第八章基因重組蛋白包涵體的復(fù)性

1、第八章第八章 基因重組蛋白包涵體的分離和復(fù)性基因重組蛋白包涵體的分離和復(fù)性 北京化工大學(xué)北京化工大學(xué) 譚天偉教授譚天偉教授 重組蛋白的復(fù)性概述重組蛋白的復(fù)性概述 包涵體的形成包涵體的形成 包涵體的分離純化包涵體的分離純化 蛋白質(zhì)復(fù)性方法蛋白質(zhì)復(fù)性方法基因重組蛋白包涵體的分離和復(fù)性基因重組蛋白包涵體的分離和復(fù)性 包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性基因工程表達(dá)產(chǎn)物后處理的特殊性8.1 重組蛋白質(zhì)重組蛋白質(zhì) 大腸桿菌的重組菌 有多種可選擇的質(zhì)粒；有多種可選擇的質(zhì)粒； 重組遺傳背景清楚，基因表達(dá)易于控制；重組遺傳背景清楚，基因表達(dá)易于控制； 蛋白表達(dá)量高（可達(dá)總蛋白蛋白表達(dá)量高（可達(dá)總蛋

2、白5050）；）； 酵母 易于糖基化和正確形成二硫鍵；易于糖基化和正確形成二硫鍵； 表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外，易分離純化；表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外，易分離純化； 易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn) 動(dòng)物細(xì)胞 產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)液，易分離純化；產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)液，易分離純化； 重組蛋白活性和天然蛋白一樣；重組蛋白活性和天然蛋白一樣； 表達(dá)質(zhì)粒易于得到；表達(dá)質(zhì)粒易于得到； 重組細(xì)胞可以大規(guī)模培養(yǎng)重組細(xì)胞可以大規(guī)模培養(yǎng) 補(bǔ)充：蛋白質(zhì)在補(bǔ)充：蛋白質(zhì)在E.coli中的表達(dá)中的表達(dá)518.2 包涵體的形成包涵體的形成包涵體形成的幾種可能性包涵體形成的幾種可能性研究發(fā)現(xiàn)：研究發(fā)現(xiàn)：低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體低表達(dá)時(shí)很少形成

3、包涵體，表達(dá)量越高越易形成包涵體。，表達(dá)量越高越易形成包涵體。1）少量蛋白產(chǎn)生時(shí)是可溶的，表達(dá)量過(guò)高，積聚量超過(guò)其在細(xì)胞少量蛋白產(chǎn)生時(shí)是可溶的，表達(dá)量過(guò)高，積聚量超過(guò)其在細(xì)胞內(nèi)溶解度時(shí)沉淀；內(nèi)溶解度時(shí)沉淀；2）合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)；正確配對(duì)；3）蛋白產(chǎn)生量過(guò)多，所需其他成分蛋白產(chǎn)生量過(guò)多，所需其他成分(如折疊酶和一系列翻譯后修飾如折疊酶和一系列翻譯后修飾酶及分子伴侶等酶及分子伴侶等)不足；不足；4 4）重組蛋白的氨基酸組成，）重組蛋白的氨基酸組成，一般說(shuō)來(lái)含硫氨基酸越多、一般說(shuō)來(lái)含硫氨基酸越多、Pr

4、oPro含量越含量越高越容易形成包涵體。高越容易形成包涵體。5 5）重組蛋白所處的環(huán)境：）重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高時(shí)容易形成包涵體。發(fā)酵溫度高時(shí)容易形成包涵體。6 6）有報(bào)道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)有報(bào)道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)培養(yǎng)條件不佳時(shí)，容易形成包涵體。條件不佳時(shí)，容易形成包涵體。減少包涵體形成的策略減少包涵體形成的策略1）降低重組菌的生長(zhǎng)溫度：）降低重組菌的生長(zhǎng)溫度：較低的生長(zhǎng)溫度降低了無(wú)較低的生長(zhǎng)溫度降低了無(wú)活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。涵體的形成。2）添加

5、可添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的添加劑，促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的添加劑，如：如：培養(yǎng)培養(yǎng)E.coli時(shí)添加時(shí)添加乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低低分子量的巰基或二硫化合物分子量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）等。從而影響二硫鍵的形成）等。3）供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，）供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如如供氧、供氧、pH等。等。包涵體形成：有利因素1 1、包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)濃度比較高，、包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)濃度比較高，有時(shí)甚至可以達(dá)有時(shí)甚至可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白含量的到細(xì)胞總蛋白含量的40%

6、40%2 2、重組蛋白質(zhì)以包涵體形式存在重組蛋白質(zhì)以包涵體形式存在包埋了酶攻擊的位點(diǎn)，包埋了酶攻擊的位點(diǎn)，可以最大限度地可以最大限度地抵抗蛋白質(zhì)酶的攻擊抵抗蛋白質(zhì)酶的攻擊3 3、分離、分離比可溶蛋白質(zhì)的分離方法比可溶蛋白質(zhì)的分離方法簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便，造價(jià)低，造價(jià)低，使用簡(jiǎn)單，使用簡(jiǎn)單的離心或者過(guò)濾的手段就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白的離心或者過(guò)濾的手段就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)成分進(jìn)行有效的分離質(zhì)成分進(jìn)行有效的分離4 4、有些表達(dá)的外源蛋白質(zhì)有些表達(dá)的外源蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞有毒性或者致死，對(duì)細(xì)胞有毒性或者致死，大量表大量表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，最終的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)?；達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，最終

7、的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)?；而包涵體形式的蛋白質(zhì)因喪失了生物活性而包涵體形式的蛋白質(zhì)因喪失了生物活性高效地表達(dá)高效地表達(dá)包涵體加工流程包涵體加工流程去除細(xì)胞碎片（ 膜蛋白和脂類等）包涵體提取如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行高效體外復(fù)性高效體外復(fù)性以獲得活性產(chǎn)品以獲得活性產(chǎn)品是生物工程產(chǎn)業(yè)是生物工程產(chǎn)業(yè)化經(jīng)常面臨的一個(gè)難題化經(jīng)常面臨的一個(gè)難題8.3 包涵體的提取、溶解與純化包涵體的提取、溶解與純化8.3 包涵體的提取、溶解與純化包涵體的提取、溶解與純化 包涵體的提取 細(xì)胞破碎，包涵體的分離細(xì)胞破碎，包涵體的分離 包涵體的洗滌 對(duì)包涵體用對(duì)包涵體用Tris-HCl緩沖液反復(fù)洗滌幾次緩沖液反復(fù)洗

8、滌幾次 緩沖液通常含有緩沖液通常含有Triton-X100、脫氧膽酸鹽、尿素、脫氧膽酸鹽、尿素、 PMSF等等 對(duì)包涵體中含的雜蛋白的洗滌最高可對(duì)包涵體中含的雜蛋白的洗滌最高可 采用采用5M的尿素的尿素 包涵體的溶解 如如5-6M的鹽酸胍或的鹽酸胍或6-8M的尿素，同時(shí)還要加入還原劑，打開錯(cuò)配的尿素，同時(shí)還要加入還原劑，打開錯(cuò)配 的二硫鍵，如二硫蘇糖醇（的二硫鍵，如二硫蘇糖醇（DTT）、）、2-巰基乙醇、巰基乙醇、DET或半胱氨酸或半胱氨酸 等，等，pH一般維持在一般維持在8左右左右 包涵體的純化 包涵體溶解后可以通過(guò)膜過(guò)濾、包涵體溶解后可以通過(guò)膜過(guò)濾、RPLC、RP-HPLC、凝膠過(guò)濾、凝膠

9、過(guò)濾、 離子交換層析或金屬親和層析等方法實(shí)現(xiàn)離子交換層析或金屬親和層析等方法實(shí)現(xiàn)表達(dá)蛋白表達(dá)蛋白洗滌劑洗滌劑pHpH人干擾素人干擾素3 3突變體（突變體（hIL-3hIL-3）7M尿素尿素,0.5Triton X-100未報(bào)道未報(bào)道人尿激酶原（人尿激酶原（Pro-UkPro-Uk）05M PBS,2% Triton X-1007.5HIV-1 Gag p24HIV-1 Gag p24蛋白蛋白1 Triton100 X-100未報(bào)道未報(bào)道大鼠釉原蛋白（大鼠釉原蛋白（AmAm）50mM Tris-Cl,10mM EDTA100mM NaCl,0.5 Triton X-1008.0抗人結(jié)腸癌單鏈抗體

10、（抗人結(jié)腸癌單鏈抗體（CL-3CL-3）1mg/ml DOC,50mM TE1% Triton X-100未報(bào)道未報(bào)道人人FLT3FLT3配體配體3M尿素尿素,0.1M Tris-Cl8.0重組干擾素（重組干擾素（IFN-IFN-）50mM Tris-Cl,100mM NaCl,0.5mM EDTA3M尿素尿素,0.2% Triton X-1008.0人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTFCNTF）STE,2M尿素尿素,0.05Triton X-1008.0人尿激酶原（人尿激酶原（Pro-UkPro-Uk）50mM Tris-Cl,5M尿素尿素0.5Triton X-1007.5血管

11、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF165VEGF165）2M NaCl,0.5Triton X-1004M尿素尿素未報(bào)道未報(bào)道包涵體形成的機(jī)制：包涵體形成的機(jī)制： UIN U U：指完全去折疊的狀態(tài)，：指完全去折疊的狀態(tài)， I I：指折疊中間體（也稱融球態(tài)：指折疊中間體（也稱融球態(tài) molten globule statemolten globule state） N N：指天然的成熟的狀態(tài)：指天然的成熟的狀態(tài)8.4 重組蛋白的體外復(fù)性重組蛋白的體外復(fù)性 蛋白質(zhì)復(fù)性機(jī)蛋白質(zhì)復(fù)性機(jī)理理蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中，涉及兩種疏水相互作用：蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中，涉及兩種疏水相互作用：一是一是分子內(nèi)的疏水

12、相互作用分子內(nèi)的疏水相互作用促使蛋白質(zhì)正確折疊促使蛋白質(zhì)正確折疊二是二是肽鏈分子間的疏水相互作用肽鏈分子間的疏水相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集，形導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集，形成寡聚體和多聚體成寡聚體和多聚體再進(jìn)一步聚集形成沉淀再進(jìn)一步聚集形成沉淀n 兩者互相競(jìng)爭(zhēng)，影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率。兩者互相競(jìng)爭(zhēng)，影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率。n 復(fù)性過(guò)程中，復(fù)性過(guò)程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提以防止聚集，是提高復(fù)性收率的關(guān)鍵。高復(fù)性收率的關(guān)鍵。局部肽段先由氫鍵形成一些二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元，如螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角等影響復(fù)性效率的因素影響復(fù)性效率的因素 1 1）蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)）蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有

13、些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有酶有12對(duì)二硫鍵，在較對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL-11；一般說(shuō)來(lái)，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復(fù)性效率在一般說(shuō)來(lái)，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復(fù)性效率在20%左右左右 影響復(fù)性效率的因素影響復(fù)性效率的因素2 2）蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度）蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度I向向N的轉(zhuǎn)化是的轉(zhuǎn)化是一級(jí)一級(jí)反應(yīng)，而聚沉是反應(yīng)，而聚沉是二級(jí)或多級(jí)二級(jí)或多級(jí)反應(yīng)反應(yīng)聚沉的反應(yīng)速度與蛋白質(zhì)濃度的平方

14、或高次方成正比聚沉的反應(yīng)速度與蛋白質(zhì)濃度的平方或高次方成正比而復(fù)性反應(yīng)過(guò)程與蛋白質(zhì)濃度的一次方成正比，故濃度越而復(fù)性反應(yīng)過(guò)程與蛋白質(zhì)濃度的一次方成正比，故濃度越大，聚沉反應(yīng)越明顯。大，聚沉反應(yīng)越明顯。n 復(fù)性時(shí)蛋白質(zhì)濃度宜低復(fù)性時(shí)蛋白質(zhì)濃度宜低（低濃度時(shí)，獲得的蛋白質(zhì)復(fù)性（低濃度時(shí)，獲得的蛋白質(zhì)復(fù)性效率比高濃度要好的多）效率比高濃度要好的多）n 另一方面另一方面濃度過(guò)低又給后處理帶來(lái)不便濃度過(guò)低又給后處理帶來(lái)不便，一般選擇，一般選擇1010100g100gmlml，以避免分子間相互作用力引起聚集。，以避免分子間相互作用力引起聚集。影響復(fù)性效率的因素影響復(fù)性效率的因素3 3）變性劑濃度和復(fù)性時(shí)間

15、）變性劑濃度和復(fù)性時(shí)間在在高濃度變性劑高濃度變性劑存在時(shí)，蛋白質(zhì)主要以存在時(shí)，蛋白質(zhì)主要以U存在（存在（6mol/L 鹽鹽酸胍、酸胍、8mol/L Urea等）；在等）；在中間濃度中間濃度時(shí)（時(shí)（較低濃度較低濃度的鹽的鹽酸胍和酸胍和Urea），主要以），主要以I存在，即能抑制蛋白質(zhì)分子間的存在，即能抑制蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用，又不會(huì)妨礙蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水相互作用疏水相互作用，又不會(huì)妨礙蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水相互作用A方向被阻止。方向被阻止。由于由于I向向N轉(zhuǎn)化是一個(gè)慢的過(guò)程，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在此時(shí)放置較長(zhǎng)轉(zhuǎn)化是一個(gè)慢的過(guò)程，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在此時(shí)放置較長(zhǎng)的一段時(shí)間，的一段時(shí)間，I就可以慢慢地向就可以慢慢地向N轉(zhuǎn)化

16、轉(zhuǎn)化影響復(fù)性效率的因素影響復(fù)性效率的因素4 4）氧化還原環(huán)境）氧化還原環(huán)境復(fù)性不僅要降低或去除變性劑，同時(shí)必須提供復(fù)性不僅要降低或去除變性劑，同時(shí)必須提供SH-氧化形氧化形成成S-S的環(huán)境的環(huán)境合適的氧化還原環(huán)境合適的氧化還原環(huán)境采用采用配對(duì)的氧化型和還原型巰基物質(zhì)配對(duì)的氧化型和還原型巰基物質(zhì)配對(duì)低分子量巰基試劑包括配對(duì)低分子量巰基試劑包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巰基、半胱氨酸或巰基乙醇乙醇/胱氨酸等。通常還原型巰基物質(zhì)的使用濃度為胱氨酸等。通常還原型巰基物質(zhì)的使用濃度為l3mmol/L，還原型，還原型/氧化型的摩爾比為氧化型的摩爾比為10：1或或5：1。 影響復(fù)性效率的因素影響復(fù)性效率的

17、因素5 5）pH和溫度和溫度最適宜的復(fù)性最適宜的復(fù)性pH值應(yīng)大于值應(yīng)大于7.0（一般一般8.0-9.0），以防止自），以防止自由由SH-的質(zhì)子化作用影響正確配對(duì)的的質(zhì)子化作用影響正確配對(duì)的S-S的形成。的形成。應(yīng)避免在蛋白質(zhì)應(yīng)避免在蛋白質(zhì)pI處進(jìn)行復(fù)性（蛋白質(zhì)的靜電排斥力幾乎處進(jìn)行復(fù)性（蛋白質(zhì)的靜電排斥力幾乎為零，相互間疏水作用區(qū)域就容易作用而形成為零，相互間疏水作用區(qū)域就容易作用而形成A）。）。溫度過(guò)高，蛋白質(zhì)的聚集將十分嚴(yán)重，低溫下聚集和折疊溫度過(guò)高，蛋白質(zhì)的聚集將十分嚴(yán)重，低溫下聚集和折疊反應(yīng)都很慢，隨著溫度的上升二者的速度都加快反應(yīng)都很慢，隨著溫度的上升二者的速度都加快常在室常在室溫下

18、進(jìn)行溫下進(jìn)行影響復(fù)性效率的因素影響復(fù)性效率的因素6 6）折疊促進(jìn)劑）折疊促進(jìn)劑 能夠促進(jìn)蛋白再折疊的化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱為折疊促進(jìn)劑，折疊促能夠促進(jìn)蛋白再折疊的化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱為折疊促進(jìn)劑，折疊促進(jìn)劑的作用原理在于穩(wěn)定復(fù)性蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、抑制肽鏈進(jìn)劑的作用原理在于穩(wěn)定復(fù)性蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、抑制肽鏈間的疏水相互作用。間的疏水相互作用。應(yīng)用于蛋白質(zhì)復(fù)性并具有顯著效果的折疊促進(jìn)劑有應(yīng)用于蛋白質(zhì)復(fù)性并具有顯著效果的折疊促進(jìn)劑有表面活性表面活性劑、聚乙二醇劑、聚乙二醇PFG、L精氨酸、抗體、分子伴侶精氨酸、抗體、分子伴侶等。等。 n由于蛋白質(zhì)的多樣性、結(jié)構(gòu)和折疊過(guò)程的復(fù)雜性，使得人們不能對(duì)一種復(fù)性方法進(jìn)行簡(jiǎn)單的移

19、植，也很難找到具有普適性而又低成本的高效復(fù)性方法。n實(shí)際操作過(guò)程中必須針對(duì)每種目標(biāo)蛋白的特點(diǎn)n對(duì)影響復(fù)性的各個(gè)因素逐一優(yōu)化n才能最終確定適用于該種蛋白質(zhì)的復(fù)性方法n一般說(shuō)來(lái)，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外一般說(shuō)來(lái)，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復(fù)性效率在復(fù)性效率在20%左右左右重組蛋白再折疊的方法 稀釋法 抗體協(xié)助的再折疊 分子伴侶介導(dǎo)的再折疊 反向微團(tuán) 利用雙水相體系進(jìn)行再折疊 色譜復(fù)性法反膠團(tuán) 通過(guò)想轉(zhuǎn)移技術(shù)將變性的蛋白分子轉(zhuǎn)移到反向微團(tuán)中，并選擇條通過(guò)想轉(zhuǎn)移技術(shù)將變性的蛋白分子轉(zhuǎn)移到反向微團(tuán)中，并選擇條 件使每個(gè)微團(tuán)中至少含有一個(gè)蛋白分子；件使每個(gè)微團(tuán)中至少含有一個(gè)蛋白分子； 通過(guò)與

20、不含變性劑的水相接觸若干次降低微團(tuán)中變性劑的濃度；通過(guò)與不含變性劑的水相接觸若干次降低微團(tuán)中變性劑的濃度； 向反向微團(tuán)中加入氧化還原劑使還原的蛋白的二硫鍵再氧化，恢向反向微團(tuán)中加入氧化還原劑使還原的蛋白的二硫鍵再氧化，恢 復(fù)天然的構(gòu)象與活性復(fù)天然的構(gòu)象與活性; ; 待蛋白復(fù)性后從反向微團(tuán)中提取蛋白到水相中待蛋白復(fù)性后從反向微團(tuán)中提取蛋白到水相中洗滌折疊好的蛋白質(zhì)包涵體溶解蛋白質(zhì)反向微團(tuán)反向微團(tuán)中反向微團(tuán)中變性蛋白的再折疊變性蛋白的再折疊 反向微團(tuán)使蛋白復(fù)性的主要步驟 色譜法復(fù)性色譜復(fù)性方法原理復(fù)性蛋白凝膠色譜凝膠色譜（SEC）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)Stokes半徑的半徑的差異和凝膠排阻作用差異和凝膠排阻

21、作用溶菌酶，牛碳酸酐酶，溶菌酶，牛碳酸酐酶，E.coli宿主整合因子，宿主整合因子，rhETS-1，RNase A，t-PA，Heterodimeric platelet- derived growth factor疏水色譜疏水色譜（ HIC ）蛋白質(zhì)與介質(zhì)的疏水蛋白質(zhì)與介質(zhì)的疏水性相互結(jié)合性相互結(jié)合rhIFN-，rhIFN-，重組人粒細(xì)胞集落刺激因子重組人粒細(xì)胞集落刺激因子rhGC-CSF離子交換色譜離子交換色譜（IEC）蛋白質(zhì)與介質(zhì)間存在蛋白質(zhì)與介質(zhì)間存在電荷作用力電荷作用力Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，重組白細(xì)胞分泌抑制因子重組白細(xì)胞

22、分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白，抗原疫苗蛋白親和色譜親和色譜（AFC）蛋白與配體的特異性蛋白與配體的特異性親和吸附親和吸附重組人朊病毒重組人朊病毒rhPrion，牛碳酸酐酶，牛碳酸酐酶，IgG多聚-Lys蛋白對(duì)肝素-瓊脂糖凝膠具有較強(qiáng)親和活性吸 附洗脫固相復(fù)性的流程柱上復(fù)性變性劑去除固相基質(zhì)：肝素-瓊脂糖凝膠離子交換用離子交換層析復(fù)性馬細(xì)胞色素C、卵清蛋白、 凝乳酶原疏水層析由于凝膠基質(zhì)微孔的體積排阻效應(yīng)和減少的擴(kuò)散效應(yīng)，部由于凝膠基質(zhì)微孔的體積排阻效應(yīng)和減少的擴(kuò)散效應(yīng)，部分折疊的蛋白質(zhì)之間的相互作用受到有效的阻擋分折疊的蛋白質(zhì)之間的相互作用受到有效的阻擋降低了發(fā)生聚集的可能性降低了發(fā)生

23、聚集的可能性可溶性的聚集物、復(fù)性的蛋白、變性劑和氧化還原劑依次可溶性的聚集物、復(fù)性的蛋白、變性劑和氧化還原劑依次流出流出Using GF 凝膠過(guò)濾n在對(duì)在對(duì)rHEWLrHEWL的復(fù)性研究中，的復(fù)性研究中，Sephacryl S-100Sephacryl S-100柱（用復(fù)性緩柱（用復(fù)性緩沖液平衡），上樣量為沖液平衡），上樣量為1 1ml(0.27mg/ml),ml(0.27mg/ml),流速流速0.30.3ml/minml/min最最后回收到后回收到3535的蛋白活性，終濃度為的蛋白活性，終濃度為0.0150.015mg/mlmg/ml。n對(duì)對(duì)rETS-1rETS-1的復(fù)性采用的復(fù)性采用Sup

24、erdex 75HR 10/30Superdex 75HR 10/30柱（柱（2020MmHEPESMmHEPES，3.3mM Na2EDTA3.3mM Na2EDTA和和0.10.1Tween,pH6.8Tween,pH6.8平衡），流速平衡），流速0.20.2ml/min,ml/min,在在2525下，最后復(fù)性率為下，最后復(fù)性率為7171。n對(duì)對(duì)Rnase ARnase A采用采用Sephacryl S-100Sephacryl S-100（mM Na3PO,200mM NaClmM Na3PO,200mM NaCl平衡），流速平衡），流速0.50.5ml/minml/min，44條件下復(fù)性，復(fù)性率條件下復(fù)性，復(fù)性率9090。對(duì)由兩個(gè)亞基構(gòu)成的對(duì)由兩個(gè)亞基構(gòu)成的IHFIHF采用上述條件復(fù)性，最后正確折疊采用上述條件復(fù)性，最后正確折疊核組裝成雙體蛋白分子的得率為核