醫(yī)院細胞遺傳室外周血淋巴細胞建株作業(yè)指導書

1、醫(yī)院細胞遺傳室外周血淋巴細胞建株作業(yè)指導書1目的規(guī)范外周血淋巴細胞建株操作過程，通過建立永生化大量增殖的類淋巴母細胞系，為保存家族性疾病家系成員特有的基因組資源及臨床研究奠定物質基礎。2方法EB病毒轉化3原理3.1 環(huán)抱霉素（CYA是一種能在G0-G1期之間選擇性地抑制T淋巴細胞RNA聚合酶II的免疫抑制劑，與EBV同時加入時可有效地阻止T淋巴細胞對EBV的應答反應，防止已轉化的B淋巴細胞受T淋巴細胞攻擊而退化。3.2 EB病毒一般感染B淋巴細胞，通過受體CD21進入宿主細胞后可自行環(huán)化以游離體的形式長期存在于宿主細胞體內，形成潛伏感染。EB病毒潛伏感染人外周血B淋巴細胞后可活化B淋巴細胞，促

2、進靜思期的B細胞轉化為永生化大量增殖的類淋巴母細胞系（LCL）。4實驗性能4.1 EBV轉化結果轉化培養(yǎng)1周后，倒置顯微鏡下觀察可見聚集的細胞團塊，細胞透明發(fā)亮，體積明顯增大，細胞外壁有不規(guī)則毛刺狀突起，即為淋巴母細胞樣B細胞；3周后，鏡下可見轉化細胞克隆明顯增多；1個月以后，細胞增殖旺盛，形成生長密集的大克隆，標志轉化成功。4.2 凍存細胞復蘇后生長情況分別于凍存10d、1個月、3個月后進行了復蘇，所有凍存后的細胞復蘇成功率都為100%,復蘇后3d即可傳代培養(yǎng)，鏡下觀察細胞形態(tài)正常，所有細胞株依然保持旺盛的增殖特性，表明成功獲得永生細胞株。4.3 細胞生物學特性4.3.1 染色體核型分析：采

3、用染色體核型分析技術比較轉化后永生細胞與來自同個體新鮮外周血淋巴細胞染色體的G帶，未發(fā)現有任何變異，表明轉化后的B淋巴細胞保留了正常的染色體核型，未發(fā)生畸變，即保留了原有細胞的遺傳特性。4.3.2 細胞表型分析：轉化后的細胞經熒光抗體CD3/CD19染色，用流式細胞儀分析，結果100%表達成熟B淋巴細胞CD1Q5樣本類型及受檢者準備在無菌條件下采集靜脈血3m1（肝素抗凝，空腹為宜），立即送至實驗室。6儀器及耗材離心機，CO2Jt養(yǎng)箱，離心管(15ml,50ml),10ml吸管，電動槍，大中小Tip頭及移液槍，25cm2培養(yǎng)瓶，0.22m針式過濾器，10ml注射器，凍存液，凍存管。7實驗試劑1)

4、環(huán)抱霉素：用無血清培養(yǎng)基RPMI-1640配制成200四/ml,分裝到小離心管中凍存于-20P,有效期2個月。2) EB病毒：B95-8細胞常規(guī)接種至25c高培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，放置5-7天不換液后方可凍存。將細胞與培養(yǎng)液一起放入一次性的15ml離心管中，直接置-70P冰箱保存。使用前將其取由反復凍融三次。3) RPMI-1640培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基：75mlRPMI-1640加25mlFBS,無菌試驗陰性后方可使用。4)淋巴細胞分離液。5)凍存液的配制：25%FBS1640/DMSO=9/1(V:V)需使用前新鮮配制。8操作步驟8.1 在離心管中將外周血用無血清RPMI-1640按1:1稀釋，另取一

5、離心管，加入適量淋巴細胞分離液，然后用吸管將血液輕輕懸浮于淋巴細胞分離液上，注意不要將兩者混和，比例是2:1。8.2 用水平離心機于20-25離心2500rpm,10分鐘8.3 用吸管吸取淋巴細胞層到6-8ml無血清的RPMI-1640中,并輕輕吹打淋巴細胞。8.4 洗脫：室溫，離心1500rpm,10分鐘。8.5 再洗脫：去掉上清，加6-8ml無血清的1640重復步驟(4)c8.6棄上清，加2ml的25%FBS勺完全培養(yǎng)基輕輕吹打細胞形成單個淋巴細胞懸液。8.7 接種于一個25cm2培養(yǎng)瓶中。8.8 再加入40川環(huán)抱霉素和1.5mlEBV。8.9 側放在375%CO培養(yǎng)箱中開放式培養(yǎng)。8.1

6、0 待三天后觀察，如果細胞形態(tài)較好，培養(yǎng)基顏色變成金黃色，則細胞增殖明顯，可加入0.5ml含25%FBS的1640于培養(yǎng)瓶中；如果細胞形態(tài)不好，瓶底可見一層紅細胞，鏡下可見成堆的死細胞碎片，則需要重新做分離，重新接種培養(yǎng)。8.11 以后每隔2-3天需觀察一次，細胞處理視情況而定(原則上建株前一段時間宜緩慢加培養(yǎng)基，并讓其液體保持偏酸性為佳)。8.12 待其培養(yǎng)基液體增加到10-15ml,可選擇半量換液，細胞密度較大時則需要傳代。8.13 等細胞長到50ml左右，一般以1X106管凍存，復蘇檢測登記入庫。9潛在變異來源9.1 建株用的外周血淋巴細胞放置不宜超過72小時，最好時間段為12-24小時，標本可保存于室溫。9.2 分離淋巴細胞時，分離液和外周血不能混和，否則分離不好。9.3 EBV必須效價好，放-709C保存不宜超過6個月。9.4 要注意細胞的密度，2ml全血分離得到的淋巴細胞加2ml培養(yǎng)基較宜。9.5 所有試劑用品必須分兩線使用，防止污染。9.6 建株前期細胞生長狀態(tài)的原則是耐酸不耐堿。9.7 建株前期不能以肉眼或培養(yǎng)液的pH值來判斷細胞生長狀態(tài)，需要于鏡下觀察，防止錯誤判斷。10環(huán)境和安全控制10.1 試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑，不可直接接觸皮膚、眼睛、黏膜，一旦接觸，