昆明醫(yī)學(xué)院海源學(xué)院分子生物學(xué)

1、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)一.名詞解釋1.順式作用原件(順式調(diào)控原件)：?jiǎn)?dòng)子，增強(qiáng)子等調(diào)控序列，它們都位于結(jié)構(gòu)基因的相鄰部位(同一個(gè)DNA分子或同一個(gè)基因)，稱為為順式作用原件。2.反式作用因子：順式作用元件發(fā)揮作用時(shí)，要通過(guò)與相應(yīng)的蛋白質(zhì)，酶結(jié)合后，才能起調(diào)控作用，稱這些蛋白質(zhì)和酶為反式作用因子，有的對(duì)表達(dá)過(guò)程起激活作用，有的對(duì)表達(dá)過(guò)程起抑制作用。反式作用時(shí)由遠(yuǎn)結(jié)構(gòu)基因的同一個(gè)DNA分子相應(yīng)部位的編碼，也可由另外一個(gè)DNA分子相應(yīng)部位編碼。3.反向重復(fù)序列：即回文結(jié)構(gòu)，由反向序列在DNA鏈上不斷重復(fù)序列，其重復(fù)片段的平均長(zhǎng)度為300bp，在DNA分子中呈散在分布，反向重復(fù)序列的總長(zhǎng)度約占人基因組的5%

2、。4.衛(wèi)星DNA：其重復(fù)單位長(zhǎng)度一般為210bp，呈串聯(lián)狀集中排列，約占人基因組的5%-6%。5.假基因：多基因家族中不能表達(dá)功能RNA及蛋白質(zhì)的基因稱之為假基因，它由原來(lái)有功能的基因發(fā)生突變(如點(diǎn)突變，缺失，倒位突變等)并發(fā)生整合后形成的，假基因與其他有功能基因是同源的。6.管家基因：組成性基因表達(dá)產(chǎn)物通常是對(duì)生命過(guò)程必需的或必不可少的，且較少受環(huán)境因素的影響，這類基因通常被稱為管家基因。7.融合基因ABL/BCR：染色體異位使原癌基因受啟動(dòng)子，增強(qiáng)子的不正常調(diào)控，表達(dá)產(chǎn)物過(guò)量，導(dǎo)致細(xì)胞癌變，如慢性粒細(xì)胞性白血病是由于染色體的原癌基因ABL易位至22號(hào)染色體的BCR基因上，產(chǎn)生一融合基因AB

3、L/BCR，于是原癌基因ABL表達(dá)過(guò)量，蛋白酪氨酸激酶活性異常增高，ABL/BCR是CML標(biāo)志基因，通過(guò)PCR法測(cè)出其檢出率的較高，擴(kuò)大1/10 。8.總基因組文庫(kù)：從細(xì)胞中提取總基因組DNA，用相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶切割稱大小不同的各種基因片段，然后將這些基因片段分別與相應(yīng)的基因載體連接，形成各種重組體，將所有重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞中，通過(guò)培養(yǎng)受體細(xì)胞，基因得到擴(kuò)增，從而獲得含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體，它可以涵蓋基因組的全部基因信息，稱為總基因文庫(kù)。9.核酸分子雜交：根據(jù)核酸單鏈片段之間堿基互補(bǔ)而互相結(jié)合的原理，用已知堿基順序的DNA或RNA作為探針，來(lái)檢測(cè)未知待測(cè)樣品DNA或RN

4、A中的核苷酸順序，如對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記(放射性同位素標(biāo)記，熒光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記)，各具有無(wú)標(biāo)記信息的存在來(lái)確定有無(wú)雜交體，又跟軍探針的堿基順序，按堿基配對(duì)規(guī)則，就可測(cè)定出待測(cè)樣品的堿基順序。10.southen 印跡：將經(jīng)過(guò)電泳分離的DNA片段，轉(zhuǎn)移并固定在固相支持載體(NC膜)上，用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，若兩者之間存在同源性堿基互補(bǔ)，在復(fù)興條件下就可形成雜化雙鏈結(jié)構(gòu)，根據(jù)有無(wú)條件信號(hào)而確定有無(wú)雜交體存在，又根據(jù)探針的堿基順序，就可檢測(cè)出樣品DNA的堿基順序。11.分子診斷和基因診斷：用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，在分子水平上對(duì)引起疾病的遺傳基因，病原體，腫瘤相關(guān)基因以及他們的表達(dá)產(chǎn)物mRNA和蛋

5、白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)，定性，定量分析，對(duì)疾病作出診斷，稱分子診斷。其中分析信息分子DNA，mRNA的序列結(jié)構(gòu)，基因變異功能改變而引起疾病發(fā)生，稱為為基因診斷，它具有高度性。12.PFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)：人基因組中，平均每500個(gè)堿基可發(fā)生一個(gè)堿基變異(置換，缺失，插入)，它部影響遺傳性狀的改變，稱之為中性突變，中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸序列的差異，稱之為NDA多態(tài)性，其中，某些中性突變，常常發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)上，使原酶切位點(diǎn)消失或出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)，于是，用這種限制性內(nèi)切酶酶切水解DNA，產(chǎn)生的一些長(zhǎng)短及數(shù)目不同的小DNA片段，在個(gè)體間就存在著一些差異，稱之為RFLP.。13.DN

6、A指紋圖：不同個(gè)體的STR，其重復(fù)次數(shù)不一樣，但STR兩翼的堿基組成基本相同，針對(duì)STR兩翼堿基順序，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，個(gè)體間這個(gè)擴(kuò)增片段大小不同，將之進(jìn)行電泳分離，獲得一電泳圖譜，稱STR圖譜，也稱DNA指紋圖。14.基因芯片(DNA芯片)：基因芯片技術(shù)是以反向雜交為基礎(chǔ)而建立的一種高效高通量的自動(dòng)化分析技術(shù)，其基本原理是：針對(duì)各種基因點(diǎn)突變合成各種探針及正常探針，但不對(duì)它們進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)自動(dòng)化微點(diǎn)樣技術(shù)將這些未標(biāo)記的探針依次排列布陣在固相支持載體玻片上，將待測(cè)DNA(來(lái)自PCR)進(jìn)行熒光標(biāo)記，與固定在玻片上的各種探針進(jìn)行微雜交，經(jīng)激光共聚焦掃描顯微鏡捕獲雜交信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟

7、件處理分析就可得出檢測(cè)結(jié)果，由于在一小玻片上一次就可集成數(shù)量巨大的基因探針，進(jìn)行自動(dòng)化快速分析檢測(cè)，故稱基因芯片或DNA芯片，它在基因診斷及基因結(jié)構(gòu)分析方面有廣泛應(yīng)用前景。15.基因治療：是指用一定的分子生物學(xué)方法，將正常型(野生型)基因或有治療作用的核酸片段導(dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)，置換或矯正致病基因，使其恢復(fù)正常基因結(jié)構(gòu)，或者使它們整合于靶細(xì)胞染色體DNA中或獨(dú)立于染色體外，其在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因產(chǎn)物能補(bǔ)償致病基因缺陷所致的功能不足，或者直接對(duì)疾病有治療作用，或者引入細(xì)胞內(nèi)的核酸片段，能封閉靶細(xì)胞內(nèi)有害基因的表達(dá)。二.填空題或選擇題。(一些知識(shí)點(diǎn))1.基因結(jié)構(gòu)包括：結(jié)構(gòu)基因，調(diào)控序列2.原核生物基

8、因的調(diào)控序列有：?jiǎn)?dòng)子，終止子，操縱子序列，正調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)。3.原核啟動(dòng)子有三個(gè)功能位點(diǎn)：(1)轉(zhuǎn)錄起始識(shí)別部位：位于-35區(qū)，有共同序列TTGACA，是RNA聚合酶開(kāi)始識(shí)別附著位點(diǎn)；(2)PNApol牢固結(jié)合部位：位于-10區(qū)，有共同序列TATAAT；(3)轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)：+1區(qū)4.真核基因調(diào)控序列有：?jiǎn)?dòng)子，增強(qiáng)子，沉默子，上游調(diào)控元件，轉(zhuǎn)錄加尾信號(hào)。5.真核基因啟動(dòng)子主要有三類：(1)I類啟動(dòng)子：編碼rRNA，特征為富含GC；(2)II類啟動(dòng)子：編碼mRNA，特征為具有TATA盒；(3)III類啟動(dòng)子：編碼tRNA，特征為含有A盒，B盒，C盒。6.真核基因增強(qiáng)子的特點(diǎn)：(1)是真核基因

9、啟動(dòng)子工作效應(yīng)的順式作用元件，為最重要的調(diào)控原件；(2)其位置可位于上游，也可位于下游；(3)能進(jìn)行遠(yuǎn)距離調(diào)控；(4)無(wú)基因特異性7.根據(jù)重復(fù)頻率不同可將人基因組中大量重復(fù)序列分為：高度重復(fù)序列，中度重復(fù)序列，單拷貝或低度重復(fù)序列。8.多基因家族分為兩類：(1)基因家族的成員成簇集中分布在同一條染色體上不同部位；(2)基因家族的一些成員成簇集中分布在不同的染色體上9.操縱子的結(jié)構(gòu)包括：?jiǎn)?dòng)子，操作序列，結(jié)構(gòu)基因，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)10.基因表達(dá)可調(diào)控型表達(dá)包括：誘導(dǎo)表達(dá)，阻遏表達(dá)11.SD序列屬于翻譯水平上的調(diào)節(jié)。12.有利于基因轉(zhuǎn)錄的是：(1)r染色體結(jié)構(gòu)松弛；(2)組蛋白被乙?；?，甲基化，磷酸

10、化；(3)RNApol出現(xiàn)正超螺旋；(4)CPG低甲基化13.轉(zhuǎn)錄因子(反式作用因子)有三種不同結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)構(gòu)域；轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域；與其他蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域14.DNA結(jié)構(gòu)域包括：鋅指；螺旋-環(huán)-螺旋模體；堿性亮氨酸拉鏈15.轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域包括：酸性激活域；谷氨酰胺富含域；脯氨酸富含域16.與腫瘤發(fā)生的相關(guān)基因有：癌基因，抑癌基因，細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因，DNA修復(fù)基因等。17.病毒癌基因(v-onc)與細(xì)胞癌基因(c-onc)的比較：(1)v-onc通常丟失c-onc兩端的某些序列(2)v-onc沒(méi)有內(nèi)含子；(3)v-onc外顯子與同源的c-onc也有微小差別；(4)v-onc出現(xiàn)堿基取代或缺失較

11、c-onc常見(jiàn)18.常見(jiàn)抑癌基因有：APC(FAP)，Rb，P5319.P53又稱基因衛(wèi)士，位于17p13，20kb，11個(gè)外顯子，mRNA長(zhǎng)2.5kb，蛋白產(chǎn)物53kD20.細(xì)胞凋亡基因包括：促凋亡基因和抑凋亡基因，主要為BCL家族。21.PCR引物的條件是：(1)為一對(duì)小的DNA單鏈；(2)引物長(zhǎng)度：一般選擇15-18個(gè)核苷酸，且G-C含量在45%-55%之間；(3)引物與非擴(kuò)增區(qū)不可以結(jié)合；(4)引物3 端堿基要與模板互補(bǔ)才能擴(kuò)增；(5)引物的5 端與模板互補(bǔ)不要求，可對(duì)5 端進(jìn)行修飾；(6)PCR擴(kuò)增的長(zhǎng)度的在兩個(gè)引物之間的片段22.耐熱DANpol(Taq DNApol)：具有5 3

12、 聚合作用，也有5 3 的外切酶活性。23.基因克隆中獲得目的基因的方法有：(1)PCR法；(2)RT-PCR法；(3)從基因文庫(kù)中提??；(4)人工合成24.基因載體具備的條件有：(1)具有復(fù)制子；(2)有單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；(3)有可供篩選用的遺傳標(biāo)志；(4)表達(dá)載體應(yīng)具備與表達(dá)有關(guān)的調(diào)控元件；(5)載體分子盡量小25.基因重組的工具酶有：限制性核酸內(nèi)切酶；DNA連接酶26.限制性核酸內(nèi)切酶指II型內(nèi)切酶，識(shí)別部位為：4-6bp的回文結(jié)構(gòu)?；匚慕Y(jié)構(gòu)：GGATCC；CCTAGG27.限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式有：粘性末端；平齊末端28.陽(yáng)性重組細(xì)胞的篩選：常用插入滅活法：質(zhì)粒pBR 中含有A

13、mp 和Tet 29.原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核蛋白質(zhì)使沒(méi)有生物學(xué)活性，真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)有生物學(xué)活性；原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)方式采用融合表達(dá)法，其優(yōu)點(diǎn)是：一是融合蛋白穩(wěn)定；二是便于分離純化30.DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)直接分析法有：(1)雙脫氧末端終止法-sanger 法；(2)DNA自動(dòng)測(cè)序分析31.在RNA水平分析基因結(jié)構(gòu)常用的是：RNA保護(hù)試驗(yàn)(RPA)；能水解單鏈，對(duì)雙鏈有保護(hù)作用的是：RNA酶A；RNaseT132.目前最基因改造中最常用的方法是：基因的定向突變33.核酸分子雜交的類型有：(1)Southern印跡；(2)DNA點(diǎn)雜交；(3)Northen 印跡；(4)RNA點(diǎn)雜交；(5)細(xì)胞

14、原位雜交.。其中 Southern印跡用于DNA轉(zhuǎn)移雜交；Northen 印跡用于RNA轉(zhuǎn)移雜交。34.Southen blot 的應(yīng)用是：(1)對(duì)基因進(jìn)行定性分析；(2)對(duì)基因進(jìn)行定量分析35.基因拷貝數(shù)分析：(1)Southen blot (2)采用實(shí)時(shí)RT-PCR36.基因表達(dá)分析常用的方法有：(1)Northen blot ；(2)RT-PCR (3)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR；(4)RNA酶保護(hù)試驗(yàn)(RPA)；（5）cDNA芯片技術(shù)；(6)RNA干涉37.Northen blot 對(duì)mRNA進(jìn)行定量定性分析；一般采用DNA探針；由于mRNA不穩(wěn)定，故需加入RNA酶抑制劑DEPC(焦炭酸

15、二乙酯)。38.Taq-man探針為：5 端連接報(bào)告熒光染料；3 端連接猝滅染料39.基因缺失或插入的基因診斷方法有：(1)Southen 印跡法；(2)gap-PCR法40.基因點(diǎn)突變的基因診斷方法有：(1)ASO分子雜交；(2)RDB及基因芯片；(3)DHPLC41.未知點(diǎn)突變的方法有：SSCP-DNA測(cè)序；DHPLC-DNA測(cè)序法三.問(wèn)答題。1.試述操縱子的結(jié)構(gòu)及其調(diào)控作用。答：操縱子的調(diào)節(jié)是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。其結(jié)構(gòu)包括：結(jié)構(gòu)基因及調(diào)控序列。(1)結(jié)構(gòu)基因：編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶；(2)調(diào)控序列：?jiǎn)?dòng)子，操縱序列，調(diào)控基因，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)A.啟動(dòng)子：是RNA聚合酶及調(diào)節(jié)蛋白識(shí)別結(jié)合的部

16、位，決定原核基因表達(dá)效率關(guān)鍵性元件。B.操縱序列：位于啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因之間，是RNApol從啟動(dòng)子滑向結(jié)構(gòu)基因的必經(jīng)之處C.調(diào)空基因：阻遏蛋白的抑制轉(zhuǎn)錄的過(guò)程作用為負(fù)調(diào)控，是原核基因表達(dá)最普遍最主要的調(diào)節(jié)方式；少數(shù)情況下，調(diào)節(jié)基因表達(dá)與操縱序列結(jié)合后，能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的過(guò)程為正調(diào)控；某些特殊物質(zhì)與調(diào)控蛋白結(jié)合，若能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的過(guò)程稱之為誘導(dǎo)劑，反之為阻遏劑。D.轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)：位于下游3 端，其特殊的堿基順序idui轉(zhuǎn)錄終止起調(diào)節(jié)作用。2.試述腫瘤細(xì)胞發(fā)生的分子機(jī)制。答：由于腫瘤發(fā)生相關(guān)基因產(chǎn)生突變，于是：(1)調(diào)節(jié)細(xì)胞正常周期中的原癌基因激活，或使參與細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控作用的抑癌基因失活。(2)調(diào)節(jié)細(xì)胞

17、凋亡的促凋亡基因突變失活或者抑凋亡基因突變而活性增強(qiáng)。(3)DNA損傷修復(fù)的相關(guān)基因突變失活，這樣突變損傷基因在細(xì)胞內(nèi)逐漸積累增多，引起調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的基因與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡基因之間失去平衡，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。3.什么叫PCR，其基本原理是什么？答：概念：在體外能非常迅速地，大量地?cái)U(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。原理：(1)高溫變性：94 C左右時(shí)，使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，雙鏈成單鏈，但不影響3 5 磷酸二酯鍵的穩(wěn)定性；當(dāng)DNA長(zhǎng)鏈需溫度高，短鏈溫度低些；A=T，C=G，CG所占比例大，故需溫度高些，弱AT所占比例大，則變性需溫度低。(2)低溫復(fù)性：54 C左右時(shí)，一對(duì)引物是兩條DNA單鏈，其

18、中一條稱反向引物，它與正鏈模板3 端相應(yīng)部位堿基互補(bǔ)結(jié)合，另一條稱正向引物，它與正鏈互補(bǔ)鏈的3 端結(jié)合。(3)適溫下合成鏈延伸：72 C左右時(shí)，由耐熱DNApol以引物3 OH開(kāi)始，與解開(kāi)的DNA單鏈為模板，沿模板3 5 方向，5 3 延長(zhǎng)合成DNA。這樣一輪循環(huán)的產(chǎn)物又作為下一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)三十次循環(huán)后，擴(kuò)增片段的拷貝數(shù)就可達(dá)到10 4.基因治療的基本策略有哪些？答.(1)基因置換：在染色體上致病基因原位置處用正常基因置換致病基因，使基因正常結(jié)構(gòu)得到完全恢復(fù)。但基因定向同源重組技術(shù)目前尚未成功。(2)基因矯正：在染色體上致病基因原位置處，將突變的堿基給與矯正為正常堿基，而基因的其他結(jié)構(gòu)部分仍予保留。但基因定點(diǎn)同源重組技術(shù)目前尚未成功。(3)基因增補(bǔ)(基因添加)：將正?；?qū)牖颊叩牟∽兗?xì)胞或相關(guān)細(xì)胞內(nèi)，不追求基因原位置替換，也不刪除突變的致病基因，但導(dǎo)入的基因能表達(dá)出結(jié)構(gòu)，功能正常的蛋白質(zhì)(或RNA)，補(bǔ)償致病基因缺陷所導(dǎo)致的功能不足。如PKU的治療等。(4)抑制有害基因的表達(dá)或抑制基因表達(dá)過(guò)度(基因失活，基因封閉，基因沉默)：向患者體內(nèi)導(dǎo)入一核酸物質(zhì)