循環(huán)腫瘤標志物CTC檢測技術在肺部小結節(jié)診斷中的最新進展-培訓課件

1、循環(huán)腫瘤標志物（CTC）檢測技術在肺部小結節(jié)診斷中的最新進展格諾生物格諾生物 劉雙劉雙Lung Cancer in Solid Tumor in ChinaLDCT篩查降低肺癌死亡率NLST research team. NEJM, 2011胸部CT篩查與過度診療的悖論大部分非實性成分的結節(jié)為良性疾病26.2%自行消失僅3%確診為肺癌將所有肺部結節(jié)計算在內，假陽性率為21.8%-26.6%左右Pinsky FR, et al. Ann Intern Med, 2015 比較了兩個大型臨床研究的假陽性率 NEJM發(fā)表的NLST研究中假陽性率第一次篩查為26.6%，第二次篩查為21.8%如何解決？

2、第1-3次胸部CT篩查相比，第4次行胸部CT時 I期肺癌的比例下降20%如何解決？PET-CT對于肺部良性結節(jié)，假陽性率約45%Veronesi G, et al. Ann Int Med 2012如何解決？ 創(chuàng)傷性檢查 不良反應大 部分患者無法耐受肺癌病理活檢局限性 成本高 術后并發(fā)癥 對于部分年老或合并基礎疾病的患者如何解決: 能否有更敏感的腫瘤標志物來幫助診斷液態(tài)活檢在肺癌中的應用液態(tài)活檢在肺癌中的應用治療策略事件肺癌待查輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復發(fā)監(jiān)測治療方案選擇療效評估耐藥機理新藥研發(fā)治療策略事件疑似肺癌輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復發(fā)監(jiān)測治療方案選擇耐藥機理新藥研發(fā)CT

3、C的臨床應用價值療效評估CTC(數(shù)量）(負向富集+靶向PCR）ctDNA(基因變異）1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015什么是循環(huán)腫瘤細胞（什么是循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor CellCirculating Tumor Cell，CTCCTC）？）？腫瘤釋放如外周血中腫瘤釋放如外周血中CTCsCTCs數(shù)量的多少數(shù)量的多少，可間接反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)，可間接反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CTCCTC：在腫瘤發(fā)生過程中，具有干細胞特征的腫

4、瘤細胞和不具有干細胞特征的腫瘤細胞，均由原發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell）CTC1CTCCTC有轉移有轉移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC（disseminated Tumor Cell），只有由具有干細胞特征干細胞特征的DTC所形成形成的微轉移灶的微轉移灶，逃避免疫識別逃避免疫識別才可能發(fā)展成為腫瘤遠處轉移2CK+ cellsHER-2+ cells第9周的乳腺管組織切片：乳腺管周圍非典型性增生第30周的腫瘤組織切片：新生的腫瘤上皮細胞形成牙槽并侵襲周圍基質什么時候可以檢測到CTC？早期腫瘤外周血中即可檢出CTCW He, et

5、 al. Proc Natl Acad Sci, 2007早期腫瘤外周血中即可檢出CTCl表達中等量FR的M109鼠肺癌細胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側面l移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細胞l移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測7個和18個CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升l在腫瘤移植的前4周內，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)到存在轉移性癌癥的跡象CTC富集技術密度與大小免疫磁珠（負向富集 or 陽性富集)微流體CTC檢測方法CTC檢測技術靶向PCR免疫熒光普通PCR=+“方法”“收獲”“垃圾”蟹餌沒水了，我們躲不了了放水負向富集負向富集

6、優(yōu)勢：回收率100%劣勢：純度略低正向富集正向富集優(yōu)勢：純度高劣勢：回收率低（漏掉CTC）幸好沒貪嘴，我們逃了“方法”“收獲”“垃圾”沒水了，我們躲不了了放水負向富集負向富集優(yōu)勢：回收率100%劣勢：純度略低大小富集（大小富集（ISETISET）優(yōu)勢：簡單劣勢：漏掉小的CTC細胞幸好沒吃胖，我們逃了網(wǎng)篩CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術負向富集靶向PCRFR陽性靶標l肺癌細胞FR(葉酸受體）高度表達lCTC：FR=1:50萬lEMT轉化不影響FR豐度l其他血細胞不表達FRlCTC回收率接近100%l磁珠富集易操作和自動化l靈敏度超高靈敏度超高，負向富集即可檢測l信號二次放大

7、，1: 1012倍放大l無需人工經(jīng)驗判讀，結果客觀準確l可實現(xiàn)CTC的定量CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測格諾格諾CytoploRare 靈敏度最高的檢測技術l 特異性DNA PCR擴增-提高敏感性l FR靶向：高特異性探針l 1 CTC in 6,000,000（可在600萬個背景細胞中檢測出一個CTC）CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測靶向PCR，信號放大，保證高度敏感性1個CTC信號放大1012倍CytoploR

8、are FR靶向PCR CTC檢測敏感性試驗：1ctc in 1,200,000白細胞Jiatao Lou, et al. Plos One 2013l 將不同數(shù)量的FR陽性腫瘤細胞分別摻入3ml全血(1.2-3.0X107）l FR靶向PCR CTC檢測技術的回收率接近100%，且呈線性分布l檢測靈敏度約為5.09/（1.23*107）=1/240萬600萬摻入細胞數(shù)量摻入細胞數(shù)量( (個個) )復管復管1 1復管復管2 2復管復管3 3檢測均檢測均值值檢出細胞數(shù)檢出細胞數(shù)( (個個) )回收率回收率(%)(%)平均回收率平均回收率(%)(%)R R600571.52 565.13 586.

9、37 574.34 584.12 97.35 98.75 0.9990.9998 8200198.93 192.81 185.90 192.55 192.46 96.23 5056.56 52.07 50.80 53.14 49.44 98.89 59.90 9.26 10.58 9.91 5.09 101.87 0 05.00 5.44 4.40 4.95 0.00 /l 將不同數(shù)量的FR陽性腫瘤細胞分別摻入3ml全血(1.2-3.0X107）l 檢測靈敏度約為5.09/（1.23*107）=1/240萬600萬CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測敏感性試驗：1ctc in 6

10、,000,000白細胞CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術FR（葉酸受體，高度特異性的靶向探針）l 特異性高：特異性高：加入FR靶向探針前，加入高濃度葉酸封閉細胞表面的葉酸受體，檢測結果為陰性l 背景表達：背景表達：去除FR靶向探針，僅保留特異性DNA片段，與保留FR靶向探針相比，檢測結果一致，提示背景可能為特異性DNA片段所致的固定值Jiatao Lou, et al. Plos One 20132004Cell Search: 乳腺癌中檢測出，但肺癌敏感性低2011Cell Research: 采用的

11、抗體采用的抗體(EpCAM)對對EMT細胞特異性差細胞特異性差，而肺癌細胞轉移入血需要EMT的過程EpCAM陰性細胞中，存在大量CTC Cell Research系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做為探針 研究證實，EpCAM陰性的細胞中也存在CTCJiatao Lou, et al. Plos One 2013l 有報道，部分激活的巨噬細胞存在FR的高表達1l 臨床前研究證實，這部分巨噬細胞很少在正常人的外周血中出現(xiàn)2l 使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬細胞后，CTC的檢測結果無明顯改變31、He W, et al. Int J Cancer 2008; 2、He W, et al. Pr

12、oc Natl Acad Sci, 2007; 3、Jiatao Lou, et al. Plos One 2013CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術巨噬細胞（可能存在FR表達）不影響檢測結果CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術同一患者重復檢測，可重復性高CytoploRarel 敏感性l 特異性l 可重復性l 臨床應用便捷性3mL血6個小時得到報告檢測流程檢測流程肺癌領域，CTC檢測技術對比CytoploRare（格諾）CellSearchCyttelTM（北京萊爾）Canpatro

13、lTM（益善）CTC-Biopsy（武漢友之友)核心技術免疫磁珠負向富集靶向配體PCR技術 流式正向富集技術熒光標記免疫磁珠負向富集、Fish技術ISET（濾膜）原位雜交RNA分析ISET（濾膜)熒光標記特異性88%80%83%75%70%靈敏度80%30%腺癌：46%30%30%自動化半自動全自動半自動半自動全自動血樣體積3mL7.5mL4mL5mL10mL適應癥早、中和晚期早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌腫晚期癌腫早期（I期）敏感性68%0%20%(2/10)未報道未報道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%報告時間6h

14、/12樣本樣本6h/8樣本48h/1樣本48h/1樣本3天可視化否否是是是是1210例受試者肺癌560例肺部良性疾病350例其他腫瘤 (150例) 肝癌 30例結直腸癌 30例 乳腺癌 30例 胃癌 30例 食管癌 30例331例A A100例B B 50例C C（21例DD) 79例D DA: 基線CTC檢測B：術前術后CTC監(jiān)測C：一線含鉑雙藥化療中CTC監(jiān)測D：基線CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE檢測 300例A A 50例D D健康人150例100例A A 50例D D150例A A非動態(tài)研究非動態(tài)研究 肺癌 560例A A肺部良性疾病 350例A A 健康人 150

15、例A A 動態(tài)監(jiān)測研究動態(tài)監(jiān)測研究 非小細胞肺癌 100例B B 50例C C對比研究對比研究 肺癌 100例D D 肺部良性疾病 50例D D 健康人 50例D D腫瘤特異性研究腫瘤特異性研究 其他腫瘤 150例A A FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC檢測技術檢測技術臨床試驗設計（1210例, 全國肺癌CTC研究最大樣本量）Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015參加單位：上海市肺科醫(yī)院上海市胸科醫(yī)院上海市胸科醫(yī)院醫(yī)科院腫瘤醫(yī)院

16、特征特征例數(shù)例數(shù)(%)(%)肺癌（肺癌（n=560n=560）年齡（平均值，范圍）59.3歲(21-79歲)性別（男性/女性）349/211TNMTNM分期分期期期150(26.8%)150(26.8%)期48(8.6%)期157(28.0%)期205(36.6%)病理亞型病理亞型非小細胞肺癌465(83.0%)肺腺癌320(68.8%)肺鱗癌107(23.0%)大細胞肺癌5(1.1%)肺腺鱗癌1(0.2%)其他非小細胞肺癌32(6.9%)小細胞肺癌81(14.5%)其他肺癌14(2.5%)肺部良性疾?。ǚ尾苛夹约膊。╪=350n=350）42患者特征Jiatao Lou, et al. Pl

17、os One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC檢測技術檢測技術葉酸受體陽性CTC作為肺癌診斷的標志物43 最大樣本量最大樣本量CTCCTC檢測數(shù)據(jù)檢測數(shù)據(jù) CutoffCutoff： 8.70 CTC Units/3mL敏感性：敏感性：79.6%79.6%特異性：特異性：88.2%88.2%Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013; Xiaoxia Che

18、n, et al. JTO 2015AUC: 0.8797FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC檢測技術檢測技術敏感性高 I期肺癌敏感性67.2%67.2%NSCLC患者與對照組的CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-AgROC曲線分析不同標志物在NSCLC和I期NSCLC患者中的靈敏度不同標志物在對照組的特異度檢測方法cutoff值特異度（%）約登指數(shù)I期NSCLC靈敏度（%）AUC（95%CI）CTC8.64/ml84.10.57367.20.823 (0.773-0.874)NSE18 ng/ml95.90.0554.60.585 (0.495-0.675

19、)CEA5 ng/ml94.90.2518.50.76 (0.69-0.83)CA12535 U/ml97.60.1754.60.505 (0.417-0.592)Cyfra21-13.3 ng/ml900.35232.30.716 (0.615-0.816)SCC-Ag1.5 ng/ml93.80.1512.30.624 (0.535-0.713)FR-CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-Ag對NSCLC和早期NSCLC患者的診斷效率Yue Yu, et al. Transl Oncol 20131cm肺癌總體敏感性: 62.5%62.5%患者編號患者編號CTC

20、Units/3mL病理診斷病理診斷TNM分期分期臨床分期臨床分期-整理整理nodule diameter（CT）1 10.53 肺腺癌T1aN0M00.32 0.04 肺腺癌T1N0M00.33 3.83 肺腺癌T1N0M00.54 8.78 肺腺癌tisTis0.55 8.77 肺腺癌T1aN0M00.66 3.93 肺腺癌T1N0M00.77 3.98 肺腺癌T2aN0M00.88 4.84 肺腺癌T1N0M00.89 10.32 肺腺癌T1aN0M0110 13.55 肺鱗癌T1N0M0111 6.29 肺腺癌T1aN0M0112 12.65 肺腺癌T1N0M0113 14.999074

21、肺腺癌T1aN0M00.314 2.5497534肺腺癌T1aN0M00.515 6.2322726肺腺癌T1aN0M00.516 11.312907肺腺癌T1aN0M00.617 14.444199肺腺癌T1aN0M00.618 7.1141741肺腺癌T1aN0M00.719 11.134588肺腺癌T1N0M00.720 11.56小細胞肺癌T2aNxM00.721 13.461248肺腺癌T1aN0M00.722 10.009388肺腺癌T1aN0M00.8腫瘤大小CT特異性（） CTCTC特異性（）30 mm (n134）59.79420-30 mm (n44 )65.995.510-20mm (n69 )55.192.810mm (n21)61.995.2CTC聯(lián)合CT可以大大提高小結節(jié)診斷的特異性CTC輔助CT可以將小結節(jié)的判別假陽性率降低到10%Lou JT, Wang L, et al In submission上海市胸科醫(yī)院：病例一腫瘤標志物腫瘤標志物檢測值檢測值結果結果正常值正常值CTC10.45CU/3mL10.45CU/3mL升高升高8.7CEA1.29ng/mL正常0-10CYFRA21-13.26ng/mL正常0-3.3NSE13.0ng/mL正常0-20SCCA0.9ng/mL正常0-3CA12511.6U/mL正常