分子生物學常用技術(shù)PPT精選文檔

1、分子生物分子生物學常用技學常用技術(shù)術(shù) 第十七章第十七章2分子生物學常用技術(shù)分子生物學常用技術(shù) 凝膠電泳凝膠電泳 分子雜交分子雜交 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)技術(shù) DNA的物理圖譜的物理圖譜 DNA序列測定序列測定 基因芯片基因芯片3第一節(jié)第一節(jié) 凝膠電泳凝膠電泳(gel electrophoresis) 電泳概念電泳概念 基本原理基本原理 Q 6r : 遷移率遷移率 Q : 電荷量電荷量 r : 粒子半徑（分子量）粒子半徑（分子量） : 介質(zhì)粘度介質(zhì)粘度 4 電泳的用途電泳的用途分離分離鑒定純度鑒定純度測定分子量測定分子量 凝膠電泳的種類凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳

2、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 5一、瓊脂糖凝膠電泳一、瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis) 分離核酸原理分離核酸原理 操作要點操作要點 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍6（一）（一）分離核酸原理分離核酸原理 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 分子構(gòu)象分子構(gòu)象71. 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 核酸是核酸是兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH = 3.5 , 正電荷正電荷 pH = 8.08.3 , 負電荷，正極負電荷，正極892.分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 小分子小分子移動快移動快 ，大分子移動慢，大分子移動慢103. 分子構(gòu)象分子構(gòu)象 閉環(huán)超螺旋閉環(huán)超螺旋線狀線狀DNA開環(huán)開環(huán)DNA

3、 +-11（二）操作要點（二）操作要點 支持物支持物 凝膠濃度的選擇凝膠濃度的選擇 DNA分子量標準分子量標準 電泳緩沖液電泳緩沖液 樣品制備樣品制備 電泳條件電泳條件 DNA電泳染色電泳染色 DNA片段的回收片段的回收 121. 支持物支持物13商品化的瓊脂糖商品化的瓊脂糖14瓊脂糖種類瓊脂糖種類普通普通低熔點低熔點高純高純高篩分高篩分熔點熔點8090幾十幾十V/cm 溫度：溫度：1525 26潛水電泳潛水電泳277.電泳染色電泳染色 溴乙錠溴乙錠(ethidium bromide, EB) 結(jié)構(gòu)及染色原理結(jié)構(gòu)及染色原理 染色方法染色方法加入凝膠液中加入凝膠液中 電泳結(jié)束后電泳結(jié)束后染色染色

4、 28EB染色原理染色原理2930紫外燈下顯色紫外燈下顯色318. DNA片段的回收片段的回收 低熔點瓊脂糖法低熔點瓊脂糖法 透析袋電洗脫法透析袋電洗脫法(5kb) DEAE-纖維素膜法纖維素膜法(0.55kb)32（三）應(yīng)用范圍（三）應(yīng)用范圍 DNA的分離、純化和鑒定的分離、純化和鑒定 限制性酶切圖譜分析限制性酶切圖譜分析 重組體的分離、鑒定重組體的分離、鑒定 雜交分析雜交分析 PCR產(chǎn)物的分離鑒定產(chǎn)物的分離鑒定 33瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳34二、聚丙烯酰胺凝膠電泳二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 分離原理分離原

5、理 操作要點操作要點 優(yōu)點優(yōu)點 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍35（一）分離原理（一）分離原理 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)36PAGE支持物支持物 單體丙烯酰胺單體丙烯酰胺(Acr) 交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis) 催化劑過硫酸胺催化劑過硫酸胺(AP) 加速劑加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)37聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠38（二）操作要點（二）操作要點 凝膠的分類凝膠的分類 凝膠濃度的選擇凝膠濃度的選擇 凝膠液的配制凝膠液的配制 凝膠中凝膠中DNA的檢測的檢測 DNA片段的回收片段的回收 391. 凝膠的分類凝膠的分類 非變性非變性凝膠：凝膠：d

6、sDNA 變性凝膠變性凝膠: ssDNA尿素尿素甲酰胺甲酰胺SDS402. 凝膠濃度的選擇凝膠濃度的選擇41423. 凝膠液的配制凝膠液的配制 試劑(ml)制備濃度(%) 3.5 5.08.0122030%Acr11.6 16.6 26.640.066.6ddH2O67.7 62.7 52.739.312.75XTBE20.0 20.0 20.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml43PAGE裝置裝置44454647電電 泳泳484. 凝膠中凝膠中DNA的檢測的檢測 溴乙錠染色法溴乙錠染色法 銀鹽染色法銀鹽染色法 甲醛甲醛 還原還原 放射自顯影

7、法放射自顯影法 Ag+DNA Ag（黑褐色）黑褐色） 495.DNA片段的回收片段的回收 壓碎浸泡法壓碎浸泡法 1kb 純度高，回收率低純度高，回收率低50（三）（三）PAGE優(yōu)點優(yōu)點 機械強度好、化學穩(wěn)定性高機械強度好、化學穩(wěn)定性高 分辨率高分辨率高 載樣量大載樣量大 回收的回收的DNA純度高純度高 51（四）（四）PAGE應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 分離、純化和鑒定分離、純化和鑒定RNA和小分子和小分子DNA DNA序列分析序列分析 PCR產(chǎn)物鑒定產(chǎn)物鑒定 蛋白質(zhì)的檢測和分析蛋白質(zhì)的檢測和分析 52第二節(jié)第二節(jié) 分子雜交分子雜交 分子雜交的基本原理分子雜交的基本原理 固相支持物固相支持物 探針探針

8、幾種常用雜交技術(shù)幾種常用雜交技術(shù)53一、分子雜交的基本原理一、分子雜交的基本原理 核酸的變性和復(fù)性核酸的變性和復(fù)性54分分子子雜雜交交DNA-DNA55DNA-RNA56雜交條件雜交條件 靶分子靶分子 探針探針 雜交袋雜交袋 雜交爐雜交爐57雜交種類雜交種類 被檢核酸種類和方法被檢核酸種類和方法 原位雜交原位雜交斑點雜交斑點雜交Southern雜交雜交Northern雜交雜交Western雜交雜交 反應(yīng)介質(zhì)反應(yīng)介質(zhì) 液相雜交液相雜交 固相雜交固相雜交( )58二、固相支持物二、固相支持物 固相支持物的特性固相支持物的特性結(jié)合能力強結(jié)合能力強不影響雜交反應(yīng)不影響雜交反應(yīng)結(jié)合牢固結(jié)合牢固 非特異性

9、吸附少非特異性吸附少 機械性能良好機械性能良好 59固相支持物的種類固相支持物的種類 硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龍膜尼龍膜(nylon membrane)601.硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜 特點特點吸附吸附ssDNA和和RNA 雜交信號本底低雜交信號本底低 不足不足不適于重復(fù)雜交不適于重復(fù)雜交濾膜較脆濾膜較脆 不適于電轉(zhuǎn)移印跡法不適于電轉(zhuǎn)移印跡法 對對DNA小片段小片段(缺口翻譯缺口翻譯 操作簡便操作簡便 DNA/cDNA 探針探針 7071DNA的的5末端標記末端標記(5end labeling) 堿性磷酸酶堿性磷酸酶

10、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 標記原理標記原理 制備寡核苷酸探針制備寡核苷酸探針 制備短的制備短的DNA/RNA探針探針 72DNA的的5末端標記末端標記73四、四、Southern 雜交雜交 Southern blotting/DNA blotting 1975年，年，Edwen Southern等等 印跡印跡(blotting) : 轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 blot: a spot or mark, esp. of ink blotting 741. 印跡的方法印跡的方法 毛細管轉(zhuǎn)移法毛細管轉(zhuǎn)移法 電轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法 真空轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法 75毛細管轉(zhuǎn)移法毛細管轉(zhuǎn)移法 76電轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法77真空轉(zhuǎn)移法真

11、空轉(zhuǎn)移法78792. Southern 雜交的步驟雜交的步驟803. Southern 雜交的應(yīng)用雜交的應(yīng)用 基因的定性及定量分析基因的定性及定量分析 基因的酶切圖譜分析基因的酶切圖譜分析 基因突變分析基因突變分析 RFLP81五、五、Northern 雜交雜交 RNA blotting 步驟步驟 總總RNA/mRNA變性電泳分離變性電泳分離轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移雜交雜交放射自顯影放射自顯影/化學顯色化學顯色 應(yīng)用應(yīng)用檢測組織檢測組織/細胞中細胞中mRNA的大小的大小、量量 比較不同組織比較不同組織/細胞中基因的表達情況細胞中基因的表達情況 82Northern 雜交雜交83六、六、Western 雜交雜交

12、 免疫印跡免疫印跡(immunoblotting) SDS-PAGE轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移蛋白第一抗蛋白第一抗體體標記的第二抗體標記的第二抗體(探針探針)檢測檢測 應(yīng)用應(yīng)用-蛋白質(zhì)的定性定量分析蛋白質(zhì)的定性定量分析8485免疫印跡免疫印跡86 Southern,Northern & Western待測物質(zhì)待測物質(zhì) 支持物支持物 探針探針 轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移方式Southern DNANC 單鏈核酸單鏈核酸 毛細管毛細管/電電/真空真空 Northern RNANC/尼龍尼龍 單鏈核酸單鏈核酸 毛細管毛細管/電電/真空真空 Western 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)NC/PVDF 抗體抗體電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移 87七、原位雜交七

13、、原位雜交(in situ hybridization) 定義定義 種類種類細胞內(nèi)原位雜交細胞內(nèi)原位雜交組織切片原位雜交組織切片原位雜交 基本程序基本程序 細胞細胞/組織固定組織固定預(yù)雜交預(yù)雜交雜交雜交沖洗沖洗 雜交信號檢測雜交信號檢測 分析結(jié)果分析結(jié)果 88組織切片組織切片8990八、斑點雜交八、斑點雜交(dot hybridization)91第三節(jié)第三節(jié) PCR技術(shù)技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) PCR的發(fā)展簡史的發(fā)展簡史 PCR的基本原理和步驟的基本原理和步驟 PCR的影響因素的影響因素 PCR的種類的種類 PCR的應(yīng)用

14、的應(yīng)用92一、一、PCR的發(fā)展簡史的發(fā)展簡史 1971年年,Korana提出核酸體外擴增提出核酸體外擴增的設(shè)想的設(shè)想 1985年年, Mullis 等發(fā)明了等發(fā)明了PCR技術(shù)技術(shù) 1988年年, PE-Cetus公司推出了第一公司推出了第一臺臺PCR儀儀 93二、二、PCR的基本原理和步驟的基本原理和步驟 基本原理基本原理DNA復(fù)制復(fù)制 三個步驟三個步驟變性變性(denaturation) 退火退火(annealing) 延伸延伸(extension) 94PCR的原理的原理95PCR的擴增產(chǎn)物的擴增產(chǎn)物cycle 12345n長片段長片段 246810短片段短片段 002822長短長短 21

15、222324252n96標準的標準的PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 10X 擴增緩沖液：擴增緩沖液： 10ul 模板模板DNA: 0.12ug 引物：引物： 各各0.21umol/L 4種種dNTP: 各各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶：聚合酶： 2.5U 總體積：總體積： 100ul9798三、三、PCR的影響因素的影響因素 模板模板 引物引物 Taq DNA聚合酶聚合酶 4種種dNTP Mg2+ 循環(huán)條件循環(huán)條件 99模板模板 DNA RNAcDNA 對模板的純度對模板的純度要求低要求低100引物引物 長度：長度：1530nt G+C含量：含量：4060%

16、 堿基的隨機分布堿基的隨機分布 避免引物自身和引物之間的互補避免引物自身和引物之間的互補 引物的引物的3端端 引物的引物的5端端 引物濃度：引物濃度：0.21umol/L 101Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5U/100ul 20保存保存 最后加最后加 102底物底物 4種種dNTP 的濃度相等的濃度相等 終濃度：終濃度：200umol/L 103Mg2+ 濃度濃度: 1.52.0mmol/L 過高過高: 非特異擴增非特異擴增 過低過低 : 反應(yīng)產(chǎn)物減少反應(yīng)產(chǎn)物減少 104循環(huán)條件循環(huán)條件 變性溫度和時間變性溫度和時間: 9096, 3060s 退火溫度和時間退火溫度和時間: 4060, 3

17、060sTm=4(G+C)+2(A+T) 延伸溫度和時間延伸溫度和時間7075 (72 )1kb, 1min; 34kb , 34min; 10kb,15min 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù): 2535 105四、四、PCR的種類的種類 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR 原位原位PCR(in situ PCR) 實時實時PCR(real time PCR) 重組重組PCR(recombinant PCR) 錨定錨定PCR(anchored PCR) 反向反向PCR(inverse PCR)106原位原位PCR 原位雜交原位雜交PCR 程序程序 固定細胞固定細胞/組織樣品組織樣品PCR前處理前處理PCR擴增擴增原位雜交及

18、原位雜交及檢測檢測 107實時實時PCR的原理的原理108五、五、PCR的應(yīng)用的應(yīng)用 分子生物學研究分子生物學研究 臨床醫(yī)學臨床醫(yī)學109分子生物學研究分子生物學研究 基因克隆基因克隆 DNA序列測定序列測定 基因的體外定點突變基因的體外定點突變 突變分析突變分析(PCR-SSCP) 基因定量基因定量 110臨床醫(yī)學臨床醫(yī)學 病原體診斷病原體診斷 遺傳病的基因診斷遺傳病的基因診斷 腫瘤檢測腫瘤檢測 法醫(yī)學法醫(yī)學 111第四節(jié)第四節(jié) DNA序列測定序列測定 Sanger 雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法(1977) Maxam-Gilbert化學裂解法化學裂解法(1977) 112Sanger 雙脫

19、氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法 原理原理DNA復(fù)制復(fù)制 反應(yīng)條件反應(yīng)條件 模板模板引物引物 dNTP（其中一種帶放射性標記）其中一種帶放射性標記） ddNTP DNA聚合酶聚合酶113DNA的復(fù)制的復(fù)制1142,3-雙脫氧核苷酸雙脫氧核苷酸(ddNTP)115116117DNA測序操作測序操作118DNA自動測序自動測序 119DNA自動測序儀自動測序儀120第六節(jié)第六節(jié) 生物芯片生物芯片(Biochip) 20世紀世紀90年代年代末末 生物分子之間相互作用的特異性生物分子之間相互作用的特異性 種類種類 細胞芯片、組織芯片、微生物芯片、細胞芯片、組織芯片、微生物芯片、基因芯片基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、蛋白質(zhì)芯片 121基因芯片基因芯片 概念概念 種類種類