生化鑒定原理

1、致病菌檢測生化鑒定原理及應用致病菌檢測生化鑒定原理及應用 三糖鐵瓊脂試驗三糖鐵瓊脂試驗 靛基質(zhì)試驗靛基質(zhì)試驗 ONPG試驗試驗 甲基紅甲基紅MR試驗試驗 VP試驗試驗 尿素酶試驗尿素酶試驗 賴氨酸脫羥酶試驗賴氨酸脫羥酶試驗 淀粉水解酶試驗淀粉水解酶試驗 膽汁七葉苷水解試驗膽汁七葉苷水解試驗 糖（醇、苷）類發(fā)酵糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗試驗 甘油復紅試驗甘油復紅試驗 葡萄糖酸氧化試驗葡萄糖酸氧化試驗 氧化發(fā)酵試驗氧化發(fā)酵試驗 枸櫞酸鹽利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗 呼吸酶類試驗呼吸酶類試驗 硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原試驗1三糖鐵瓊脂試驗三糖鐵瓊脂試驗 本培養(yǎng)基適合于腸桿菌科的鑒定。用于觀察細菌對糖的利用和硫

2、化氫（變黑）的產(chǎn)生。 該培養(yǎng)基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例為10:10:1，只能利用葡萄糖的細菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。而發(fā)酵乳糖的細菌(e.coli)，則產(chǎn)生大量的酸，使整個培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色。如培養(yǎng)基接種后產(chǎn)生黑色沉淀，是因為某些細菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應，生成黑色的硫化亞鐵沉淀。2三糖鐵瓊脂試驗三糖鐵瓊脂試驗 志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生H2S。大腸桿菌，能分解

3、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產(chǎn)生H2S。沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，大多數(shù)產(chǎn)生H2S，多數(shù)產(chǎn)氣。3靛基質(zhì)試驗靛基質(zhì)試驗 某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），當加入吲哚試劑（對位二甲氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰吲哚。 4半乳糖苷酶試驗（半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）試驗） 原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和半乳糖苷酶才能快速分解。有些細菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸

4、櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。 應用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細菌的快速鑒定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細菌均可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。5甲基紅（甲基紅（MR）試驗）試驗 原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)基pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑呈紅色。如細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如醇、醛、酮、氣體和水），培養(yǎng)基pH在 5.4以上，加入甲基紅指示劑呈桔黃色。 應用：常

5、用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性。6VP試驗試驗 原理：測定細菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。某些細菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物。即V-P試驗陽性。 應用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試驗常與MR試驗一起使用，一般情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細菌不一定都這樣規(guī)律，如蜂房哈夫尼亞菌和奇異變形

6、桿菌的VP試驗和MR試驗常同為陽性。7尿素酶試驗 原理：某些細菌具有尿素酶，在含有尿素的培養(yǎng)基中，分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基呈堿性，此時培養(yǎng)基中的酚紅指示劑顯紅色。8賴氨酸脫羥試驗 賴氨酸脫酸主要用于腸桿菌科細菌的鑒定，也可用于某些非發(fā)酵菌。試驗關培養(yǎng)基中含有賴氨酸和葡萄糖，酸堿指示劑為溴甲酚紫（中性和堿性時紫色，酸性黃色），未用時為紫色。如果待測細菌將賴氨酸脫羧，則產(chǎn)生胺，為堿性，溴甲酚紫保持紫色，如果不脫羧，腸桿菌科的細菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸，溴甲酚紫變?yōu)辄S色。氨基酸脫羧的對照管其實就是一個葡萄糖發(fā)酵管，不含氨基酸。由于實驗結(jié)果陽性的為保持紫色不變，陰性結(jié)果為黃色，為保證結(jié)果的可靠性，須同時

7、接種對照管，如對照管變?yōu)辄S色，說明細菌接種成功，證實試驗管紫色（不變色）卻為陽性，而非未接種好細菌。此外，由于氨基酸脫羧的產(chǎn)物為尸胺、腐胺等，遇氧不穩(wěn)定，故各管接種完細菌后，需加入幾滴液體石蠟隔絕空氣，保持胺的穩(wěn)定性。9淀粉水解試驗淀粉水解試驗 原理：產(chǎn)生淀粉酶的細菌能將淀粉水解為糖類，在培養(yǎng)基上滴加碘液時，可在菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)。 應用：用于白喉棒狀桿菌生物型的分型，重型淀粉水解試驗陽性，輕、中型陰性；芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定。10膽汁七葉苷水解試驗膽汁七葉苷水解試驗 原理：在10%40膽汁存在下，測定細菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細菌分解生成的七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的

8、二價鐵離子發(fā)生反應形成黑色化合物。 應用：主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。D群鏈球菌本試驗為陽性。11糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗 原理：不同種類細菌含有發(fā)酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而對各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細菌對培養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒定細菌種類。 應用：糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗，是鑒定細菌的生化反應試驗中最主要的試驗，不同細菌可發(fā)酵不同的糖（醇、苷）類，如沙門菌可發(fā)酵葡萄糖，但不能發(fā)酵乳糖，大

9、腸埃希菌則可發(fā)酵葡萄糖和乳糖。即便是兩種細菌均可發(fā)酵同一種糖類，其發(fā)酵結(jié)果也不盡相同，如志賀菌和大腸埃希菌均可發(fā)酵葡萄糖，但前者僅產(chǎn)酸，而后者則產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，故可利用此試驗鑒別細菌。12甘油復紅試驗甘油復紅試驗 原理：甘油可被細菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脫去羧基為乙醛，乙醛與無色的復紅生成醌式化合物，呈深紫紅色。 應用：主要用于沙門菌屬內(nèi)各菌種間的鑒別。傷寒沙門菌、甲（丙）型副傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、孔道夫沙門菌和仙臺沙門菌本試驗為陰性，乙型副傷寒沙門菌結(jié)果不定，其它不常見沙門菌多數(shù)為陽性。13葡萄糖酸氧化試驗葡萄糖酸氧化試驗 原理：某些細菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成-酮基葡萄糖酸。-酮基葡萄糖酸是

10、一種還原性物質(zhì)，可與班氏試劑起反應，出現(xiàn)棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。 應用：主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群。14氧化發(fā)酵試驗氧化發(fā)酵試驗 原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進行無氧降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，而氧化型細菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發(fā)酵（O/F或HughLeifson，HL）試驗，可用于區(qū)別細菌的代謝類型。 應用：主要用于腸桿菌科與其它非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化型）。15

11、枸櫞酸鹽利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗 原理：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中枸櫞酸鈉為碳的唯一來源，磷酸二氫銨是氮的唯一來源。有的細菌能利用枸櫞酸鈉為碳源，能在培養(yǎng)基上生長，并且能分解枸櫞酸鹽，最后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍指示劑由綠色變?yōu)樯钏{色綠色變?yōu)樯钏{色。不能利用枸櫞酸鹽為碳源的細菌在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。16呼吸酶類試驗呼吸酶類試驗 氧化酶試驗原理：某些細菌具有氧化酶，能將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺試劑氧化（先使細胞色素C氧化，電子傳遞體）成紅色醌類化合物。 該實驗用于分辨革蘭氏陰性桿菌中的腸桿菌科（陰性）與弧菌科（陽性）。 觸酶活力試驗原理：具有觸酶的細菌能催化過氧化酶，放出生態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。方法：取3%過氧化氫0.5ml，滴加到不含血液的被檢細菌瓊脂培養(yǎng)物上，或滴加到不含血液的肉湯培養(yǎng)物中，觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)物出現(xiàn)氣泡出現(xiàn)氣泡者為陽性者為陽性。17硝酸鹽還原試驗硝