）凝膠濃度（）線性分離范圍（線性分離范圍（KD)KD)151512-4312-43101016-6816-687.57.536-9436-945.05.057-21257-212凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度與蛋白分離范圍免疫印跡法免疫印跡法濃縮膠濃縮蛋白質(zhì)的原理濃縮膠濃縮蛋白質(zhì)的原理 在不連續(xù)在不連續(xù)SDS-PAGE時(shí)時(shí),采用了兩種緩沖液濃度、采用了兩種緩沖液濃度、pH值和值和凝膠孔徑，上層膠為凝膠孔徑，上層膠為濃縮膠濃縮膠（大孔徑大孔徑），下層膠為），下層膠為分離膠分離膠（分子篩）（分子篩）。 濃縮膠中的緩沖對為濃

20、縮膠中的緩沖對為Tris-HCl，電泳，電泳Buffer的緩沖對為的緩沖對為Tris-甘氨酸。電泳時(shí)，膠中的甘氨酸。電泳時(shí)，膠中的Cl-移動最快，移動最快， 電泳緩沖液中電泳緩沖液中的甘氨酸（的甘氨酸（pI為為6.0）在濃縮膠）在濃縮膠pH6.8時(shí)解離度很小，故移動時(shí)解離度很小，故移動最慢。而最慢。而SDS-Protein 在無分子篩效應(yīng)的大孔徑濃縮膠中移在無分子篩效應(yīng)的大孔徑濃縮膠中移動速度居第二。即動速度居第二。即泳動速度為泳動速度為Cl- 蛋白蛋白甘氨酸離子。甘氨酸離子。免疫印跡法免疫印跡法濃縮膠濃縮蛋白質(zhì)的原理濃縮膠濃縮蛋白質(zhì)的原理 隨著電泳的進(jìn)行，隨著電泳的進(jìn)行， Cl-與后面的蛋白

21、帶與后面的蛋白帶之間形成電之間形成電勢梯度，同樣的勢梯度，同樣的蛋白與甘氨酸離子蛋白與甘氨酸離子之間也會之間也會形成電勢梯形成電勢梯度度。高電勢使蛋白質(zhì)和甘氨酸離子的移動速度加快，形高電勢使蛋白質(zhì)和甘氨酸離子的移動速度加快，形成一個(gè)迅速移動界面。成一個(gè)迅速移動界面。由于蛋白質(zhì)的有效泳動度居第二，由于蛋白質(zhì)的有效泳動度居第二，使使蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)聚集在這個(gè)移動界面附近，聚集在這個(gè)移動界面附近，被濃縮成一狹窄的被濃縮成一狹窄的中間層。中間層。所以，加樣后，通過此濃縮過程，都能形成一所以，加樣后，通過此濃縮過程，都能形成一狹窄的區(qū)帶。狹窄的區(qū)帶。免疫印跡法免疫印跡法電泳時(shí)通常推薦在電泳時(shí)通常推薦在上層膠

22、時(shí)使用低電壓恒壓電泳上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳,而在而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。 通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。SDS-PAGE 電壓設(shè)置電壓設(shè)置免疫印跡法免疫印跡法*預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)包含了從包含了從19kD到到117kD共共6種純化的預(yù)染藍(lán)色蛋白質(zhì)，種純化的預(yù)染藍(lán)色蛋白質(zhì)，可以直接使用

23、，無需煮沸。每次上樣可以直接使用，無需煮沸。每次上樣5-10微升，就可以在微升，就可以在電泳時(shí)、電泳后或轉(zhuǎn)電泳時(shí)、電泳后或轉(zhuǎn)膜后觀察到非常清楚的蛋白條帶。膜后觀察到非常清楚的蛋白條帶。SDS-PAGE 預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白免疫印跡法免疫印跡法1）電壓。）電壓。小的電壓會使膠的分子篩效應(yīng)得到充小的電壓會使膠的分子篩效應(yīng)得到充 分發(fā)揮，電壓越小，條帶越漂亮。分發(fā)揮，電壓越小，條帶越漂亮。SDS-PAGE 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)免疫印跡法免疫印跡法SDS-PAGE 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)SDS-PAGE結(jié)果結(jié)果免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 流程詳解流程詳解l轉(zhuǎn)膜

24、轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳（3）Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之之 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)膜方法半干法半干法按：用緩沖液濕潤濾紙按：用緩沖液濕潤濾紙3張、膜、凝膠、緩沖液濕張、膜、凝膠、緩沖液濕潤濾紙潤濾紙3張順序放置，電轉(zhuǎn)張順序放置，電轉(zhuǎn)1030min。但高分子。但高分子量的蛋白轉(zhuǎn)移效率較低。量的蛋白轉(zhuǎn)移效率較低。免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之

25、轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)膜方法濕法濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜?；蜻^夜。具體條件需考慮蛋白分子大小及樣品中蛋白實(shí)際含量高低。具體條件需考慮蛋白分子大小及樣品中蛋白實(shí)際含量高低。免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 轉(zhuǎn)膜后檢測轉(zhuǎn)膜后檢測麗春紅麗春紅S染色染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次，脫色。素濾膜，換水幾次，脫色。印度墨汁染色印度墨汁染色只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記只用于放射性標(biāo)記抗體

26、或放射性標(biāo)記A蛋白探針的蛋白探針的Western印跡過程。印跡過程。免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 流程詳解流程詳解l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳（4）免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 封閉封閉- Why?抗體抗體蛋白蛋白膜膜顯色信號顯色信號免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 封閉封閉目的：目的：防止抗體與膜的非特異性結(jié)合。防止抗體與膜的非特異性結(jié)合。脫脂奶

27、粉（脫脂奶粉（5）BSAWestern Blot 膜封閉液（生物試劑公司提供）膜封閉液（生物試劑公司提供）封閉液選擇封閉液選擇在進(jìn)行抗體雜交之前，需要采用在進(jìn)行抗體雜交之前，需要采用異源性蛋白質(zhì)先對轉(zhuǎn)異源性蛋白質(zhì)先對轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉印膜進(jìn)行封閉，防止免疫試劑的非特異性吸附，從而，防止免疫試劑的非特異性吸附，從而降低背景，增加靈敏度，提高信噪比。常用封閉物有降低背景，增加靈敏度，提高信噪比。常用封閉物有脫脂奶粉和脫脂奶粉和BSA（稀釋于不同的緩沖液中），但不（稀釋于不同的緩沖液中），但不同的抗原同的抗原-抗體反應(yīng)，封閉條件均不相同?？贵w反應(yīng)，封閉條件均不相同。牛奶封閉液可能含有能與抗山羊類抗體交叉

28、反應(yīng)的牛奶封閉液可能含有能與抗山羊類抗體交叉反應(yīng)的IgG, 由此產(chǎn)生非特異性背景。建議使用由此產(chǎn)生非特異性背景。建議使用casein（牛（牛奶中的酪蛋白）或奶中的酪蛋白）或BSA做封閉。做封閉。免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 流程詳解流程詳解l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳（5）免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 一抗雜交一抗雜交n把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑

29、料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入的量加入加入一抗加入一抗溶液溶液與濾膜溫育。與濾膜溫育。37一小時(shí)，一小時(shí)，4 過夜。過夜。n洗去未結(jié)合的一抗：洗去未結(jié)合的一抗：回收一抗溶液回收一抗溶液，用，用PBS漂洗漂洗液濾膜液濾膜3次，每次次，每次10min?；厥找豢谷芤夯厥找豢谷芤?？n在在Western或免疫熒光染色等操作后，請注意回收稀釋或免疫熒光染色等操作后，請注意回收稀釋的抗體。的抗體。回收的抗體回收的抗體在進(jìn)行在進(jìn)行Western或免疫熒光染色時(shí)或免疫熒光染色時(shí)至至少可以重復(fù)使用少可以重復(fù)使用10次。次。稀釋后的抗體，包括已經(jīng)使用過的稀釋后的抗體，包括

30、已經(jīng)使用過的稀釋抗體，稀釋抗體，4保存。保存。n回收后重復(fù)使用的抗體，使用方法同新鮮稀釋的抗體。回收后重復(fù)使用的抗體，使用方法同新鮮稀釋的抗體。如果在重復(fù)使用過程中發(fā)現(xiàn)抗體出現(xiàn)輕微混濁現(xiàn)象，可以如果在重復(fù)使用過程中發(fā)現(xiàn)抗體出現(xiàn)輕微混濁現(xiàn)象，可以10000g離心離心1-3分鐘，取上清用于后續(xù)檢測。如果回收的分鐘，取上清用于后續(xù)檢測。如果回收的抗體出現(xiàn)明顯的絮狀物或長霉長菌等情況，則可以考慮廢抗體出現(xiàn)明顯的絮狀物或長霉長菌等情況，則可以考慮廢棄該抗體。棄該抗體。一抗雜交一抗雜交-一抗選擇一抗選擇n免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位

31、），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你性會消失。如果你所用的抗體識別的是所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是個(gè)氨基酸，也就是線性表位線性表位，那么這種抗體，那么這種抗體可同時(shí)用于可同時(shí)用于免疫組化和免疫組化和Western，而，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化只能用于免疫組化

32、。一般抗體說明書上都有注明此種抗。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。體識別的氨基酸區(qū)間。 單抗：識別單個(gè)抗原表位，所以特異性高單抗：識別單個(gè)抗原表位，所以特異性高。但如果。但如果所識別的抗原表位被破壞，則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這所識別的抗原表位被破壞，則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也是單抗的缺點(diǎn)之一。也是單抗的缺點(diǎn)之一。 多抗：多抗：雖然存在交叉反應(yīng)的問題，但由于雖然存在交叉反應(yīng)的問題，但由于識別多個(gè)識別多個(gè)抗原表位抗原表位，所以即使有少數(shù)幾個(gè)抗原表位被破壞，所以即使有少數(shù)幾個(gè)抗原表位被破壞，仍然不會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這是多抗的優(yōu)點(diǎn)之一。仍然不會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這是多抗的優(yōu)點(diǎn)之一。一抗雜交一抗雜交-

33、一抗選擇一抗選擇免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 流程詳解流程詳解l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳（6）免疫印跡法免疫印跡法加入用封閉液配制的二抗加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，搖床上緩慢搖動， 37一小時(shí)，一小時(shí)，4 過夜。過夜。n洗去未結(jié)合的二抗洗去未結(jié)合的二抗：倒掉二抗溶液，用：倒掉二抗溶液，用PBS漂漂洗液濾膜洗液濾膜3次，每次次，每次10min。Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 二抗雜交二抗雜交免疫印跡

34、法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 二抗雜交二抗雜交二抗算不算多余？一抗不能顯色嗎？二抗算不算多余？一抗不能顯色嗎？一抗是特異性的，常用單抗。一抗是特異性的，常用單抗。二抗要求廣譜抗體，最好能夠一對多。二抗要求廣譜抗體，最好能夠一對多。 一抗如果是鼠抗人的抗體，二抗應(yīng)該是另一種動一抗如果是鼠抗人的抗體，二抗應(yīng)該是另一種動物抗鼠的抗體，而且物抗鼠的抗體，而且一抗和二抗的動物種屬原則一抗和二抗的動物種屬原則上不應(yīng)該相同上不應(yīng)該相同。一般來說，。一般來說，一抗多用兔抗和鼠抗，一抗多用兔抗和鼠抗，而二抗多用羊抗。而二抗多用羊抗。 免疫印跡法免疫印跡法Western Bl

35、otting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 流程詳解流程詳解l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳（7）免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 底物顯色底物顯色 辣根過氧化物酶法（辣根過氧化物酶法（HRP） 堿性磷酸酶法（堿性磷酸酶法（AP） 化學(xué)發(fā)光顯色法化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 底物顯色底物顯色在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照（在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照（-actin，GAPDH

36、 ），應(yīng)先上目的蛋白的一抗、二抗，），應(yīng)先上目的蛋白的一抗、二抗，顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對照的顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對照的一抗、二抗，顯色、壓片、洗片。一抗、二抗，顯色、壓片、洗片。 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 底物顯色底物顯色DAB、 ECL法都能達(dá)到納克的要求。法都能達(dá)到納克的要求。ECL是一種是一種增強(qiáng)顯色法增強(qiáng)顯色法，靈敏度要高，但顯色麻煩，發(fā)表文，靈敏度要高，但顯色麻煩，發(fā)表文章常用。章常用。DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）和二氨基聯(lián)苯胺）和HRP反應(yīng)產(chǎn)生棕色的反應(yīng)產(chǎn)生棕色的不溶終產(chǎn)物不溶終產(chǎn)物。這種棕色沉淀不溶于酒精和其它有。這種棕色

37、沉淀不溶于酒精和其它有機(jī)溶劑，對于必需使用傳統(tǒng)復(fù)染和封固介質(zhì)的免機(jī)溶劑，對于必需使用傳統(tǒng)復(fù)染和封固介質(zhì)的免疫組化染色應(yīng)用特別理想。疫組化染色應(yīng)用特別理想。常用顯色法的原理常用顯色法的原理Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 底物顯色底物顯色Ecl 顯色原理顯色原理：氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯：氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾米諾衍生物，是最常用的一類化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾在免疫測定中既可用作標(biāo)記物，也可用作過氧化物在免疫測定中既可用作標(biāo)記物，也可用作過氧化物酶的底物。酶的底物。在在Ecl底物中，含有底物中，含有H2O2和魯米諾，在

38、和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來。注意：熒光在一段時(shí)間后會越來越弱。注意：熒光在一段時(shí)間后會越來越弱。常用顯色法的原理常用顯色法的原理免疫印跡法免疫印跡法-成功例子成功例子A.RT-PCR; B. Western blotC.Col I mRNA 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 D. Col I蛋白數(shù)據(jù)分析蛋白數(shù)據(jù)分析免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 Western blotting 可以特異性檢測某個(gè)蛋白質(zhì)分可以特異性檢測某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量和半定量分析，但是不能定位。子，進(jìn)行定量和半定量分析，但是

39、不能定位。定量定量Western Blotting技術(shù)需要具備兩個(gè)必要條技術(shù)需要具備兩個(gè)必要條件。其一：信號必須穩(wěn)定，保證不同時(shí)間點(diǎn)檢測件。其一：信號必須穩(wěn)定，保證不同時(shí)間點(diǎn)檢測都可以得到相同的結(jié)果；其二：信號的強(qiáng)弱必須都可以得到相同的結(jié)果；其二：信號的強(qiáng)弱必須與目標(biāo)蛋白深度成比例關(guān)系。與目標(biāo)蛋白深度成比例關(guān)系。免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)利用紅外激光器產(chǎn)生的激光激發(fā)紅外熒光染料利用紅外激光器產(chǎn)生的激光激發(fā)紅外熒光染料，產(chǎn)，產(chǎn)生的發(fā)射光由高靈敏度光電二極管檢測熒光信號強(qiáng)生的發(fā)射光由高靈敏度光電二極管檢測熒光信號強(qiáng)度。熒光信號一經(jīng)激發(fā)出來就是穩(wěn)定的，不隨

40、時(shí)間度。熒光信號一經(jīng)激發(fā)出來就是穩(wěn)定的，不隨時(shí)間變化；熒光強(qiáng)弱與目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系（濃度變化；熒光強(qiáng)弱與目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系（濃度越高，結(jié)合的染料越多，熒光信號越強(qiáng)），越高，結(jié)合的染料越多，熒光信號越強(qiáng)），根據(jù)熒根據(jù)熒光強(qiáng)弱就可以對蛋白進(jìn)行精確的定量分析。光強(qiáng)弱就可以對蛋白進(jìn)行精確的定量分析。之之 免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)Western blot 的半定量的半定量將圖片掃描保存為電腦文將圖片掃描保存為電腦文件，件，用分析軟件用分析軟件（如：（如：GIS1000）將圖片上每個(gè)特將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化異條帶灰度值數(shù)字化。目的蛋白的灰度值

41、除以內(nèi)參。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH/Actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。表某樣品的目的蛋白相對含量。之之 免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之之 免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能精確定量，有時(shí)會免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能精確定量，有時(shí)會有假陽性。有假陽性。免疫組化定量分析（半定量）：用對免疫組化產(chǎn)物免疫組化定量分析（半定量）：用對免疫組化產(chǎn)物染色，同時(shí)用蘇木對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。鏡下觀察樣品，細(xì)染色，同時(shí)用蘇木對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。鏡下觀察樣品，細(xì)胞核被染上了藍(lán)色，胞漿間有黃色（強(qiáng)陽性

42、的地方會呈現(xiàn)胞核被染上了藍(lán)色，胞漿間有黃色（強(qiáng)陽性的地方會呈現(xiàn)棕黃色）。棕黃色）。根據(jù)細(xì)胞著色深度及陽性細(xì)胞數(shù)根據(jù)細(xì)胞著色深度及陽性細(xì)胞數(shù)分別記分為分別記分為03 分分,著色深度以多數(shù)細(xì)胞呈色程度為準(zhǔn)。常用著色深度以多數(shù)細(xì)胞呈色程度為準(zhǔn)。常用軟件進(jìn)軟件進(jìn)行處理行處理，如，如image pro plus 5.0（IPP5）。）。 免疫印跡法免疫印跡法Western Blotting常見問題分析常見問題分析Western Blotting 常見問題分析常見問題分析不恰當(dāng)?shù)臉悠分苽鋾?dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗不恰當(dāng)?shù)臉悠分苽鋾?dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗新手采用含新手采用含TritonX-100或或NP-40的緩沖液裂解組織或細(xì)

43、胞，的緩沖液裂解組織或細(xì)胞，結(jié)果無蛋白條帶。因?yàn)椴襟E太多，新手無法保證每一步操作結(jié)果無蛋白條帶。因?yàn)椴襟E太多，新手無法保證每一步操作都正確。都正確。SDS-PAGE上樣樣品中蛋白實(shí)際含量較低。上樣樣品中蛋白實(shí)際含量較低。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析SDS-PAGE 不完美不完美u 膠不平？膠不平？u 凝膠漏液？凝膠漏液？ 膠板洗刷干凈膠板洗刷干凈 加入加入APSAPS和和TEMEDTEMED的量要合適的量要合適 加入試劑后搖勻，使其充分混加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻合，防止部分膠塊聚合不均勻 溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z溫度合適，受熱不均勻?qū)?/p>

44、致膠聚合不均勻聚合不均勻 兩塊玻璃板底部要對齊兩塊玻璃板底部要對齊Western Blotting 常見問題分析常見問題分析u 條帶比正常的窄？條帶比正常的窄？u “微笑微笑”或或“倒微倒微笑笑”條帶？條帶？4 4，5 5，6 6，7 7 凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動作輕緩混合均勻，動作輕緩 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲心，以免把上樣帶扭曲 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度鹽濃度 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，膠板底部有氣

45、泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適置是否合適SDS-PAGE 不完美不完美Western Blotting 常見問題分析常見問題分析SDS-PAGE 不完美不完美條帶條帶1、2、3、9的形狀，屬電泳條件比較合適的區(qū)帶，的形狀，屬電泳條件比較合適的區(qū)帶，其余都是電泳條件不太理想所致。其余都是電泳條件不太理想所致。影響區(qū)帶形狀因素：凝膠的孔徑，樣品的鹽濃度，蛋白影響區(qū)帶形狀因素：凝膠的孔徑，樣品的鹽濃度，蛋白質(zhì)的量（如質(zhì)的量（如8，量太多，帶向下垂），電泳過程中產(chǎn)生，量太多，帶向下垂），電泳過程中產(chǎn)生的熱，點(diǎn)樣的位置（如在膠的左、右端的樣品，因電壓

46、的熱，點(diǎn)樣的位置（如在膠的左、右端的樣品，因電壓關(guān)系常出現(xiàn)歪斜），濃縮膠點(diǎn)樣槽的底部不平也造成區(qū)關(guān)系常出現(xiàn)歪斜），濃縮膠點(diǎn)樣槽的底部不平也造成區(qū)帶的歪斜。帶的歪斜。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析SDS-PAGE 不完美不完美條帶呈笑臉狀條帶呈笑臉狀原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。拖尾：樣品溶解不好。拖尾：樣品溶解不好。紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。條帶呈皺眉狀，條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者

47、兩邊聚合不完全。擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析轉(zhuǎn)膜及抗體檢測轉(zhuǎn)膜及抗體檢測u 凝膠腫脹或卷曲？凝膠腫脹或卷曲？u 條帶歪斜或漂移？條帶歪斜或漂移？u 單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？u 轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？ 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡液中浸泡5-10min5-10min 電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍诮Y(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙 確保膜和膠塊之間沒有氣泡確保膜和膠塊

48、之間沒有氣泡 緩沖液中離子濃度太低，電流或電緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫Western Blotting 常見問題分析常見問題分析一抗?jié)舛扔绊懡Y(jié)果一抗?jié)舛扔绊懡Y(jié)果一抗?jié)舛忍撸瑢?dǎo)致沒有特異帶?？赡芘c抗體一抗?jié)舛忍?，?dǎo)致沒有特異帶。可能與抗體-抗原結(jié)合抗原結(jié)合的所謂空間位阻現(xiàn)象有關(guān)，也可能是高濃度抗體導(dǎo)致的的所謂空間位阻現(xiàn)象有關(guān)，也可能是高濃度抗體導(dǎo)致的高背景會洇滅特異信號。高背景會洇滅特異信號。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析背景太高背景太高proteinprotein背景太高背景太高背景較淺背景較淺對比度要好。對比

49、度要好。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析背景太高背景太高膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染封閉不充分封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)叉反應(yīng)抗體濃度過高抗體濃度過高 原原因因?qū)Σ卟咿D(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜完甲醇將膜完全浸濕全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測一抗、二抗的雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度工作濃度Western Blotting 常見問題分析常見問題分析背景太

50、高背景太高從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。對于一些背景較高的抗體，可以在對于一些背景較高的抗體，可以在4 封閉過夜。封閉過夜。 如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。洗滌次數(shù)。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析DAB法顯色中常出現(xiàn)的問題及對策法顯色中常出現(xiàn)的問題及對策(1)膜干燥之后，區(qū)帶顏色變淺，甚至看不見了。膜干燥之后，區(qū)帶顏色變淺，甚至看不見了。 原因原因：這是該區(qū)帶的蛋白量很少

51、所致，屬正常變化。：這是該區(qū)帶的蛋白量很少所致，屬正常變化。 對策對策：如果為了照像，可將膜浸濕，增強(qiáng)信號，但為：如果為了照像，可將膜浸濕，增強(qiáng)信號，但為 了根本解決問題，還需增加點(diǎn)樣量。了根本解決問題，還需增加點(diǎn)樣量。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析DAB法顯色中常出現(xiàn)的問題及對策法顯色中常出現(xiàn)的問題及對策(2)膜一放入顯色液中，顯色液就變色，膜的背景也很深。膜一放入顯色液中，顯色液就變色，膜的背景也很深。 原因原因：二抗反應(yīng)后，膜洗得不干凈，還有過量的過氧化：二抗反應(yīng)后，膜洗得不干凈，還有過量的過氧化物酶或堿性磷酸酶存在；顯色液的溫度過高；顯色液或物酶或堿性磷酸酶

52、存在；顯色液的溫度過高；顯色液或基質(zhì)的濃度過高?；|(zhì)的濃度過高。 對策對策：立即倒掉顯色液，膜用漂洗液充分洗凈之后，重：立即倒掉顯色液，膜用漂洗液充分洗凈之后，重新顯色。但是如果背景顏色已太深，清晰的圖譜已難得到；新顯色。但是如果背景顏色已太深，清晰的圖譜已難得到；將顯色液溫度降低之后，再顯色；將顯色液中各成分的將顯色液溫度降低之后，再顯色；將顯色液中各成分的濃度降低，重新配制。濃度降低，重新配制。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析顯色中常出現(xiàn)的問題及對策顯色中常出現(xiàn)的問題及對策(3)顯色液沒有被污染，但是區(qū)帶顯色迅速，顏色變黑，顯色液沒有被污染，但是區(qū)帶顯色迅速，顏色

53、變黑， 顯色液也變色。顯色液也變色。 原因：原因：不是異常結(jié)果，而是區(qū)帶的蛋白質(zhì)含量高。不是異常結(jié)果，而是區(qū)帶的蛋白質(zhì)含量高。 對策：對策：將顯色液稀釋，使反應(yīng)速度減慢，但最好是將將顯色液稀釋，使反應(yīng)速度減慢，但最好是將 蛋白質(zhì)點(diǎn)樣量減少。蛋白質(zhì)點(diǎn)樣量減少。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析顯色中常出現(xiàn)的問題及對策顯色中常出現(xiàn)的問題及對策(4)顯色時(shí)間已足夠長，但仍不見區(qū)帶出現(xiàn)，顯色液也澄顯色時(shí)間已足夠長，但仍不見區(qū)帶出現(xiàn)，顯色液也澄 清不變色。清不變色。 原因：原因：過氧化物酶或堿性磷酸酶都不存在或已失活過氧化物酶或堿性磷酸酶都不存在或已失活 顯色液有問題。顯色液有問

54、題。 對策：對策：檢查二抗是否有錯(cuò)，膜充分洗凈后，用新配檢查二抗是否有錯(cuò)，膜充分洗凈后，用新配 制抗體反應(yīng)；制抗體反應(yīng)； 重新配制顯色液。重新配制顯色液。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析顯色中常出現(xiàn)的問題及對策顯色中常出現(xiàn)的問題及對策(5)顯色時(shí)間已足夠長，顯色液已變色，但仍不見區(qū)帶出現(xiàn)。顯色時(shí)間已足夠長，顯色液已變色，但仍不見區(qū)帶出現(xiàn)。 原因原因：一抗所對應(yīng)的抗原蛋白質(zhì)不存在，或量很少；：一抗所對應(yīng)的抗原蛋白質(zhì)不存在，或量很少； 一抗和二抗都失活，或二抗不能與一抗反應(yīng)。一抗和二抗都失活，或二抗不能與一抗反應(yīng)。 對策：對策：增大電泳時(shí)的蛋白質(zhì)點(diǎn)樣量；增大電泳時(shí)的蛋白質(zhì)

55、點(diǎn)樣量； 分別確定一抗、二抗活性的有無。如結(jié)合反應(yīng)正分別確定一抗、二抗活性的有無。如結(jié)合反應(yīng)正 常，最后測定抗體的效價(jià)。常，最后測定抗體的效價(jià)。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析不同公司的試劑結(jié)果迥然不同公司的試劑結(jié)果迥然ECL發(fā)光。背景高掩發(fā)光。背景高掩蓋目的條帶。失敗。蓋目的條帶。失敗。同一張膜用同一張膜用TBS-T沖洗，再改用另外沖洗，再改用另外公司的公司的ECL發(fā)光，發(fā)光，曝光后成功。曝光后成功。Western Blotting 常見問題分析常見問題分析雜帶多的原因雜帶多的原因1. 一抗如是多克隆抗體，可以試著降低一抗的濃度；如一一抗如是多克隆抗體，可以試著降低

56、一抗的濃度；如一 抗是單抗，可適當(dāng)降低二抗的濃度抗是單抗，可適當(dāng)降低二抗的濃度2. 最重要的是確保封閉的充分，封閉最好時(shí)間長點(diǎn)，至少最重要的是確保封閉的充分，封閉最好時(shí)間長點(diǎn)，至少2 小時(shí)室溫封閉，時(shí)間允許可小時(shí)室溫封閉，時(shí)間允許可4度過夜封閉度過夜封閉3. 洗膜一定要充分。如是洗膜一定要充分。如是DAB 顯色時(shí)間不要過長，一般顯色時(shí)間不要過長，一般2 分鐘足夠。分鐘足夠。 4. 細(xì)胞傳代次數(shù)過多，促使其蛋白表達(dá)模式的分化。細(xì)胞傳代次數(shù)過多，促使其蛋白表達(dá)模式的分化。5. 蛋白樣品降解或存在二聚體。蛋白樣品降解或存在二聚體。免疫印跡法免疫印跡法膜上蛋白質(zhì)的膜上蛋白質(zhì)的其他用途其他用途氨基酸序列

57、分析氨基酸序列分析作為抗原免疫動物制備抗體作為抗原免疫動物制備抗體免疫熒光法免疫熒光法授課內(nèi)容授課內(nèi)容4流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)免疫印跡法免疫印跡法 免疫組化法免疫組化法1231候選蛋白質(zhì)的驗(yàn)證候選蛋白質(zhì)的驗(yàn)證一一1免疫組化法免疫組化法免疫組化是利用免疫組化是利用抗原與抗體抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、熒光素、酶、金屬離子、同位素金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行，對其進(jìn)行定位、定性及定量定位、定性及定量的的研究，稱為免疫組織化學(xué)。研究

58、，稱為免疫組織化學(xué)。 免疫組化法免疫組化法之之 原理及定義原理及定義免疫組化法免疫組化法免疫組化法免疫組化法之之 抗體抗體單克隆抗體單克隆抗體是一個(gè)是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備。用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備。多克隆抗體多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)動物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。隆所產(chǎn)生的抗體混合物。 免疫組化法免疫組化法免疫組化法免疫組化法之之 標(biāo)本來源標(biāo)本來源主要為主要為組織標(biāo)本組織標(biāo)本和和細(xì)胞標(biāo)本細(xì)

59、胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。 其中其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；是免疫組化中首照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。選的組織標(biāo)本制作方法。 免疫組化法免疫組化法免疫組化法免疫組化法之之 標(biāo)本制作

60、標(biāo)本制作U2Os細(xì)胞系細(xì)胞系A(chǔ)PE1免疫組化染色免疫組化染色-細(xì)胞爬片法細(xì)胞爬片法石蠟切片機(jī)石蠟切片機(jī) 冰凍切片機(jī)冰凍切片機(jī) 免疫組化法免疫組化法免疫組化法免疫組化法之之 主要步驟主要步驟洗載玻片洗載玻片 包埋組織包埋組織 切片切片 脫蠟脫蠟 抗原修復(fù)抗原修復(fù) 血清封閉血清封閉 加一抗加一抗 加二抗加二抗 加顯色劑加顯色劑 復(fù)染復(fù)染 脫水脫水 封片封片 免疫組化法免疫組化法免疫組化法免疫組化法之之 抗原修復(fù)抗原修復(fù) ？ 石蠟切片標(biāo)本均用石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)