欒樹(shù)花微波萃取黃酮類化合物極其抗氧化性能的研究

1、分類號(hào)：學(xué)校代碼：11460學(xué) 號(hào)：06410318南京曉莊學(xué)院本科生畢業(yè)論文欒樹(shù)花微波萃取黃酮化合物極其抗氧化性能的研究 所在院(系)：生物化工與環(huán)境工程學(xué)院 學(xué)生姓名： 朱明娟 指導(dǎo)老師：胡應(yīng)杰研究起止日期：二九年十月 至 二一年五月二一年五月學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：1. 堅(jiān)持以“求實(shí)、創(chuàng)新”的科學(xué)精神從事研究工作。2. 本論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果。3. 本論文中除引文外，所有實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實(shí)的。4. 本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。其他同志對(duì)本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了聲明并表示了謝意作

2、者簽名：日 期：欒樹(shù)花微波萃取黃酮化合物極其抗氧化性能的研究 作者：朱明娟 指導(dǎo)老師：胡應(yīng)杰 中文摘要本文首先以欒樹(shù)花為原料詳細(xì)研究了微波提取黃酮類化合物的條件，建立了最佳提取工藝，然后對(duì)欒樹(shù)花黃酮類提取物的抗氧化活性進(jìn)行了研究，這些都為欒樹(shù)花在保健食品和中藥開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。首先采用微波提取法，研究欒樹(shù)花中黃酮類黃酮類化合物的提取工藝。在提取工藝中，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了微波溫度、微波時(shí)間、微波功率三個(gè)主要因素對(duì)欒樹(shù)花黃酮類化合物提取效率的影響。在單因素的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)L9(34)，得到最佳提取條件為微波溫度70，微波時(shí)間為25min，微波功率為700W。此前通過(guò)AlCl3法確

3、定黃酮類化合物在510nm處有最大吸收波長(zhǎng)。然后在抗氧化實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)不同濃度的VC、蘆丁、硫辛酸、原花青素和欒樹(shù)花黃酮乙醇提取液的還原能力比較、對(duì)羥基自由基(.OH)的清除能力比較、對(duì)雙氧水的清除能力的比較、以及在豬油體系中抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力比較。實(shí)驗(yàn)證明：欒樹(shù)花對(duì)羥基自由基和雙氧水有較強(qiáng)的清除能力，其清除能力隨著溶液濃度的增大而增大；欒樹(shù)花對(duì)多不飽和脂肪酸過(guò)氧化體系有很強(qiáng)的抑制作用，這種抑制作用也隨著反應(yīng)體系中的溶液濃度的增大而增強(qiáng)；從抑制豬油氧化實(shí)驗(yàn)看出，欒樹(shù)花黃酮提取物具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。關(guān)鍵詞：欒樹(shù)花；黃酮；提?。豢寡趸?目錄文獻(xiàn)綜述。11. 前言2. 材料與方法。22.1材

4、料2.2儀器與試劑主要儀器主要試劑2.3方法總黃酮含量的測(cè)定方法欒樹(shù)花總黃酮的提取方法欒樹(shù)花總黃酮抗氧化性能的研究方法3結(jié)果與分析3.1總黃酮測(cè)定方法的建立最佳吸收波長(zhǎng)的確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立3.2微波萃取條件的確定萃取溫度對(duì)總黃酮得率的影響微波萃取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響微波萃取功率對(duì)總黃酮得率的影響總黃酮最佳萃取功率3.3抗氧化試驗(yàn)清除羥基自由基試驗(yàn)清除雙氧水試驗(yàn)抗油脂氧化試驗(yàn)4討論5結(jié)論致謝參考文獻(xiàn)個(gè)人簡(jiǎn)介導(dǎo)師簡(jiǎn)介 中文文摘欒樹(shù)花。黃酮類化合物是指以C6-C3-C6碳骨架為基本組成的一類化合物的總稱，這類含有羊雜環(huán)的化合物多存在于高等植物和羊齒類植物中；其結(jié)構(gòu)類型之多是由于其每一類別的羥基、甲

5、基等取代基的數(shù)量和位置不同所致。黃酮類化合物通常是以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在，如O-糖苷(O-glyco-sides),其苷元與糖以C-O-C方式連接，之外還發(fā)現(xiàn)有C-糖苷，如葛根素(puerarin)、葛根素木糖(puerarin xyloside)等。藥學(xué)科研工作者長(zhǎng)期的研究表明，黃酮類化合物具有多種多樣的生理活性，并取得了許多很有價(jià)值的研究的成果，現(xiàn)在日益受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛重視。目前對(duì)欒樹(shù)花黃酮類化合物的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究以南京曉莊學(xué)院校內(nèi)種植的欒樹(shù)上的欒樹(shù)花為原料，提取欒樹(shù)花黃酮，考察欒樹(shù)花黃酮類化合物的體外抗氧化活性，為欒樹(shù)花的開(kāi)發(fā)與利用提供有力的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

6、1.欒樹(shù)花黃酮的提取工藝研究(1)先通過(guò)不同顯色法以及它們的紫外光譜特征，發(fā)現(xiàn)利用紫外吸收光譜測(cè)定欒樹(shù)花中黃酮含量宜采用AlCl3法。在提取過(guò)程中，通過(guò)微波提取的單因素及正交試驗(yàn)，得到從欒樹(shù)花提取黃酮的最佳微波提取條件為提取溫度為70，提取時(shí)間為25分鐘，微波功率為700W。三個(gè)因素中影響大小為。2.欒樹(shù)花黃酮提取物的抗氧化活性的研究通過(guò)不同濃度的VC、硫辛酸、蘆丁、葉黃素黃酮乙醇溶液的清除雙氧水能力比較、對(duì)羥基自由基清除能力的比較以及在豬油體系中抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力比較。實(shí)驗(yàn)證明，欒樹(shù)花對(duì)羥基自由基、雙氧水都具有較強(qiáng)的清除能力，清除能力隨溶液的的濃度的增大而增大。欒樹(shù)花黃酮提取物對(duì)不飽和脂肪酸

7、(PUFA)過(guò)氧化體系有很強(qiáng)的抑制作用，這種抑制作用隨著反應(yīng)體系中溶液濃度的增大而增強(qiáng)。從抑制豬油氧化實(shí)驗(yàn)可以看出，它們?cè)谪i油油樣中的抗氧化能力大小為：。第一章 緒論1.1欒樹(shù)花的研究概況欒樹(shù)花簡(jiǎn)介欒樹(shù)花的開(kāi)發(fā)與利用現(xiàn)狀.1欒樹(shù)花在化工中的應(yīng)用.2欒樹(shù)花在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用1.2黃酮類化合物黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)和分類 黃酮類化合物(flavonoids)是自然界中廣泛存在的一類天然產(chǎn)物。這類含有氧雜環(huán)的化合物廣泛存在于高等植物體和羊齒類植物體中，它們常以游離態(tài)或與糖類合成苷的形式存在，在花、葉、果實(shí)等組織中，多為苷類，而在木質(zhì)部組織中澤多為游離的苷元。黃酮類化合物的提取黃酮類化合物的提取，主要是根據(jù)

8、被提取物質(zhì)的理化性質(zhì)和伴生的雜質(zhì)來(lái)選擇適合的提取溶液，苷類等一般可用丙酮、乙醇、甲醇、水或某些極性較大的混合物。大多數(shù)苷元宜用極性較小的溶劑，如乙醚、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑來(lái)提取，多甲氧基黃酮類苷元，甚至可用苯來(lái)提取。本實(shí)驗(yàn)采取無(wú)水乙醇來(lái)提取欒樹(shù)花中的黃酮類化合物。(1) 微波提取方法 利用磁控管所產(chǎn)生的每秒24.5億次超高頻率的快速震動(dòng)，使內(nèi)分子間相互碰撞、擠壓利于有效成分的浸出，具有反應(yīng)高效性和強(qiáng)選擇性、提取時(shí)間短、提取效果高等優(yōu)點(diǎn)。它是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新提取技術(shù)，受到了人們的廣大重視。例如李莉等在提取桑葉中黃酮化合物時(shí)比較微波法提取桑葉總黃酮，發(fā)現(xiàn)微波法提取效率比非微波法高。黃酮類化

9、合物含量的測(cè)定.11.3立題背景與研究?jī)?nèi)容1.3.1立題背景在回歸自然的今天，天然抗氧化劑(Natrual Antioxidants)的研究與開(kāi)發(fā)取得了前所未有的進(jìn)展。近十多年來(lái)，天然抗氧化劑已從單純作為油脂或含脂食品的抗氧化劑，發(fā)展到作為體內(nèi)活性氧的清除劑，從而起到保護(hù)人體細(xì)胞免受氧化損傷，保護(hù)心腦血管循環(huán)系統(tǒng)，預(yù)防癌癥，延緩衰老等效果。天然抗氧化劑在維持機(jī)體健康，預(yù)防諸多慢性疾病方面的角色，越來(lái)越引起國(guó)際上極大的關(guān)注。該領(lǐng)域的研究已成為生命及營(yíng)養(yǎng)科學(xué)中最令人注目的熱點(diǎn)。欒樹(shù)是.研究?jī)?nèi)容(1)本研究選用了本校南京曉莊學(xué)院方山校區(qū)校內(nèi)的欒樹(shù)花作為提取黃酮類物質(zhì)的原料，選定無(wú)水乙醇作為提取溶劑，

10、通過(guò)鋁鹽顯色紫外光譜掃描確立一種欒樹(shù)花總黃酮含量測(cè)定的合適的方法，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了欒樹(shù)花中總黃酮的提取工藝;(2)以欒樹(shù)花提取物為材料，進(jìn)行系統(tǒng)體外抗氧化試驗(yàn)研究，考察了它對(duì)羥基自由基、雙氧水的清除力，并與其他抗氧化物質(zhì)進(jìn)行比較，如VC、原花青素、硫辛酸、蘆丁。并研究了它們?cè)谪i油體系中抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。1前言 黃酮類化合物的提取，主要是根據(jù)提取物的性質(zhì)及伴存的雜質(zhì)來(lái)選擇適合的提取溶劑。苷類和極性較大的苷元，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些極性較大的混合溶劑進(jìn)行提取。本研究選用了本校南京曉莊學(xué)院方山校區(qū)校內(nèi)的欒樹(shù)花作為黃酮類物質(zhì)的原料，選定乙醇作為提取溶劑，微波萃取

11、法具有操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短,提取效率高等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)已被廣泛用作天然產(chǎn)物的提取方法 紫甘薯 ,用微波萃取法提取欒樹(shù)花黃酮類化合物尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.本文研究探討了欒樹(shù)花黃酮類化合物微波提取的最佳條件,同時(shí)對(duì)其提取物進(jìn)行了抗氧化活性研究.在提取過(guò)程中，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了微波萃取溫度、微波萃取時(shí)間、微波萃取功率3個(gè)主要因素對(duì)欒樹(shù)花中黃酮類化合物提取效率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)L9(34),確定欒樹(shù)花總黃酮提取的最佳提取工藝，旨在為欒樹(shù)花總黃酮的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。2.材料與儀器2.1材料 欒樹(shù)花，來(lái)源于本校南京曉莊學(xué)院方山校區(qū)園丁種植。2.2儀器與試劑主要試劑試劑規(guī)格廠家無(wú)水乙醇A.

12、R.國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司亞硝酸鈉A.R.國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司硝酸鋁A.R.上?；瘜W(xué)試劑有限公司氫氧化鈉A.R.上?；瘜W(xué)試劑有限公司蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品G.R.中國(guó)藥品生物制品檢定所2.2.2主要儀器儀器型號(hào)廠家電子天平分光光度計(jì)微波萃取儀2.3試驗(yàn)方法總黃酮含量的測(cè)定方法.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 參考高麗威等紫心甘薯的方法，精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20. 0 mg ,置于100 mL 容量瓶中,加60 %的乙醇溶解,定容至刻度,搖勻,即得濃度為0. 2 mg·mL - 1 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液. .2測(cè)定波長(zhǎng)的確定參考唐玉蓮（2006）的方法，準(zhǔn)確移取.1配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0ml、2.0ml于25ml

13、容量瓶中，各加60%乙醇至5ml，然后加10%亞硝酸鈉溶液0.7ml，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.7ml，搖勻，放置6min，再加8%氫氧化鈉試液5ml，最后用60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，放置15min，以第一瓶為空白，測(cè)定第二瓶在410-550nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，尋找最佳吸收波長(zhǎng)。.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 參考蘇東林(2007),趙亮(2006)的方法并加以改進(jìn)，準(zhǔn)確移取.1配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0ml、1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10ml于25ml容量瓶中，其余步驟按2.3.1.2操作。以第一瓶作為空白，在最佳波長(zhǎng)下測(cè)定各瓶溶液的吸光度。以吸光

14、度(A)為縱坐標(biāo)，濃度為(C)橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。.4總黃酮含量的測(cè)定及計(jì)算 參考趙亮(2006)方法，準(zhǔn)確移取萃取液于25ml容量瓶中，其余步驟按.2操作。參考空白，在最佳波長(zhǎng)下測(cè)定提取液的吸光度，最后利用提取液的吸光度，最后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量。欒樹(shù)花微波萃取條件選取.1微波萃取的最佳時(shí)間的確定參考。的方法，準(zhǔn)確移取花液混合物20ml共5份，分別置于50ml萃取罐中，時(shí)間分別為10min、15min、20min、25min、30min,然后于相同溫度、功率下微波萃取，測(cè)定微波萃取時(shí)間與總黃酮得率的關(guān)系。.2微波萃取的最佳溫度的確定參考。的方法，準(zhǔn)確移取花液混合物20ml共5份，分

15、別置于50ml萃取罐中，溫度分別為35、45、55、65、75,然后于相同時(shí)間、功率下微波萃取，測(cè)定微波萃取時(shí)間與總黃酮得率的關(guān)系。.3微波萃取的最佳功率的確定參考。的方法，準(zhǔn)確移取花液混合物20ml共5份，分別置于50ml萃取罐中，功率分別為300W、400W、500W、600W、700W、800W,然后于相同時(shí)間、溫度下微波萃取，測(cè)定微波萃取時(shí)間與總黃酮得率的關(guān)系。.4總黃酮最佳工藝的確定 在單因素的基礎(chǔ)上，采用L9(34)對(duì)微波萃取溫度、時(shí)間、功率進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表3 表3 試驗(yàn)因素水平表 Table3 Factor and lever of test水平溫度時(shí)間

16、min功率W1652060027025700375308002.3.4欒樹(shù)花總黃酮抗氧化性能的研究方法.1抗油脂氧化試驗(yàn)(1)測(cè)定原理 食用豬油由于含有不飽和脂肪酸，在光、熱、金屬離子等催化劑的活化下，以及油脂中的水和酶的作用，常會(huì)發(fā)生變質(zhì)腐敗的復(fù)雜變化，這種變化稱為酸敗。油脂的酸敗分為水解酸敗和氧化酸敗倆種。一般油脂主要發(fā)生氧化酸敗，在氧化過(guò)程中生成氧化物和氫過(guò)氧化物等中間產(chǎn)物，它們很容易分解而生成具有特殊臭氣的脂肪酸、醛、酮和醇等，從而影響了油脂的質(zhì)量。因而，檢驗(yàn)油脂中是否存在過(guò)氧化物以及它們含量的多少，就可以判斷油脂是否酸敗以及酸敗的程度稻殼104。油脂在氧化酸敗過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物極不

17、穩(wěn)定，氧化能力很強(qiáng)，能氧化碘化鉀為單質(zhì)鉀。用硫代硫酸鈉溶液滴定，根據(jù)析出碘量計(jì)算過(guò)氧化值，以活性氧的毫升當(dāng)量來(lái)表示，其反應(yīng)為104：-CH-OO-CH+2KI-K2O+I2+-CH-O-CH-I2+2Na2S2O3-Na2S2O6+2NaI油脂中加入一定濃度的抗氧化劑能夠消滅部分過(guò)氧化物，使得碘單質(zhì)的生成量減少，消耗硫代硫酸鈉溶液的體積也隨之減少，從而使油脂的過(guò)氧化值也減少。這樣，過(guò)氧化值越小，就能反映出抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)。(2) 試劑配制豬油：由市售肥豬肉煎制。 飽和碘化鉀溶液：取42g碘化鉀，加入30ml水溶解(微熱溶解)，儲(chǔ)存于棕色試劑瓶中，置于暗處。(3)測(cè)定方法采用烘箱儲(chǔ)藏法。

18、取5個(gè)錐形瓶各放入2g豬油和5ml不同濃度的黃酮試樣放入65的烘箱，烘24h后取樣檢測(cè)豬油的過(guò)氧化值POV，以過(guò)氧化值來(lái)表示油脂的氧化速度，進(jìn)而衡量抗氧化劑的活性。根據(jù)pov值測(cè)定方法(GB/T5009.37-85)進(jìn)行測(cè)定。VC、-硫辛酸、蘆丁、原花青素參照以上方法進(jìn)行測(cè)定pov值。.2清除羥基自由基試驗(yàn).2.1鄰二氮菲-Fe2+氧化法(1)測(cè)定原理 Fenton反應(yīng)原理：Fe2+與鄰二氮菲生成紅色配合物，測(cè)定此紅色配合物溶液在可見(jiàn)光區(qū)最大波長(zhǎng)處(536nm)處的吸光度值。若紅色配合物被氧化后，那么在最大波長(zhǎng)處的吸光度值將變小。在該體系中加入H2O2，那么產(chǎn)生的羥自由基將氧化鄰二氮菲-Fe2

19、+為鄰二氮菲-Fe3+，使最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度強(qiáng)烈減小甚至消失。但加入欒樹(shù)花黃酮提取物、VC、蘆丁、原花青素、-硫辛酸，它們優(yōu)先與.OH作用，減弱了.OH對(duì)鄰二氮菲-Fe2+的氧化作用，從而減弱最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值變化。其減弱程度反映出提取物、VC、蘆丁、原花青素、-硫辛酸的抗氧化能力的大小。(2)試劑配制1.5mmol/L鄰二氮菲溶液：取鄰二氮菲0.01487g，用少量乙醇溶解并用二次蒸餾水定容至50.0ml。pH=7.45磷酸鹽緩沖夜(Phosphate buffer saline,PBS);A液(1/15mol/LNa2HPO4);2.34gNa2HPO4(S)溶于水中，定容至10

20、0ml；B液(1/15mol/LKH2PO4):0.91gKH2PO4(S)溶于水中，定容至100ml；取A液85ml與B液15ml混合，得到pH=7.45磷酸鹽緩沖夜，用精密試紙測(cè)其pH。0.02%H2O2：0.5ml30%H2O2用750ml蒸餾水稀釋。(3)測(cè)定方法精密量取2. 0 mlPBS磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 4,下同)和4. 0 ml蒸餾水于試管中,混勻作空白參比管;精密量取2. 0 ml PBS, 1. 0 ml鄰二氮菲(1. 5 mmol· L - 1 ,下同) 、1. 0 ml FeSO4 (1. 5 mmol· L - 1 ,下同)和2. 0

21、ml蒸餾水于試管中,混勻作未損傷管;精密量取2. 0 mlPBS, 1. 0 ml鄰二氮菲, 1. 0 ml FeSO4 , 1. 0 ml蒸餾水和1. 0 mlH2O2 (0. 02% )于試管中,混勻作損傷管;精密量取2. 0 ml PBS,1. 0 ml樣品液和3. 0 ml蒸餾水于試管中,混勻作樣品參比管;精密量取2. 0 ml PBS、1. 0 ml鄰二氮菲, 1. 0 ml FeSO4 , 1. 0 ml黃酮試樣液和1. 0 ml H2O2 于試管中,混勻作樣品管。將上述試管置于恒溫水鍋中, 37保溫60 min,于波長(zhǎng)536 nm處測(cè)吸光度(A )值,每種處理重復(fù)5次,用其平均值

22、按下式計(jì)算羥自由基清除率。以VC、蘆丁、-硫辛酸、原花青素作對(duì)照。羥自由基清除率(% ) = (A樣品- A樣參) - (A損傷- A空參) /(A未損- A損傷) ×100%.3清除H2O2的能力試驗(yàn)(1)試劑配制 0.1mol/L H2O2：量取30%H2O211滴用50ml二次蒸餾水定容。0.01mol/L Na2S2O3：取以標(biāo)定好的0.1mol/LNa2S2O385ml定容1L。KI：稱5克KI溶于50ml容量瓶?jī)?nèi)。1%淀粉：稱取0.5g淀粉，加少量水調(diào)成糊狀，倒入50ml沸水中調(diào)勻且煮沸(2)測(cè)定方法 采用碘量法H2O2可氧化KI使之析出單質(zhì)碘，如果樣品能清除H2O2，則

23、析出的碘將減少，加入0.1mol/L H2O21.0ml和4ml的樣品，37保溫2h后用0.01mol/L Na2S2O3測(cè)定剩余H2O2氧化KI析出的量按下式計(jì)算H2O2的清除率。 H2O2的清除率=(D1-D2)/(D1-D0)×100% D1：用蒸餾水代替樣品測(cè)得的消耗Na2S2O3的平均體積ml。 D2：加入樣品后測(cè)得的消耗Na2S2O3的平均體積ml。 D0：不加H2O2，用蒸餾水代替樣品測(cè)得的試劑消耗Na2S2O3的平均體積ml。3. 結(jié)果與分析3.1 總黃酮測(cè)定方法的建立最佳波長(zhǎng)的確定 按.2測(cè)定波長(zhǎng)的確定方法測(cè)定410nm-550nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)顯色后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的

24、吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖1.。 從圖1中可以看出，顯色后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在510nm下的吸光度最大，所以選擇測(cè)定波長(zhǎng)為510nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法測(cè)定不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，結(jié)果見(jiàn)表 表 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的測(cè)定結(jié)果 Table Results of standard curve test 蘆丁濃度（mg/ml）0.00880.01760.03520.05280.07040.088吸光度(A)0.0510.0810.1580.2380.3140.401 根據(jù)表3數(shù)據(jù)，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，結(jié)果見(jiàn)圖3，依圖3結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：A=4.432

25、4x+0.0056， R2=0.9990其中： A-吸光度 C-溶液濃度 R-回歸系數(shù)mg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好。3.2微波萃取條件的確定微波萃取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響按.1提取時(shí)間確定方法測(cè)定不同提取時(shí)間的提取液在510nm下的吸光度，計(jì)算總黃酮得率，結(jié)果見(jiàn)圖圖結(jié)果表示，總黃酮得率隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，25min時(shí)總黃酮得率最高，為0.08808，此后，總黃酮得率略有下降。時(shí)間短萃取不充分，時(shí)間太長(zhǎng)使得萃取周期延長(zhǎng)，而且長(zhǎng)時(shí)間的高溫萃取有可能使得黃酮物質(zhì)被破壞。為了提高萃取效率并且縮短提取周期，提取時(shí)間選取25min為宜。微波萃取溫度對(duì)總黃酮得率的影響按.1提取溫度確定方法測(cè)定不同提取溫度的

26、提取液在510nm下的吸光度，計(jì)算總黃酮得率，結(jié)果見(jiàn)圖 圖結(jié)果表示，總黃酮率隨溫度的升高而增加，70時(shí)總黃酮得率最高，為0.08289，此后，總黃酮得率略有下降。一般來(lái)講，溫度升高，溶解速度加快，有利于萃取。但是由于黃酮類物質(zhì)是活性物質(zhì)，溫度太高黃酮物質(zhì)易被破壞，此外，高溫萃取會(huì)有雜質(zhì)大量溶出，從而使黃酮得率不再升高甚至下降，同時(shí)乙醇的沸點(diǎn)是80，此時(shí)乙醇揮發(fā)嚴(yán)重。因此，綜合考慮，萃取溫度為70為宜。微波萃取功率對(duì)總黃酮得率的影響按.1提取功率確定方法測(cè)定不同提取功率的提取液在510nm下的吸光度，計(jì)算總黃酮得率，結(jié)果見(jiàn)圖 由圖可知，欒樹(shù)花黃酮提取率隨著微波功率的增大而增大，在微波功率達(dá)到70

27、0W時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值0.08830，之后萃取率有所下降，因此選擇700W為宜。總黃酮最佳提取工藝的確定在單因素的基礎(chǔ)上，采用L9(34)對(duì)微波萃取溫度、時(shí)間、功率進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表 表 不同提取條件下的得率及極差分析Table9 Yield of total flavonoids and analysis of different technological conditions因素A微波萃取時(shí)間(min)B微波萃取溫度()C微波萃取功率(W)D總黃酮得率(%)試驗(yàn)1試驗(yàn)2試驗(yàn)3試驗(yàn)4試驗(yàn)5試驗(yàn)6試驗(yàn)7試驗(yàn)8試驗(yàn)9均值1均值2均值3極差2025302025302025

28、300.0660.0820.0700.0166565657070707575750.0730.0740.0700.0046007008007008006008006007000.0720.0720.0740.0020.066870.065970.064620.081990.084920.077930.071160.07026006890由表正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)總黃酮得率的影響次序?yàn)椋何⒉ㄝ腿r(shí)間>微波萃取溫度>微波萃取功率。微波萃取時(shí)間對(duì)總黃酮得率影響最大，25min得率最高，與單因素結(jié)果一致。其次為微波萃取溫度，70得率最高，也與單因素結(jié)果一致。微波萃取功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定

29、的影響，但均無(wú)顯著差異。綜上，提出從欒樹(shù)花提取黃酮的最佳萃取條件為A5B5C4即微波萃取時(shí)間為25min，萃取溫度為70，萃取功率為700W。在最佳組合下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，可得總黃酮得率為0.08850，高于前述各試驗(yàn)組合。3.2 抗氧化試驗(yàn)抗油脂氧化試驗(yàn) 油脂的自動(dòng)氧化可由光、熱、氧氣等因素引發(fā)，在高溫下，油脂能更快被氧化，油脂自動(dòng)氧化首先發(fā)生在不飽和雙鍵的次甲基上，生成自由基，而豬油中含有大量的不飽和雙鍵，所以容易氧化，抗氧化劑能提供氫與自由基(.R)和過(guò)氧化自由基(ROO.)作用，分別生成原來(lái)的油脂分子(RH)和氫過(guò)氧化物(ROOH)，其本身則生成沒(méi)有活性的氧化劑自由基，從而中斷自由基反應(yīng)。

30、按.2抗油脂氧化試驗(yàn)方法檢測(cè)各樣品過(guò)氧化值，結(jié)果見(jiàn)圖圖顯示，欒樹(shù)花總黃酮具有一定的抗氧化活性，并隨著濃度的增加其抗氧化性能越強(qiáng)(過(guò)氧化值越小)?？梢?jiàn)，相同濃度下欒樹(shù)花總黃酮的抗氧化能力低于原花青素、維生素C、-硫辛酸確高于蘆丁，-硫辛酸的抗氧化能力最強(qiáng)。原因可能是欒樹(shù)花黃酮中含有雜質(zhì)，使得有效成分降低，從而影響了抗氧化效果。也可能是欒樹(shù)花黃酮基本上不溶于油脂，只能懸浮在油脂中，不能充分發(fā)揮其抗氧化作用。但是加入欒樹(shù)花黃酮的豬油其過(guò)氧化值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于空白豬油的過(guò)氧化值，說(shuō)明欒樹(shù)花黃酮可以抑制豬油的氧化。清除羥基自由基試驗(yàn)試驗(yàn)以蘆丁、原花青素、維生素C、-硫辛酸作對(duì)比，按.3清除羥基自由基試驗(yàn)方法測(cè)定

31、各樣品對(duì)根據(jù)鄰二氮菲法所產(chǎn)生的羥基自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)圖由圖結(jié)果可知，欒樹(shù)花總黃酮溶液濃度(0.02mg/ml-0.16mg/ml)范圍內(nèi)在對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的.OH有一定的清除率作用，隨著總黃酮溶液濃度的增加說(shuō)明黃酮含供氫體，具有提供氫質(zhì)子的能力，可使具有高度氧化性的自由基還原，從而能終止自由基連鎖反應(yīng)，起到清除或抑制自由基的目的。但是相同濃度下，黃酮清除.OH的作用明顯弱于原花青素，而維生素C的清除羥基自由基的能力最差，在低濃度時(shí)，蘆丁要弱于維生素C，隨著濃度的增加時(shí)，反而要強(qiáng)于維生素C。欒樹(shù)花黃酮萃取物清除H2O2的能力試驗(yàn)以蘆丁、原花青素、維生素C、-硫辛酸作對(duì)比，按.4清除H2O

32、2試驗(yàn)方法測(cè)定各樣品對(duì)清除H2O2的能力，結(jié)果見(jiàn)圖以相同濃度的黃酮萃取物與對(duì)照品VC、蘆丁、-硫辛酸和原花青素過(guò)氧化氫的清除效果數(shù)據(jù)繪制樣品濃度過(guò)氧化氫清除率曲線，如圖。由圖可以看出，黃酮萃取物對(duì)H2O2有清除力。-硫辛酸與原花青素的清除能力相當(dāng)，維生素C的清除率最高。4討論自由基(free radical)是一類含有未配對(duì)電子的基團(tuán)、分子或原子，主要包括超氧陰離子、羥基自由基等，是人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，在正常情況下，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，且濃度較低。當(dāng)這一平衡被打破，就會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，引發(fā)一系列疾病。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定樣品對(duì)自由基的清除率，可以看出欒樹(shù)花黃酮對(duì)各種自由基都有較好的清除作用，隨著黃酮濃度的增加清除效果不斷提高，當(dāng)達(dá)到一定水平時(shí)，隨著黃酮濃度的增加，清除自由基的效果變化很小，這對(duì)我們將欒樹(shù)花黃酮作