第二章薄層色譜分離技術(shù)

1、第一節(jié)第一節(jié) 薄層色譜概論薄層色譜概論 第二節(jié)第二節(jié) 制備薄層色譜制備薄層色譜 第三節(jié)第三節(jié) 離心薄層色譜離心薄層色譜第四節(jié)第四節(jié) 制備型加壓薄層色譜制備型加壓薄層色譜 l薄層色譜薄層色譜l(Thin-Layer Chromatography TLC)l是快速分離、定性和定量分析的一種非常重要的色譜技術(shù)。l它是將固定相涂布于玻璃，鋁鉑，塑料片等載板上形成一均一薄層。將被分離的物質(zhì)點(diǎn)加在薄層的一端，置展開(kāi)室中，選用適當(dāng)?shù)恼归_(kāi)劑，借毛細(xì)作用從薄層點(diǎn)樣的一端展開(kāi)到另一端，使性質(zhì)不同的物質(zhì)得以分離。l分離原理隨所用固定相不同而不同，可分為: l(l) 吸附薄層色譜 采用硅膠、氧化鋁等吸附劑鋪成薄層，利

2、用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附能力的差別達(dá)到分離的目的。l(2) 分配薄層色譜 由硅膠、聚酰胺和纖維素鋪成薄層，不同組分在指定的兩相中有不同的分配系數(shù)。l(3) 離子交換薄層色譜 由含有交換活性基團(tuán)的纖維素鋪成薄層。l(4) 分子排阻薄層色譜 也稱凝膠薄層。利用樣品中分子大小不同、受阻情況不同加以分離。 l(5) 親和薄層色譜 利用酶、受體、抗原抗體特異性識(shí)別作用。 l1. 比移值比移值: 一個(gè)化合物在薄層板上上升的高度與展開(kāi)劑上升的高度的比值稱為該化合物的比移值（比移值（Rf 值）。值）。是薄層色譜的基本定性參數(shù)。l l由于影響被分離物質(zhì)在薄層上移動(dòng)距離的因素較多，因此R f值的重現(xiàn)性較差，如果

3、將被分離物質(zhì)與一參比物點(diǎn)在 同一塊薄層上，用相同的色譜條件進(jìn)行分離。相對(duì)比移值就是被分離物質(zhì)(s)和參比物(i)的Rf值之比，或是被分離物質(zhì)(s)和參比物（i) 在薄層上移動(dòng)距離之比.l由于參比物的Rf值或移動(dòng)距離可大于或小于被分離物質(zhì)的Rf值或移動(dòng)距離，因此相對(duì)比移值可大于或小于 l，但其重復(fù)性及可比性均優(yōu)于R f值。相對(duì)比移植以下式表示：lTLC不僅適合于小量樣品的制備，也可用于較大量樣品的純化。如果將薄層加寬加厚，把樣品點(diǎn)成一條線，能分離幾百毫克樣品。尤其是對(duì)于Rf值相近的物質(zhì)的分離。lTLC除了用于分離外，更主要的是通過(guò)與已知結(jié)構(gòu)化合物相比較，來(lái)鑒定少量有機(jī)混合物的組成。此外, 經(jīng)常利

4、用 TLC尋找柱色譜的最佳分離條件。 常用的兩種制備型薄層色譜包括：l傳統(tǒng)的制備薄層法（PTLC），即流動(dòng)相借毛細(xì)作用流經(jīng)固定相。l借外力強(qiáng)制性的使流動(dòng)相流經(jīng)固定相，如離心薄層和加壓薄層。 l一、固定相及載體一、固定相及載體l二，粘合劑與添加劑二，粘合劑與添加劑l三、薄層板的制備三、薄層板的制備l四，上樣四，上樣l五、展開(kāi)劑選擇五、展開(kāi)劑選擇l六、薄層展開(kāi)六、薄層展開(kāi)l七、檢測(cè)方法七、檢測(cè)方法l八、被分離物質(zhì)的收集八、被分離物質(zhì)的收集l九、九、PTLC分離化合物的純化分離化合物的純化l 經(jīng)典的制備型薄層色譜，設(shè)備簡(jiǎn)單，經(jīng)典的制備型薄層色譜，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便。操作方便。薄層色譜與常壓柱分離配薄

5、層色譜與常壓柱分離配合使用合使用，仍然在實(shí)驗(yàn)室中有較多的應(yīng)，仍然在實(shí)驗(yàn)室中有較多的應(yīng)用。尤其是在一些沒(méi)有現(xiàn)代分離手段用。尤其是在一些沒(méi)有現(xiàn)代分離手段的實(shí)驗(yàn)室中廣為使用。的實(shí)驗(yàn)室中廣為使用。 l一、固定相及載體一、固定相及載體l1固定相：固定相：薄層色譜必須將被分離物質(zhì)點(diǎn)于固定相上進(jìn)行分離，固定相要根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)來(lái)選擇。l分離親脂性化合物常常選用硅膠，氧化鋁，乙酰纖維素及聚酰胺。l分離親水性化合物常常選用纖維素，硅藻土及聚酰胺。 但也有例外，脂溶性葉綠素在氧化鋁及纖維素上均能得到較好的分離。l2載體：玻璃板，鋁箔，塑料片等（吸附薄層）； 纖維素，硅藻土（分配薄層）l（1）硅膠）硅膠：是最

6、常用的薄層固定相，90以上分離工作都應(yīng)用之。l） 普通型硅膠普通型硅膠：無(wú)定型多孔粉末，表面帶有硅醇基，呈弱酸性。因?yàn)橛幸涣u基(silanol Si-OH)，呈弱酸性（PH = 4.5）,通過(guò)硅原子上的羥基與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵， 所以表現(xiàn)為吸附性能。硅膠吸附水分形成水合硅醇基，降低吸附能力。通常在150活化后失水提高活度，此時(shí)約有46個(gè)硅醇基/nm2,。（溫度大于500，硅膠脫水形成硅醚（SiO-Si）,而失去吸附能力）。l 活性硅膠適合分離酸性或中性化合物，如酚類，醛類，生物堿類，甾體及氨基酸類，是基于吸附作用；l 非活性硅膠含有一定量的水分，在分離色素等時(shí)，是基于分配作用。

7、l ） 改性硅膠改性硅膠：借化學(xué)反應(yīng)，將有機(jī)分子鍵合在硅羥基上，故稱化學(xué)鍵合固定相?？煞譃闃O性鍵合相和非極性鍵合相。l 極性鍵合硅膠：含極性基團(tuán)（如氰基，氨基，二醇基），與普通硅膠相比活性低。一般作正相色譜，用非極性或極性溶劑為展開(kāi)劑l 非極性鍵合硅膠：鍵合相表面為極性極小的烴基如18烷基，乙基，辛基等。最常用的是18烷基鍵合硅膠。用極性較大溶劑為展開(kāi)劑或無(wú)機(jī)溶劑為展開(kāi)劑。因?yàn)镽f與正相色譜相反，故稱反相薄層色譜法。 l3)硅膠的粒度與孔徑硅膠的粒度與孔徑： l硅膠的分離效率與其粒度、孔徑及表面積等幾何結(jié)構(gòu)有關(guān)。l原則上，粒度越小，分離效果越好。l孔徑（）或孔體積表示硅膠粒子孔的大小的尺度，與

8、傳遞阻滯有關(guān)；l表面積越大，表明其吸附力越大，有較強(qiáng)的保留。 l4）硅膠薄層板的厚度）硅膠薄層板的厚度l 普通薄層厚度為250m, l 高效薄層板為200m，l 制備薄層板厚度0.5-2mml5）市售硅膠及預(yù)制板規(guī)格）市售硅膠及預(yù)制板規(guī)格（符號(hào)及含義）（符號(hào)及含義）l 硅膠G: 是含有13煅石膏（gypsum）黏合劑的硅膠l 硅膠H：不含黏合劑的硅膠l 硅膠HF254：不含黏合劑，含有一種無(wú)機(jī)熒光劑（如錳激活的硅酸鋅），在254nm波長(zhǎng)紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光l 硅膠GF254：含有煅石膏黏合劑，含熒光劑，在254nm波長(zhǎng)紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光l硅膠HF254+366：不含粘合劑，在254與

9、366nm波長(zhǎng)有熒光l硅膠PF254：制備型的，在254nm有熒光（有熒光劑，適用于不發(fā)光不易顯色物質(zhì)的制備與分離） l2氧化鋁氧化鋁：在薄層中其應(yīng)用僅次于硅膠。由氫氧化鋁400500煅燒而成。廣泛的用于萜類，生物堿，脂肪類，芳香類化合物的分離。因制法和處理方法不同可分為堿性，酸性，中性三類l 堿性氧化鋁：PH 910適于中性、堿性化合物的分離l 酸性氧化鋁：PH 45適于酸性化合物的分離l 中性氧化鋁：PH 77.5適于酸性或?qū)A不穩(wěn)定的化合物的分離l 氧化鋁因其含水量活性可分為五級(jí)。制備型薄層用氧化鋁選用23級(jí)市售氧化鋁市售氧化鋁：含10G ，PH 7.58；不帶粘合劑的氧化鋁 PH=9,

10、也可加入波長(zhǎng)254nm的熒光指示劑。 l3纖維素纖維素 l 與紙層析相似，按分配的原理 。纖維素分子是由大量纖維二糖通過(guò)糖苷鍵連接的，由于有許多的OH基，所以具有親水性。一分子水與與纖維素的兩個(gè)羥基結(jié)合，形成“纖維素H2O”絡(luò)合物。這種固定相可以視為一種多糖濃溶液，即使使用與水相混溶的溶劑時(shí)，仍然形成類似不相混溶的兩相。l 層析用纖維素分：l 普通纖維素l 乙?；w維素l 離子交換纖維素l4聚酰胺聚酰胺：l 聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物，薄層色譜中常用的是聚己內(nèi)酰胺。聚酰胺分子內(nèi)有許多酰胺基，酰胺基中的碳基與酚類、黃酮類、酸類中的羥基或羧基形成氫鍵；酰胺基中的氨基與酮類或硝基化合物形成

11、氫鍵，同時(shí)由于所分離混合物結(jié)構(gòu)不同，含羥基等活性基團(tuán)的數(shù)目和位置不同，因而形成氫鍵的能力不同，所以對(duì)這些化合物的吸附能力不同而得到分離。l 5葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 分子篩的原理 l (1)親水性葡聚糖凝膠l葡聚糖凝膠是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖苷，dextran)懸浮于有機(jī)相中，加入交聯(lián)劑使葡聚糖交聯(lián)聚合而成其商品名為Sephadex，加入交聯(lián)劑量不同可制成不同交聯(lián)度的凝膠 l交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水時(shí)膨脹體積越小 l用于薄層色譜的凝膠粒度要細(xì)，小于40um,交聯(lián)度要低，G50以下 l(2)親酯性萄聚糖凝膠l 萄聚糖凝膠只能用于水溶性物質(zhì)的分離鑒定。但在葡聚糖分子上引入有機(jī)基團(tuán)，則可

12、使之成為親脂性葡聚糖凝膠，如在G25凝膠上引入羥丙基基團(tuán)，與糖分子以醚鍵相連，使之成為既有親水性又有親脂性的LH20葡聚糖凝膠，適用于有機(jī)物如黃酮、蒽醌、色素等成分的分離。 l6.離子交換劑離子交換劑 l 葡聚糖凝膠離子交換劑l 在 G25或G50葡聚糖凝膠上引入羧甲基、磺乙基、磺丙基、二乙基氨乙基及季銨乙基等而制成的既具凝膠的優(yōu)點(diǎn)又具離子交換性質(zhì)的載體，在生化及天然化合物方面得到廣泛應(yīng)用。l7硅藻土硅藻土l 硅藻土商品名 celite，是高度多孔的，比表面積大的固體，本身具極弱的吸附力，常作為分配色譜用的載體；或以一定比例加入硅膠等吸附劑中可以降低硅膠的吸附力，而有利于某些化合物的分離。l

13、為使薄層牢固地附著于支持體上需加合適的粘合劑;l為特殊的分離檢出有時(shí)要在固定相中加入某些添加劑. 理想的粘合劑要求親水性好、粘結(jié)力強(qiáng)，且具有化學(xué)惰性 l1，煅石膏，煅石膏 l 將石膏（CaSO4.2H2O） 在120140 烤24小時(shí)，過(guò)200目篩，備用。用煅石膏作粘合劑的優(yōu)點(diǎn)是能使用腐蝕性的顯色劑；但其缺點(diǎn)為薄層的硬度不夠，且不利于無(wú)機(jī)物的分離。l2，羧甲基纖維素鈉，羧甲基纖維素鈉 CMC-Na l 先將羧甲基纖維素鈉調(diào)成糊狀，再加足量水?dāng)嚢杈鶆颍⒓訜嶂蠓惺贡M可能溶解，放置澄清后，取上清液代替水與吸附劑攪勻涂布薄層。l 常用的濃度為0.2-10，濃度越高, 薄層硬度越大，是常用的粘合劑，但

14、其缺點(diǎn)為不能耐受有腐蝕性的顯色劑。 l3，淀粉，淀粉 l將淀粉配成將淀粉配成5%的溶液的溶液,在在85加熱至有粘加熱至有粘性性,加入適量吸附劑制成薄層加入適量吸附劑制成薄層. 缺點(diǎn)為不能耐受有腐蝕性的顯色劑。l4，預(yù)制板粘合劑，預(yù)制板粘合劑l 上述三種粘合劑均于實(shí)驗(yàn)室自制TLC時(shí)使用l 商品市售預(yù)制板粘合劑有：聚乙烯醇，聚丙烯醇，聚丙烯酰胺。l 5. 添加劑添加劑 熒光劑; 酸、堿或PH緩沖液等。l三、薄層板的制備三、薄層板的制備l 當(dāng)前國(guó)外商品化的各種預(yù)制板均有市售，可滿足各種需要。（除個(gè)別特殊需要人工制板外）l 預(yù)制板使用方便,涂布均勻,薄層光滑及有很好的牢度.預(yù)制板有玻璃板、塑料板或鋁箔

15、板，后兩種還有剪裁方便之優(yōu)點(diǎn)。l 國(guó)外市售預(yù)制板較多，包括普通薄層預(yù)制板（硅膠、氧化鋁、纖維素、硅藻土、聚酰胺、離子交換纖維素、鍵合硅膠反相板）；高效薄層預(yù)制板（、鍵合硅膠預(yù)制板、手性預(yù)制板）等，規(guī)格眾多，尺寸不同，分離效果及重現(xiàn)性均較手工制板好。l 國(guó)內(nèi)預(yù)制板規(guī)格類型較少，進(jìn)口又貴，所以主要靠自己手工制作。l1，載板的制備，載板的制備：l常用載板主要為玻璃板，塑料板，金屬鋁箔等較少應(yīng)用 l載板必須是表面光滑，平整清潔 玻板大小視實(shí)驗(yàn)所需而定。一般分析用： 35cm； 420cm； 1010cm,制備用 ：2020cm， 2040cml2，薄板涂鋪方法，薄板涂鋪方法l（1）干法鋪板）干法鋪板

16、l 將吸附劑直接倒在板上一端，取一適當(dāng)玻棒兩端包裹上適當(dāng)厚度的橡皮膏或塑料管，視薄層厚度要求而定。l用力移動(dòng)玻璃管，（用力不可過(guò)猛或太快，也不能中途停止，以免薄層厚薄不均）如此制成的薄板稱為軟板。l由于該板易吹散，現(xiàn)已比較少用，多用硬板。l（2）濕法鋪板）濕法鋪板：l一般都要加黏合劑，故稱粘合薄層板（硬板）。常用兩種硬板為：硅膠+G、硅膠+CMC-Nal硅膠G板鋪制。G的含量為1013，制板時(shí)每份硅膠G+水23份，研成糊狀，倒在板上鋪布。l硅膠CMC-Na板鋪制: 硅膠H或硅膠G + CMC-Na水溶液（0.5）（1：3），研成糊狀，倒入板上鋪布。l0.5CMC-Na配制：l 取適量CMC-N

17、a + 蒸餾水加熱煮沸，完全融解，放冷靜置。鋪板時(shí)取其上清液使用。 l 鋪板時(shí)為了防止由于攪拌而帶入氣泡，常常加入少量乙醇或丙酮或?qū)⑽絼┖紫戎糜谡婵崭稍锲髦袦p壓脫氣，以免薄層表面出現(xiàn)氣泡，影響分離效果。l 其他一些加黏合劑鋪層的處理方法見(jiàn)有關(guān)參考書(shū)。l 傾注法：取適量調(diào)好的吸附劑糊，倒在干凈的薄板上用玻棒涂成一均勻薄層，再稍加震動(dòng)，使薄層平整均勻。置水平臺(tái)上晾干，嚴(yán)防灰塵沾污。再置烘箱中110活化一小時(shí)，置干燥器中備用。l本法均勻度較差，一致性差，適于小板的制備.l 平鋪法：在水平的較大玻璃上放上要鋪的薄板。薄板兩邊加上做好的框邊，倒上吸附劑糊，用一玻璃板或玻棒向一個(gè)方向均勻的將吸附劑刮平

18、，然后輕輕震動(dòng)均勻，置于平臺(tái)上晾干，活化備用。l適于大板的制備。l（3）機(jī)械涂鋪法：手動(dòng)涂布器，自動(dòng)涂布器。由于手動(dòng)推進(jìn)速度不同，使厚度不均勻。鋪板機(jī)國(guó)產(chǎn)進(jìn)口皆有，可調(diào)節(jié)制成厚度不同的薄層，供分析與制備用。刮板厚度分別為： l0.3, 0.4, 0.5 和 0.6mm (固定相干燥縮水后的相應(yīng)的薄層厚度為: 0.15, 0.2, 0.25 和 0.3mm) 一般用于分析的薄層厚度為0.250.5mm,用于制備的薄層厚度為0.52mm。l注意：l 吸附劑在手工調(diào)制時(shí)，研磨的方向順一個(gè)方向，否則凝固不均勻。l 涂布速度要快，避免固定相過(guò)度凝固，使涂布困難l 涂布時(shí)速度保持一致l 涂布后的薄層應(yīng)水平

19、放置，室溫晾干備用，避免因通風(fēng)導(dǎo)致產(chǎn)生裂紋，避免灰塵沾污。l 活化時(shí)一般硅膠板105110,0.5-1小時(shí)。有些薄層板不必活化，晾干即可用，如聚酰胺板。l上樣是制備薄層分離的最關(guān)鍵步驟之一。l1. 溶解溶解：上樣前，先將樣品溶于少量溶劑中，低揮發(fā)性的溶劑可引起點(diǎn)樣帶擴(kuò)散變寬。因此最好選擇揮發(fā)性溶劑（二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，醇），l避免用水，DMF,DMSO等不易揮發(fā)易擴(kuò)散的溶劑。l樣品濃度應(yīng)在510左右，定性0.011范圍。濃度過(guò)高易造成超載，出現(xiàn)拖尾或重疊，影響分辨率和分離度。 l2. 方法方法： 手工點(diǎn)樣：毛細(xì)管（分析），滴管或注射器。l定性點(diǎn)樣： 一般點(diǎn)狀點(diǎn)樣，要求圓而小、點(diǎn)樣時(shí),點(diǎn)樣

20、斑點(diǎn)直徑最大不得超過(guò)5mm，一般以23mm較為合適；高效板斑點(diǎn)直徑約為12mm. 若需重復(fù)點(diǎn)樣,應(yīng)待上次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后,在重復(fù)點(diǎn)樣。以防點(diǎn)樣點(diǎn)過(guò)大,造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象。影響分離效果。l制備點(diǎn)樣：一般帶狀（線狀）點(diǎn)樣，要求窄又細(xì),以獲得較好的分離效果。點(diǎn)樣后必須將溶劑吹干再進(jìn)行展開(kāi)，但要避免高溫加熱，使成分分解。l對(duì)于制備薄層，若點(diǎn)樣帶較寬，可先用較大極性溶劑，將薄層板展開(kāi)到點(diǎn)樣帶上端2cm處，以起到濃集作用。然后將薄板干燥后，再用展開(kāi)劑展開(kāi) l 自動(dòng)點(diǎn)樣儀：l 點(diǎn)樣不觸及薄層，用氮?dú)獯蹈伞?l3. 位置位置: 經(jīng)典薄層起始線距底邊約1-1.5cm,高效板1 cm，展距前者為1015 cm，

21、后者為57 cm；點(diǎn)間距經(jīng)典薄層12 cm，高效板0.5 cm,l4. 上樣量上樣量: l1.0mm厚的硅膠板或氧化鋁板最多可上樣5mg/cm,對(duì)2020cm板可最高分離10100mg樣品。l如果吸附劑的厚度加倍，可多上樣。切勿超載，出現(xiàn)拖尾或重疊，影響分辨率和分離度。lPTLC所用展開(kāi)劑的條件由分析型TLC預(yù)試來(lái)確定。由于兩者所用吸附劑的顆粒大小相同，所以分析型TLC展開(kāi)劑可直接用于PTLC.l薄層色譜條件是依據(jù)被分離組分的性質(zhì)（溶解度，酸堿性，極性）吸附劑（活性）以及展開(kāi)劑極性三個(gè)因素決定的。l在上述三個(gè)因素中，被分離物質(zhì)是固定的，吸附劑常用的種類也不多，而展開(kāi)劑種類則是千變?nèi)f化。不僅可以

22、應(yīng)用不同極性的單一溶劑作為展開(kāi)劑，更多的是應(yīng)用不同極性的混合溶劑。所以對(duì)于特定物質(zhì)的分離，展開(kāi)劑對(duì)分離起決定作用。 l1. 溶劑強(qiáng)度溶劑強(qiáng)度：是指單一溶劑或混和溶劑洗脫某種溶質(zhì)的能力.在正相色譜中，它隨極性增大而增大。l極性小的溶劑，對(duì)極性小的組分溶解強(qiáng)，在TLC中能較快的向前遷移，與極性大的組分分離。極性小組分的Rf比極性大組分的大。l極性大的溶劑，對(duì)極性大的組分溶解強(qiáng)，較快向前遷移，而與極性小的組分分離。極性大組分的Rf比極性小組分的大。 l常見(jiàn)溶劑極性順序常見(jiàn)溶劑極性順序l石油醚（petro） 環(huán)己烷 (Cyclohex) 正己烷 (Hex) 二硫化碳（CS2） 四氯化碳(CCl4)三氯

23、乙烷(CH3CCl3) 苯（Ph） 甲苯（Toluene） 二氯甲烷(CH2Cl2) 氯仿(CHCl3) 乙醚 (Et2O) 乙酸乙酯 (EtOAc) 丙酮(Acetone) 正丙醇 乙醇 (EtOH) 甲醇(MeOH) 吡啶(Py) 羧酸(R-COOH) 水l 在實(shí)際操作中，一般按極性順序選單一溶劑展開(kāi)，看其Rf及分離效果，另加入第二種、第三種溶劑來(lái)調(diào)節(jié)之。l Rf最佳范圍為0.20.5，可使用范圍為0.20.8。l對(duì)極性化合物，如果Rf太小，可加極性較大溶劑；如果太大，可加非極性溶劑。l當(dāng)樣品中含有碳基時(shí)，在非極性溶劑中加入少量丙酮；當(dāng)樣品中含有羥基時(shí)，于非極性溶劑中加入少量甲醇、乙醇等；

24、當(dāng)含有羧基酸性樣品時(shí)，可加入少量的甲酸、乙酸；當(dāng)含有氨基的堿性樣品時(shí)，可加入少量六氫吡啶、二乙胺、氨水等，可改善拖尾的出現(xiàn)，提高堿性或酸性化合物的分離效果?？傊?，加入的溶劑應(yīng)與被測(cè)物的官能團(tuán)相似。l 下列是幾種常用的兩相溶劑系統(tǒng)（不同比例）l正己烷：乙酸乙酯 環(huán)己烷：乙酸乙酯l正己烷：丙酮 石油醚：乙酸乙酯l氯仿：甲醇 丙酮：甲醇l石油醚：苯（甲苯） l正己烷：苯（甲苯） l聚酰胺薄層溶劑洗脫順序聚酰胺薄層溶劑洗脫順序 ：l聚酰胺薄層單一溶劑洗脫能力的順序聚酰胺薄層單一溶劑洗脫能力的順序:l在聚酰胺薄層上的分離是由于氫鍵的形成能力，這決定于化合物本身及展開(kāi)劑的極性，在水中形成氫鍵的能力最強(qiáng)，在

25、有機(jī)溶劑中形成氫鍵能力較弱，在堿性溶液中形成氫鍵能力最弱，因此在聚酸胺薄層上單一溶劑洗脫能力的順序是：l水乙醇甲醇丙酮稀氫氧化銨（鈉）溶液甲酸胺二甲基甲酸胺 l常用的多元展開(kāi)劑有常用的多元展開(kāi)劑有：l水一乙醇（50:50）、水一甲醇（50:50）、l水一丁酮一甲醇（40:30:20）、l水一乙醇一丁酮一乙酰丙酮(15:15:15:5）、l水一乙醇一乙酸一二甲基甲酰胺（30:20:10:5）、l苯一甲醇一丁酮（60:20:20）等l2.選擇展開(kāi)劑的方法選擇展開(kāi)劑的方法 l 三角形法三角形法 l 點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法 l Camag Vario-Ks展開(kāi)室法展開(kāi)室法 l 三角形法三角形法。按照展開(kāi)

26、劑，固定相及被分離物質(zhì)三者間相互影響,設(shè)計(jì)了三因素綜合幫助選擇展開(kāi)劑的極性和固定相的活度。l圖（a）適于吸附薄層;圖(b) 適于分配薄層. l 點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法 l本法非常簡(jiǎn)單,也很實(shí)用.將要被分離的化合物溶液間隔的點(diǎn)于薄層板上,待溶劑揮發(fā)干后,用不同的展開(kāi)劑通過(guò)毛細(xì)管點(diǎn)到各樣品點(diǎn)上,借毛細(xì)管作用,展開(kāi)劑從圓心向外擴(kuò)展,這樣就出現(xiàn)了不同圓心的色譜,經(jīng)過(guò)比較就可以發(fā)現(xiàn)最合適的展開(kāi)劑及吸附劑.l下圖是證明苯是最合適的展開(kāi)劑.l Camag Vario-Ks展開(kāi)室法展開(kāi)室法 lCamag Vario-Ks展開(kāi)室至少有5個(gè)溶劑室,可以在同一薄層板上同時(shí)篩選至少5種展開(kāi)劑.l用此裝置可以很快找到最合

27、適的展開(kāi)劑及最佳展開(kāi)條件。 l薄層展開(kāi)要在密閉的器皿中進(jìn)行，如廣口瓶或其它帶有蓋子的玻璃瓶都可作為展開(kāi)器。l加入展開(kāi)劑的高度為0.5-1.0cm。l1.預(yù)飽和預(yù)飽和：l可在展開(kāi)器中放一張濾紙，以使器皿內(nèi)的蒸氣很快地達(dá)到氣液平衡，待濾紙被展開(kāi)劑飽和以后，把點(diǎn)有樣點(diǎn)的板(樣點(diǎn)一端向下)放入展開(kāi)器內(nèi)。l也可使用薄層雙槽展開(kāi)室，加入展開(kāi)劑于其中一槽，把點(diǎn)有樣品的板放入無(wú)展開(kāi)劑的另一槽內(nèi)。l若使用平底展開(kāi)室，可將展開(kāi)室一端墊高，將薄板置于展開(kāi)室墊高一端， 蓋好蓋子，使薄板飽和之。時(shí)間自行掌握，半小時(shí)左右。 l2.展開(kāi)展開(kāi)：視薄層形狀而定l硬板常用上行展開(kāi)，環(huán)形展開(kāi)，雙向張開(kāi)，下行展開(kāi)，多次展開(kāi)l軟板常用

28、近水平展開(kāi)l采用多次展開(kāi)的方法可以提高TLC的分離效果。l在一次展開(kāi)結(jié)束后，先將薄板干燥，再放入容器中展開(kāi)。l多次展開(kāi)可分為單向多次展開(kāi)（同一種展開(kāi)劑，以增加展開(kāi)距離）與梯度展開(kāi)（不同種展開(kāi)劑，以增加分離度）。 l上行展開(kāi)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較多l(xiāng)展開(kāi)時(shí)薄層板并與器皿成一定的角度，同時(shí)使展開(kāi)劑的水平線應(yīng)在樣點(diǎn)以下，蓋上蓋子。l當(dāng)展開(kāi)劑上升到離板的頂部約 lcm處時(shí)取出，并立即用鉛筆標(biāo)出展開(kāi)劑的前沿位置，待展開(kāi)劑干燥后，觀察斑點(diǎn)的位置。 l1光學(xué)檢測(cè)光學(xué)檢測(cè)l2.蒸汽檢出蒸汽檢出 l3.顯色法顯色法l4加入?yún)⒄瘴锓尤雲(yún)⒄瘴锓?l1光學(xué)檢測(cè)光學(xué)檢測(cè) l可見(jiàn)光：一些化合物如染料，蒽醌等對(duì)可見(jiàn)光有吸收，因此

29、在自然光下呈現(xiàn)不同顏色的斑點(diǎn)。lUV法：多數(shù)化合物在可見(jiàn)光下不能顯色，但可吸收 UV光，在紫外燈下顯示出不同顏色的斑點(diǎn)。l熒光法：些化合物吸收 UV光后，激發(fā)出熒光，在色譜上呈現(xiàn)不同顏色的熒光斑點(diǎn)。l熒光萃滅法：無(wú)UV可見(jiàn)光和熒光者，可將樣品點(diǎn)于含有無(wú)機(jī)熒光劑的薄層板上，展開(kāi)后揮去溶劑，置UV燈下觀察，被分離的化合物在有色的熒光的背景下，呈現(xiàn)暗的斑點(diǎn)。l如GF254與HF254板在黃綠熒光背景下出現(xiàn)黑斑。這是由于這些化合物減弱了吸附劑中熒光物質(zhì)的UV吸收，引起了熒光萃滅。l也可以將熒光素噴于無(wú)熒光劑的薄層板上，獲得與熒光板相同的效果。 l2. 蒸汽檢出蒸汽檢出。利用一些物質(zhì)的蒸氣與樣品作用，產(chǎn)

30、生不同顏色或產(chǎn)生熒光。lI2熏色是實(shí)驗(yàn)室常用方法，展開(kāi)后的薄層板揮去溶劑，放在盛有I2結(jié)晶的密閉容器中，大多數(shù)化合物吸附I2蒸氣后，呈現(xiàn)不同程度的黃褐色色斑。標(biāo)出斑點(diǎn)位置，借此檢出所分離的化合物位置。l當(dāng)薄層離開(kāi)I2蒸氣后，黃褐色色斑逐漸消退。這是可逆反應(yīng)，不影響產(chǎn)物性質(zhì)。l若不退色，為不可逆反應(yīng)，只可用于定性，對(duì)化合物制備不可取。 l3.顯色法顯色法：若化合物對(duì)UV可見(jiàn)和熒光均不能顯示斑點(diǎn)，可加入顯色劑顯色。常用噴撒法、浸漬法，展層顯色法等。顯色法主要用于定性分析定位，制備型較少應(yīng)用。l顯色劑分兩大類：一類為檢查一般有機(jī)化合物的通用試劑；另一類為根據(jù)化合物或特殊官能團(tuán)設(shè)計(jì)的專屬性顯色劑。種類

31、繁多。l實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常備用兩種顯色劑l高錳酸鉀溶液（高錳酸鉀9克+氫氧化鈉0.75克+碳酸氫鈉60克+水900毫升）l氧化性試劑l茴香醛溶液（674毫升乙醇+18.5毫升茴香醛+25毫升濃硫酸）l還原性試劑 l4加入?yún)⒄瘴锓尤雲(yún)⒄瘴锓╨對(duì)于PTLC法，若對(duì)UV可見(jiàn)和熒光均不能顯示斑點(diǎn)，因不能碘薰色、不能加顯色劑等，可利用參照物的Rf值，確定被分離化合物的位置。 l 化合物的檢出除用于鑒定、分離外，可用于監(jiān)測(cè)有機(jī)反應(yīng)進(jìn)行的的情況，以尋找化學(xué)反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間和達(dá)到最高反應(yīng)的收率。l八、被分離物質(zhì)的收集八、被分離物質(zhì)的收集l在確定色帶位置后，可用刮刀或用與真空收集器相連的管狀刮離器，將色帶吸附劑從板

32、上刮下。l后一種方法對(duì)易氧化的物質(zhì)持續(xù)與空氣接觸，慎用。 l將回收的吸附劑以極性較低的溶劑，使化合物從中提取出來(lái)（1克吸附劑約用5毫升溶劑）.l注意:化合物與吸附劑接觸時(shí)間越長(zhǎng)，被破壞可能性也越大?？上扔?型沙芯漏斗過(guò)濾洗脫液，然后用濾模（0.2-0.45um）過(guò)濾。l甲醇可溶解硅膠及其中一些物質(zhì)，所以不適用于作展開(kāi)劑及從硅膠上洗脫被分離的化合物。常用溶劑：丙酮，乙醇，氯仿等.l lPTLC過(guò)程中，因吸附劑中含有黏合劑及熒光指示劑，在溶劑提取過(guò)程中，吸附劑中雜質(zhì)易被提取，洗脫液極性越大，提取的可能雜質(zhì)越多。這些雜質(zhì)往往無(wú)UV吸收，TLC檢測(cè)難以發(fā)現(xiàn)其存在。因此溶液蒸去后，往往要經(jīng)重結(jié)晶處理或相

33、應(yīng)的手段進(jìn)行再純化，方可通過(guò)含量測(cè)定及光譜分析要求。 l離心液相薄層是制備薄層的一種改進(jìn)。因?yàn)榻?jīng)典的制備型PTLC存在著許多缺陷，如展開(kāi)過(guò)程太長(zhǎng)；需要將被分開(kāi)的化合物從薄層上刮下，提取出來(lái)。提取過(guò)程易引入吸附劑雜質(zhì)及殘留物等。為克服這些缺點(diǎn)，人們發(fā)明了離心薄層色譜。 l一、離心薄層色譜的技術(shù)原理一、離心薄層色譜的技術(shù)原理l二、旋轉(zhuǎn)薄層色譜儀二、旋轉(zhuǎn)薄層色譜儀l三、應(yīng)用實(shí)例三、應(yīng)用實(shí)例l 是一種強(qiáng)制性流動(dòng)相移動(dòng)方法。主要是在經(jīng)典的PTLC基礎(chǔ)上，即樣品在固定相和流動(dòng)相間的吸附，分配作用的不同，再加上離心力的作用，使流動(dòng)相加速流動(dòng)，使樣品各組分之間原有的Rf差異加大，從而提高了分離效果，加快了分離

34、速度。 由于CLC儀器簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，而廣泛用于合成和天然產(chǎn)物的制備分離。l二、旋轉(zhuǎn)薄層色譜儀二、旋轉(zhuǎn)薄層色譜儀l目前旋轉(zhuǎn)薄層色譜儀有2種類型：l一種是美國(guó)Harrison的7924型Chromatotron儀及我國(guó)北京青云儀器廠生產(chǎn)的LBC1型離心薄層色譜儀；l另一種是日本日立公司生產(chǎn)的CLC型離心薄層色譜儀。 l旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)為傾斜的，核心部分是一直徑為24厘米，鋪有吸附劑的玻璃圓盤(pán) 。l1. 旋轉(zhuǎn)薄層的制備l常用硅膠為吸附劑。為防止薄層開(kāi)裂常加石膏G或羧甲纖維素鈉為粘合劑。l例如：在多數(shù)情況下，利用硅膠制備2毫米厚的薄層。將薄層色譜硅膠60F254 60克+石膏CaSO4.2

35、H2O 8克加水110毫升，劇烈振搖30秒。將混合物傾倒在載體玻璃板上，使之旋轉(zhuǎn)向四周擴(kuò)散，最后形成一均勻薄層。在板四周可加一防護(hù)帶，防止吸附劑流出板邊緣。l室溫干燥過(guò)夜后，置烘箱6070烘1小時(shí)。冷后，用一固定于中心的刮離器，可將吸附劑表面刮平，在中央留一空白處，用以倒入洗脫劑。l2. 層析過(guò)程l將制備板（厚度1，2，4毫米）用螺絲固定在電動(dòng)機(jī)軸心上，以800r/min速度轉(zhuǎn)動(dòng)。輸出量110毫升/分輸液泵。將洗脫液加至吸附劑中央空白處。通過(guò)離心力作用，使洗脫液流經(jīng)薄層板。先用洗脫液沖洗薄層板，以除去吸附劑中雜質(zhì)，隨后有兩種操作方式l直接加入樣品l干燥后再加入樣品，然后開(kāi)始洗脫，流速36毫升/

36、分。l圓形色譜板上展開(kāi)的圓形色譜帶可借UV燈檢出，覆蓋的石英玻璃不防礙UV穿過(guò)。l有時(shí)可持續(xù)通氮?dú)馊肷V室中，以防洗脫液凝結(jié)和樣品被氧化。l加入樣品后，隨洗脫液的洗脫，可得到各組分濃縮的同心圓狀色譜，通過(guò)肉眼可直接觀測(cè)到。見(jiàn)圖l在色譜板邊緣，色帶快速脫離色譜板，流出管外，從而能選擇性收集之。 l3.色譜條件選擇l用硅膠作吸附劑，洗脫劑選擇：一般要求將分析薄層色譜條件的Rf調(diào)至0.5以下，否則將相同洗脫溶劑用于離心薄層時(shí)，洗脫速度太快。l實(shí)驗(yàn)證明一個(gè)2mm厚的薄層，可分離50500mg的混合物?？蓱?yīng)用梯度洗脫法，提高產(chǎn)品洗脫分離速率。 l(二二)、日立、日立Hitachi CLC-5離心色譜儀離心色譜儀l使用之前使用之前 ，先將吸附劑與洗脫劑混合物加到兩，先將吸附劑與洗脫劑混合物加到兩塊直徑為塊直徑為30厘米的水平薄板之間，像厘米的水平薄板之間，像Sandwich一樣。一樣。l離心使過(guò)量溶