酶工程-第四章

1、第四章 酶的分離與純化第一節(jié)第一節(jié) 酶制劑的制備過程酶制劑的制備過程第二節(jié)第二節(jié) 酶的分離與提取酶的分離與提取第三節(jié)第三節(jié) 酶的純化與精制酶的純化與精制商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u酶的提取與分離純化是指將酶從細(xì)胞或其它酶的提取與分離純化是指將酶從細(xì)胞或其它含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得所需酶的技術(shù)過程。得所需酶的技術(shù)過程。u酶的提取酶的提取與分離純化方法較多，在實際應(yīng)用與分離純化方法較多，在實際應(yīng)用中，經(jīng)常進(jìn)行聯(lián)合使用具有較好的效果。中，經(jīng)常進(jìn)行聯(lián)合使用具有較好的效果。商

2、洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化酶的提取與分離純化技術(shù)路線酶的提取與分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎酶提取酶提取酶分離純化酶分離純化酶濃縮酶濃縮酶貯存酶貯存動物、植物或微生物細(xì)胞動物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。取分離，結(jié)晶分離等。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化第一節(jié) 酶制劑的制備過程u作為一個完整的酶制備方案，應(yīng)包括：作為一個完整的

3、酶制備方案，應(yīng)包括：u酶活力測定方案的建立，材料的選擇，預(yù)處酶活力測定方案的建立，材料的選擇，預(yù)處理、對酶的性質(zhì)的初步探索，制定酶的純化理、對酶的性質(zhì)的初步探索，制定酶的純化程序及酶成品的保存。程序及酶成品的保存。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化選擇條件選擇條件酶的產(chǎn)量高酶的產(chǎn)量高容易培養(yǎng)和管理容易培養(yǎng)和管理產(chǎn)酶穩(wěn)定性好產(chǎn)酶穩(wěn)定性好利于酶的分離純化利于酶的分離純化安全可靠，無毒性安全可靠，無毒性u一、材料的選擇一、材料的選擇u雖然所有的生物體細(xì)胞在一定條件下都能合成多種雖然所有的生物體細(xì)胞在一定條件下都能合成多種多樣的酶，但

4、是在酶的生產(chǎn)中使用的細(xì)胞必須根據(jù)多樣的酶，但是在酶的生產(chǎn)中使用的細(xì)胞必須根據(jù)需要進(jìn)行嚴(yán)格的選擇與培育。須具備以下條件：需要進(jìn)行嚴(yán)格的選擇與培育。須具備以下條件：商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u二、材料預(yù)處理二、材料預(yù)處理u為了獲得胞內(nèi)酶，首先要進(jìn)行細(xì)胞破碎，使為了獲得胞內(nèi)酶，首先要進(jìn)行細(xì)胞破碎，使細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，然后進(jìn)行酶的提取和細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，然后進(jìn)行酶的提取和純化。純化。u對于不同的生物體，或同一生物體的不同組對于不同的生物體，或同一生物體的不同組織的細(xì)胞，由于細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)（壁、膜）不織的細(xì)胞，由于細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)

5、（壁、膜）不同，所采用的細(xì)胞破碎方法和條件也有所不同，所采用的細(xì)胞破碎方法和條件也有所不同，必須根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。同，必須根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要胞內(nèi)酶，首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎處對細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。理。1）機(jī)械破碎）機(jī)械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化學(xué)破碎）化學(xué)破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超聲波超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I

6、型型 電動玻璃勻漿機(jī)電動玻璃勻漿機(jī)商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化機(jī)械破碎機(jī)械破碎搗碎法搗碎法研磨法研磨法勻漿法勻漿法 物理破碎物理破碎溫度差破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性劑：表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制劑法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，通過各種物理因素的作用，使組織、

7、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u三、初步探索酶的性質(zhì)三、初步探索酶的性質(zhì)u四、制定酶的分離程序四、制定酶的分離程序u五、酶的純度檢驗五、酶的純度檢驗商洛學(xué)院商洛學(xué)院

8、 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化第二節(jié) 酶的分離與提取u一、酶的提取一、酶的提取u是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。稱為酶的抽提。u酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┊?dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中

9、，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u酶都能溶解于水，通常可酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。u提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高

10、酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。 u為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、提取過程中還要注意控制好溫度、pHpH值等提取值等提取條件。條件。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化1 1、酶的主要提取方法、酶的主要提取方法提取方法提取方法使用的溶劑或溶液使用的溶劑或溶液提取對象提取對象鹽溶液提取鹽溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的鹽溶液的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較

11、大的酶度較大的酶酸溶液提取酸溶液提取PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取堿溶液提取PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶含有較多非極性基團(tuán)的酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃

12、度的升高而增加，這稱解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為為鹽溶現(xiàn)象鹽溶現(xiàn)象。 商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u2、影響酶提取的因素、影響酶提取的因素u溫度溫度u溫度對酶的提取效果有明顯影響。溫度高，有利于溫度對酶的提取效果有明顯影響。溫度高，有利于提高酶的溶解度，或增大酶分子的擴(kuò)散速度；溫度提高酶的溶解度，或增大酶分子的擴(kuò)散速度；溫度過高則易使酶變性失活。使用有機(jī)溶劑提取時溫度過高則易使酶變性失活。使用有機(jī)溶劑提取時溫度控制在控制在010。upHu為提高酶的溶解度，為提高酶的溶解度，pH應(yīng)避開酶的等電點(diǎn)。應(yīng)避開酶的等電點(diǎn)。u提

13、取液的體積提取液的體積u增加提取液的用量，可提高酶的提取率。增加提取液的用量，可提高酶的提取率。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u二、沉淀分離二、沉淀分離u沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的酶的溶解度降低溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。質(zhì)分離的技術(shù)過程。u根據(jù)溶解度的不同，根據(jù)溶解度的不同，使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)槭谷芤褐械娜苜|(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀?。固相析出。u古老、實用、簡單的初步分離方法古老、實用、簡單的初

14、步分離方法商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化分離方法分離方法分離原理分離原理鹽析沉淀法鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低，以及不同的兩性電利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的解

15、質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pHpH值，使酶值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離質(zhì)分離復(fù)合沉淀法復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的

16、某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離沉淀分離的方法沉淀分離的方法商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度）鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度）u1、基本原理（鹽溶和鹽析）基本原理（鹽溶和鹽析）u向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：現(xiàn)象：u1) 鹽溶：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。鹽溶：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。u2) 鹽析：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的

17、溶解度。鹽析：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。u高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。u不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。稱分段鹽析。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化在鹽濃度達(dá)到在鹽濃度達(dá)到某一界限后，某一界限后，酶的溶解度隨酶的溶解度隨鹽濃度升高而鹽

18、濃度升高而降低，這稱為降低，這稱為鹽析現(xiàn)象鹽析現(xiàn)象。 在一定的溫度和在一定的溫度和pHpH值條件下（值條件下（為常數(shù)），通過改變離子強(qiáng)度為常數(shù)），通過改變離子強(qiáng)度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為KsKs分段鹽析分段鹽析；而在一定的；而在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（鹽和離子強(qiáng)度的條件下（KsKsI I為常數(shù)），通過改變溫度和為常數(shù)），通過改變溫度和pHpH值，值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為分段鹽析分段鹽析。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u在蛋白質(zhì)的鹽析

19、中，通常采用的中性鹽有硫酸在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中鈉等。其中以硫酸銨最為常用以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨用硫酸銨進(jìn)行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時也離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。u在鹽析時

20、，溶液中硫酸銨的濃度通常以在鹽析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度飽和度表示。表示。 商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）u利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。之分離的方法。u1、沉淀機(jī)理沉淀機(jī)理u降低溶液的介電常數(shù)，部分引起蛋白質(zhì)脫水。降低溶液的介電常數(shù)，部分引起蛋白質(zhì)脫水。u溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有力增大，

21、互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。淀析出。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，例如，20時水的介電常數(shù)為時水的介電常數(shù)為80，而，而82乙醇乙醇水溶液的介電常數(shù)為水溶液的介電常數(shù)為40。商洛學(xué)院商

22、洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u2、常用有機(jī)溶劑常用有機(jī)溶劑u常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等丙醇、甲醇等 。u丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般為酶液體積的甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左倍左右，終濃度為右，終濃度為70%。 u3 3、優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：u優(yōu)點(diǎn)：分辨率比鹽析法高；沉淀不需脫鹽；溶劑易優(yōu)點(diǎn)：分辨率比鹽析法高；沉淀不需脫鹽；溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心蒸發(fā)，沉淀易離心u缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)變性失活；有機(jī)溶劑易燃、缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)變性失活；有機(jī)溶劑易燃、易爆

23、，對安全要求較高。易爆，對安全要求較高。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u 等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀(isoelectric precipitation) u1、原理原理u蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低；蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低；u不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn) 。u2、使用方法使用方法u單獨(dú)使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電單獨(dú)使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使點(diǎn)相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機(jī)溶劑法），因蛋白質(zhì)在等用（如鹽析法、有機(jī)溶

24、劑法），因蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時仍有一定的溶解度。電點(diǎn)時仍有一定的溶解度。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u3、 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：u大多數(shù)蛋白質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)的pI都在偏酸性范圍內(nèi)；都在偏酸性范圍內(nèi)；u無機(jī)酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低；無機(jī)酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低；u無需除掉多余酸即可進(jìn)行下一步純化。無需除掉多余酸即可進(jìn)行下一步純化。u4、缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：u酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活。酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u有機(jī)聚合物沉

25、淀法有機(jī)聚合物沉淀法 u1 1、作用機(jī)理：作用機(jī)理：u與有機(jī)溶劑類似與有機(jī)溶劑類似 ，是發(fā)展較快的一種新方法。，是發(fā)展較快的一種新方法。u2 2、沉淀劑：沉淀劑：u常用分子量為常用分子量為600060002000020000聚乙二醇聚乙二醇 （PEGPEG）。）。u3 3、優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：u操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。u沉淀效能高，使用少量的沉淀效能高，使用少量的PEGPEG即可沉淀相當(dāng)多的即可沉淀相當(dāng)多的生物大分子。生物大分子。u沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第

26、四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法u選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。 u1、熱變性熱變性u幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。u 2、pH變性變性u等電點(diǎn)沉淀法是等電點(diǎn)沉淀法是pH變性法中的一種變體。變性法中的一種變體。u3、有機(jī)溶劑變性有機(jī)溶劑變性u對有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。對有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀

27、。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u三、離心分離三、離心分離u離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。術(shù)過程。u在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的的顆粒大小、密度和特性的不同顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。的離心機(jī)、離心方法和離心條件。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純

28、化酶的分離與純化離心機(jī)的種類離心機(jī)的種類按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，分為：按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，分為： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化名稱名稱 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速(r/min)(r/min) 注意事項注意事項 低速離心機(jī)低速離心機(jī) 6000 6000 常溫，注意樣品熱變性和常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡離心管平衡 高速離心機(jī)高速離心機(jī) 60006000 2500025000冷凍（防止溫度升高），冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 超速離心機(jī)超速離心機(jī) 2500025000冷凍真

29、空系統(tǒng)（減少空冷凍真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 離心機(jī)的種類 商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī)，常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī)，其最大轉(zhuǎn)速在其最大轉(zhuǎn)速在8000 r/min以內(nèi)，相對離心力（以內(nèi)，相對離心力（RCF）在）在1104 g 以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。結(jié)晶等較大顆粒的分離

30、。u高速離心機(jī)高速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速為（最大轉(zhuǎn)速為（12.5）104 r/min ，相對離心力達(dá)到相對離心力達(dá)到 11041105 g ，在酶的分離，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性溫度升高而造成酶的變性失活失活，有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置，稱為高速稱為高速冷凍離心機(jī)。冷凍離心機(jī)。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u超速離心機(jī)超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)的最大轉(zhuǎn)速達(dá) (2.512

31、)104 r/min，相對離心力可以高達(dá)，相對離心力可以高達(dá) 5105 g甚至甚至更高。超速離心主要用于更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。分子質(zhì)量的測定等。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化l溫度類型：溫度類型：常溫及冷常溫及冷凍凍l超速離心機(jī)均為冷凍超速離心機(jī)均為冷凍型。型。l使用冷凍離心機(jī)時提使用冷凍離心機(jī)時提前降溫，預(yù)冷離心頭。前降溫，預(yù)冷離心

32、頭。l使用超速離心機(jī)時先使用超速離心機(jī)時先抽真空。抽真空。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化l角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式及外擺式：外擺式一般為低速， l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化l角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。穩(wěn)、蓋、旋緊。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化商洛學(xué)

33、院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化l材質(zhì)：玻璃，材質(zhì)：玻璃，塑料塑料l強(qiáng)度：和離心強(qiáng)度：和離心速度相配速度相配l大?。汉娃D(zhuǎn)子大?。汉娃D(zhuǎn)子配套配套l高速超速管要高速超速管要加蓋加蓋商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化l平衡、定溫、定速、定時。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化常用離心方法常用離心方法 差

34、速離心法差速離心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度離心密度梯度離心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度離心等密度梯度離心商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u1、差速離心、差速離心 （differential centrifugation） u采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。的顆粒分批分離的方法。u特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 u優(yōu)點(diǎn)：操作簡單優(yōu)點(diǎn)：操作簡單 。u缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：u分離效果較差，不能一次得到

35、純顆粒。分離效果較差，不能一次得到純顆粒。u壁效應(yīng)嚴(yán)重。壁效應(yīng)嚴(yán)重。u沉降的顆粒受到擠壓。沉降的顆粒受到擠壓。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化差速離心分離示意圖差速離心分離示意圖 （a a）離心前的懸浮液）離心前的懸浮液 （b b）（）（e e）離心不同時間后顆粒的沉降情況）離心不同時間后顆粒的沉降情況 商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u2 2、密度梯度離心密度梯度離心 u（density gradient centrifugationdensity gr

36、adient centrifugation）u樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。方法。u常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液u特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。顆粒的密度。u適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化密度梯度離心示意圖密度梯度離心示意圖 （a）離心前

37、（b）離心后 商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化密度梯度離心示意圖密度梯度離心示意圖商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u3、等密度梯度離心等密度梯度離心u根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離?；蚍Q沉降平衡離根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離?；蚍Q沉降平衡離心心 。（sedimentation equilibrium centrifugation）u離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達(dá)到與

38、其相的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。u常用氯化銫（常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。）作為梯度介質(zhì)。u特點(diǎn)：介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的特點(diǎn)：介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。密度。u適用于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。適用于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化等密度梯度離心示意圖 （a）離心前； （b）離心后 商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與

39、純化酶的分離與純化密度梯度離心密度梯度離心等密度梯度離心等密度梯度離心梯度梯度介質(zhì)介質(zhì)通常用蔗糖通常用蔗糖最大的梯度密度最大的梯度密度 密度密度最大的沉降樣品最大的沉降樣品離心離心條件條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時到管底前停止，短時間，低速度間，低速度使各組分沉降到其平衡使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高的密度區(qū)，長時間，高速度速度分離分離依據(jù)依據(jù)密度相近，但沉降系密度相近，但沉降系數(shù)不同數(shù)不同沉降系數(shù)相近，但密度沉降系數(shù)相近，但密度不同不同沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn)沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn)商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工

40、程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u小結(jié)：小結(jié)：u等密度梯度離心等密度梯度離心是一種測定顆粒浮力密度的是一種測定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。之包括待分離物的密度范圍。u差速離心差速離心是一種動力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇是一種動力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。適合于各分離物的離心力。u密度梯度離心密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四

41、章 酶的分離與純化酶的分離與純化u四、過濾與膜分離四、過濾與膜分離u過濾是借助于過濾是借助于過濾介質(zhì)過濾介質(zhì)將不同大小、不同形將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。u過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。等，可以根據(jù)需要選用。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化過過濾濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為 過濾介質(zhì)過濾介質(zhì) 膜過濾：

42、采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì) 商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化過濾的分類及其特性過濾的分類及其特性( (根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ) ) 類別類別截留顆粒大小截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾粗濾 2m 2m酵母、霉菌、動物細(xì)酵母、霉菌、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形胞、植物細(xì)胞、固形物等物等 濾紙、濾布、濾紙、濾布、 纖維多孔陶瓷、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等燒結(jié)金屬等微濾微濾0.20.22m2m細(xì)菌、灰塵等細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微濾

43、膜、微孔陶瓷微孔陶瓷超濾超濾20200.2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超濾膜超濾膜反滲反滲透透 20 20生物小分子、鹽、離生物小分子、鹽、離子子反滲透膜反滲透膜商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u非膜過濾非膜過濾u包括粗濾和部分微濾兩類。包括粗濾和部分微濾兩類。u1、粗濾粗濾u為加快過濾速度，提高分離效果，常添加助濾劑。為加快過濾速度，提高分離效果，常添加助濾劑。常用的助濾劑有：硅藻土、活性碳、紙粕等。常用的助濾劑有：硅藻土、活性碳、紙粕等。u根據(jù)推動力的產(chǎn)生條件不同分為：根據(jù)推動力的產(chǎn)生條件不同分為：常壓

44、過濾常壓過濾加壓過濾加壓過濾減壓過濾減壓過濾非膜過濾非膜過濾商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u2、微濾微濾u又稱微孔過濾。又稱微孔過濾。u廣泛應(yīng)用于無菌水、廣泛應(yīng)用于無菌水、礦泉水、汽水等軟飲礦泉水、汽水等軟飲料的的生產(chǎn)。料的的生產(chǎn)。u一般采用微濾膜、燒一般采用微濾膜、燒結(jié)金屬等作為過濾介結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)，也可采用微濾膜。質(zhì)，也可采用微濾膜。各種鈦過濾器濾芯鈦過濾器及不銹鋼外殼商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u膜分離技術(shù)膜分離技術(shù)u借助于一定孔徑的高分

45、子薄膜，將不同大小、不同借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。稱為膜分離技術(shù)。u膜分離所使用的薄膜主要由膜分離所使用的薄膜主要由丙烯腈丙烯腈、醋酸纖維素醋酸纖維素、賽璐玢賽璐玢以及以及尼龍尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等。有時也可以采用動物膜等。u膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔

46、徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u根據(jù)物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^薄膜的原理的推動力的不根據(jù)物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^薄膜的原理的推動力的不同，膜分離可分為三大類：同，膜分離可分為三大類： 膜分離膜分離加壓膜分離加壓膜分離 微濾微濾超濾超濾反滲透反滲透電場膜分離電場膜分離 電滲析電滲析 離子交換膜電滲析離子交換膜電滲析 擴(kuò)散膜分離擴(kuò)散膜分離 透析透析商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u1、加壓膜分離加壓膜分離

47、u根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為：方法截留顆粒截留顆粒直徑直徑操作壓力操作壓力應(yīng)用應(yīng)用微濾微濾0.22 m 0.1MPa除菌除菌超濾超濾20A 0.2 m0.10.7MPa分離病毒及分離病毒及生物大分子生物大分子反滲透反滲透20 (40,000) 壓力差，100kPa 篩分超濾UF 120 (10,000-40,000)壓力差，100kPa 篩分納濾NF 1 (1001000)壓力差，100) 壓力差，1000kPa 優(yōu)先吸附、溶解擴(kuò)散 四種常用膜分離技術(shù)的基本特征四種常用膜分離技術(shù)的基本特征 商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第

48、四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化四種常用膜分離過程的截留特性四種常用膜分離過程的截留特性本節(jié)目錄商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u五、層析分離五、層析分離u層析分離技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離層析分離技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。方法。u它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的為固定的( (稱為固定相稱為固定相) )，另一個相則流過此固定相，另一個相則流過

49、此固定相( (稱為流動相稱為流動相) )并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離的目的。到分離的目的。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u層析法的分類：層析法的分類：u流動相：兩種狀態(tài)。流動相：兩種狀態(tài)。u液體作為流動相；液體作為流動相；氣體作為流動相。氣體作為流動相。u固定相：兩種狀態(tài)。固定相：兩種狀態(tài)。u固體吸附劑作為固定相；固體吸附劑作為固定相；u以吸附在固體上的液體作為固定相。以吸附在固體上的液體作為固定相。u按兩相所處的狀態(tài)分類：按兩相所處的狀態(tài)分類：液相層析液相層析 氣相層析氣相層析液

50、液- -固層析固層析液液- -液層析液層析氣氣- -固層析固層析氣氣- -液層析液層析商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u按層析過程的機(jī)理分類：按層析過程的機(jī)理分類：u吸附層析吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異。差異。u分配層析分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。分配系數(shù)的不同。u離子交換層析離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。的不同。u凝膠層析凝膠層析：利用某些凝膠對于

51、不同分子大小的組分：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。阻滯作用的不同。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u按操作形式不同分類：按操作形式不同分類：u柱層析柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達(dá)到分離。方向移動而達(dá)到分離。u紙層析紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。流動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。u薄層層析薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的

52、分離和鑒定以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定的方法。的方法。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化層析分離方法層析分離方法層析方法層析方法分離依據(jù)分離依據(jù)吸附層析吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離各組分分離分配層析分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離分離離子交換層析離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目

53、的種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化親和力，使生物分子分離純化層析聚焦層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的

54、分離與純化酶的分離與純化u吸附層析吸附層析u吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。不同而使混合物中各組分分離的方法。u吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡單。設(shè)備簡單。u吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附柱中，裝置成吸附層析柱吸附層析柱。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化

55、u層析時，欲分離的混合溶層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。再加入洗脫劑解吸洗脫。u洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。再吸附的過程。u溶劑洗脫法溶劑洗脫法u置換洗脫法置換洗脫法u前緣洗脫法前緣洗脫法 商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u分配層析分配層析u分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。不同，而使

56、各組分分離的方法。u分配系數(shù)分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中劑中溶解達(dá)到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中濃度的比值。濃度的比值。u在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固固定相定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持，這種

57、溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。物上。u另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動，稱為流動相。流動相。u當(dāng)某溶質(zhì)在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在當(dāng)某溶質(zhì)在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)分配。兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)分配。u常見的有：紙上層析、分配薄層層析、分配氣相層常見的有：紙上層析、分配薄層層析、分配氣相層析。析。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u離子交換層析離子交換層析u是利用離子交換劑上的是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活

58、性基團(tuán)）對可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析目的的一種層析分離方法。分離方法。u離子交換劑離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成?？山怆x基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。u按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離陽離子交換劑子交換劑和和陰離子交換劑陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換

59、劑質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。進(jìn)行酶的分離純化。商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化離子交換劑-帶有電荷基團(tuán)的帶有電荷基團(tuán)的不溶性不溶性載體載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體Diethylaminoethyl(DEAE) 陰離子交換劑(可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì)) 陽離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章

60、酶的分離與純化酶的分離與純化u離子交換劑的選擇離子交換劑的選擇ua. 強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇：強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇：u強(qiáng)型：適用的強(qiáng)型：適用的pH范圍廣，制備無離子水范圍廣，制備無離子水 u弱型：適用的弱型：適用的pH范圍窄，分離生物大分子物質(zhì)范圍窄，分離生物大分子物質(zhì) ub. 陰、陽離子交換劑的選擇：酶的穩(wěn)定性陰、陽離子交換劑的選擇：酶的穩(wěn)定性u若若pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑商洛學(xué)院商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥工程系生物醫(yī)藥工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化u凝膠層析凝膠層析u又稱為凝膠過濾，分子又稱為凝膠過濾，分子排阻層