堿裂解法提取質(zhì)粒

1、.1 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA.2 通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測(cè)定，學(xué)習(xí)用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理及操作。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?3質(zhì)粒(Plasmid) ：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。 在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋形式存在。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理.4.5質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，具有以下特點(diǎn)： 易于鑒定；易于鑒定； 在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；

2、易于篩選；易于篩選； 易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。 .6二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理高堿高堿細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物釋放細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物釋放染色體染色體DNADNA斷裂成不同長(zhǎng)度的線性雙鏈斷裂成不同長(zhǎng)度的線性雙鏈DNADNA；線性雙鏈線性雙鏈DNADNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；雙鏈雙鏈DNADNA并不完全分離。并不完全分離。高酸高酸中和中和至中至中性性變性的染色體變性的染色體DNADNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶

3、性沉淀物成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中純化純化RNARNA酶消化除去酶消化除去RNARNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì).7 SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。釋放出來的DNA遇到強(qiáng)堿性(NaOH)環(huán)境，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速?gòu)?fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中

4、，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可 將 質(zhì) 粒 D N A 從 細(xì) 菌 中 提 取 出 來 。.8三、主要試劑及作用三、主要試劑及作用溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成組成 (保護(hù)、緩沖保護(hù)、緩沖)葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的減少抽提過程中的 機(jī)械剪機(jī)械剪切作用切作用,防止破壞質(zhì)粒防止破壞質(zhì)粒 (保護(hù)作用保護(hù)作用)EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子, 防止防止DNA酶對(duì)質(zhì)酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用（保護(hù)作用）粒分子的降解作用（保護(hù)作用）Tris-HCl 使

5、溶菌液維持溶菌作用的最適使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）范圍（緩沖作用）8.9 溶液溶液II：由：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與（十二烷基硫酸鈉）與 NaOH 組成組成(裂解、變性裂解、變性)SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性（裂的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性（裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用）解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用）NaOH（PH12）的作用是破壞氫鍵，使）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性分子變性（DNA變性作用）變性作用）9.10溶液溶液III：HAc和和 KAc組成的高鹽溶液組成的高鹽溶液 (復(fù)性，分離復(fù)性，分離) HAc溶液溶液能中和溶液能中和溶液的

6、堿性，使染色體的堿性，使染色體DNA 變性而變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。復(fù)性。KAc會(huì)與會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的淀而除去；溶液中的DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。分離。.11四、試劑配制四、試劑配制 溶液溶液：50mM葡萄糖，葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。 1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄

7、糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min ，貯存于4。 溶液溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配置。 3. 溶液溶液：醋酸鉀（：醋酸鉀（KAc）緩沖液，）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存?zhèn)溆谩?124. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in

8、2高壓濕熱滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?5. 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1） 6. 乙醇（無水乙醇、70%乙醇） 7. 5TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?8. RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20。 .13實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)步步驟驟加加1.5ml1.5ml培養(yǎng)物于培養(yǎng)物于EPEP管，管，12000g12000g30S30S 除去上清，加入冰的除去上清，

9、加入冰的200 200 l l 溶液溶液I I，劇烈振蕩，劇烈振蕩EPEP管，室溫管，室溫3min3min 加入加入300300l l 溶液溶液IIII，快速顛倒數(shù)次，冰浴，快速顛倒數(shù)次，冰浴3min3min 加入加入400400l l 冰冰溶液溶液IIIIII，溫和振蕩，溫和振蕩10s10s，冰浴，冰浴5min5min，12000g12000g5min5min轉(zhuǎn)移上清到新轉(zhuǎn)移上清到新EPEP管，加入等體積管，加入等體積酚酚/ /氯仿氯仿(1:1)(1:1)，溫和振蕩，冰浴，溫和振蕩，冰浴3min3min，12000g12000g5min5min 上層水相轉(zhuǎn)移到新上層水相轉(zhuǎn)移到新EPEP管管，加入，加入2 2倍體積倍體積無水乙醇無水乙醇，顛倒混勻，顛倒混勻，-20 -20 冰箱中放置冰箱中放置15min15min，12000g12000g 10min10min 棄上清，沉淀中