營養(yǎng)缺陷菌株篩選課件

1、2 2 篩選策略篩選策略（1） 基本概念 營養(yǎng)缺陷型 (auxotroph) 某一野生型菌株由于發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子的能力，因而無法在基本培養(yǎng)基上正常生長繁殖的變異類型。 野生型（ wild type ）：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。 原養(yǎng)型 (prototroph) ：一般指營養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。 基本培養(yǎng)基 (MM) 能夠滿足野生型菌株生長最低限度需要的培養(yǎng)基。 補(bǔ)充培養(yǎng)基 (SM) 凡能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型生長需要的培養(yǎng)基。在 MM 中加蛋白胨（多種氨基酸 ) 便可以用來培養(yǎng)各種氨基

2、酸的缺陷型；加入酵母浸膏 ( 其中含有多種 B 族維生素和核苷酸 ) 便可以培養(yǎng)不同的維生素、嘌呤和嘧啶缺陷型。 完全培養(yǎng)基 (CM) 凡能滿足一切營養(yǎng)缺陷型生長需要的培養(yǎng)基。 營養(yǎng)缺陷性突變株?duì)I養(yǎng)缺陷性突變株與營養(yǎng)要求有關(guān)的三類遺傳型與營養(yǎng)要求有關(guān)的三類遺傳型2）營養(yǎng)缺陷型的篩選辦法）營養(yǎng)缺陷型的篩選辦法誘變劑處理誘變劑處理淘汰野生型淘汰野生型檢出缺陷型檢出缺陷型夾層培養(yǎng)法夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法逐個(gè)檢出法逐個(gè)檢出法影印接種法影印接種法鑒定缺陷型鑒定缺陷型菌絲過濾法菌絲過濾法抗生素法抗生素法淘汰野生型：淘汰野生型：在誘變后的存活個(gè)體中，營養(yǎng)缺陷型的比例較低在誘變后的存活個(gè)體中，

3、營養(yǎng)缺陷型的比例較低（百分之幾千分之幾）。需選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ蕴瓰閿?shù)眾多的（百分之幾千分之幾）。需選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ蕴瓰閿?shù)眾多的野生型菌株，達(dá)到野生型菌株，達(dá)到“濃縮濃縮”極少數(shù)營養(yǎng)缺陷型的目的。極少數(shù)營養(yǎng)缺陷型的目的。過濾法是使能在基本培養(yǎng)基上生長形成菌絲體的野生型留在濾膜上，不能生長的營養(yǎng)缺陷型孢子則能透過濾膜。 營養(yǎng)缺陷型檢出營養(yǎng)缺陷型檢出逐個(gè)檢出法逐個(gè)檢出法涂布涂布培養(yǎng)培養(yǎng)基本培養(yǎng)基上不長菌落基本培養(yǎng)基上不長菌落完全培養(yǎng)基上長出菌落完全培養(yǎng)基上長出菌落含誘變劑的液體培養(yǎng)基含誘變劑的液體培養(yǎng)基菌種菌種營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型夾層檢出法夾層檢出法影印法影印法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法（同一培養(yǎng)皿）（同一培養(yǎng)皿

4、） 微量蛋白胨的基本培養(yǎng)基上微量蛋白胨的基本培養(yǎng)基上 小菌落是營養(yǎng)缺陷型突變株小菌落是營養(yǎng)缺陷型突變株生長譜法生長譜法 方法簡便；方法簡便； 回變和污染不影響回變和污染不影響 結(jié)果結(jié)果 測定物質(zhì)可為粉末測定物質(zhì)可為粉末 或紙片或紙片 缺陷型缺陷型的鑒定的鑒定測定一般應(yīng)分兩階段：測定一般應(yīng)分兩階段： 第一階段：測定是哪類物質(zhì)的缺陷第一階段：測定是哪類物質(zhì)的缺陷型；型； 第二階段：根據(jù)第一階段確定的范圍，第二階段：根據(jù)第一階段確定的范圍，進(jìn)一步確定是哪種具體化合物的進(jìn)一步確定是哪種具體化合物的缺陷缺陷型；型；組合營養(yǎng)物法組合營養(yǎng)物法步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）：步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）

5、：a. 將多種營養(yǎng)因子編組；將多種營養(yǎng)因子編組；b. 將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c. 結(jié)果分析；結(jié)果分析； 一組：一組：1 2 3 4 5 二組：二組：2 6 7 8 9 三組：三組：3 7 10 11 12 四組：四組：4 8 11 14 五組：五組：5 9 12 14 15營養(yǎng)因子分組編排時(shí)注營養(yǎng)因子分組編排時(shí)注意；意；1）每組內(nèi)無重復(fù)的營）每組內(nèi)無重復(fù)的營 養(yǎng)因子養(yǎng)因子 2）每組中應(yīng)包含只出）每組中應(yīng)包含只出 現(xiàn)一次的因子現(xiàn)一次的因子 3）每組中其他因子應(yīng)）每組中其他因子應(yīng) 分別出現(xiàn)二次分別出現(xiàn)二次如：如： 一組：一組：1 2 3

6、 4 5 二組：二組：2 6 7 8 9 三組：三組：3 7 10 11 12 四組：四組：4 8 11 14 五組：五組：5 9 12 14 15營養(yǎng)缺陷型的應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型的應(yīng)用 利用營養(yǎng)缺陷型突變株來生產(chǎn)氨基酸和核苷酸是典型的例子利用營養(yǎng)缺陷型突變株來生產(chǎn)氨基酸和核苷酸是典型的例子 抗阻遏和抗反饋突變型抗阻遏和抗反饋突變型 抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調(diào)所造成的，抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調(diào)所造成的，在細(xì)胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時(shí)仍然繼續(xù)不斷地在細(xì)胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時(shí)仍然繼續(xù)不斷地合成這一產(chǎn)物。合成這一產(chǎn)物。 選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 結(jié)構(gòu)類

7、似物是指一些和結(jié)構(gòu)類似物是指一些和細(xì)菌體內(nèi)氨基酸、嘌呤、細(xì)菌體內(nèi)氨基酸、嘌呤、維生素等代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)維生素等代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)相類似的物質(zhì) 主要用于末端產(chǎn)物的積累主要用于末端產(chǎn)物的積累抗性突變菌株的篩選抗性突變菌株的篩選 抗生素抗性突變株抗生素抗性突變株條件抗性突變條件抗性突變 因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為 野生型野生型 菌株的特性和突變型菌株的特性和突變型菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。 以以溫度敏感突變溫度敏感突變?yōu)槔簽槔汉Y選方法：篩選方法：用途：用途：常用于提高代謝物產(chǎn)量常用于提高代謝物產(chǎn)量原因：原因

8、：是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)改變后，在高溫下活力喪失改變后，在高溫下活力喪失重要性：重要性：如果此酶為蛋白質(zhì)、如果此酶為蛋白質(zhì)、核酸合成途徑中所需的酶，核酸合成途徑中所需的酶，則此變異株在高溫下的表型則此變異株在高溫下的表型就是營養(yǎng)缺陷型。就是營養(yǎng)缺陷型。u在富含生物素的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)：在富含生物素的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)：u先在先在30（允許條件）中進(jìn)行培養(yǎng)以得到大量（允許條件）中進(jìn)行培養(yǎng)以得到大量菌細(xì)胞，適當(dāng)時(shí)間后提高溫度（菌細(xì)胞，適當(dāng)時(shí)間后提高溫度（ 40 ，非允許，非允許條件），即能獲得谷氨酸的過量生產(chǎn)。條件），即能獲得谷氨酸的過量生產(chǎn)。應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例v由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌2256，經(jīng)，經(jīng)誘變處理