第四章植物基因工程基本技術(shù)-核酸分離

1、第四章第四章 植物基因工程基本植物基因工程基本技術(shù)技術(shù)-核酸提取及分離核酸提取及分離第四章第四章 植物基因工程基本植物基因工程基本技術(shù)技術(shù)-核酸提取及分離核酸提取及分離第一節(jié)第一節(jié) 核酸提取技術(shù)核酸提取技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 核酸電泳技術(shù)核酸電泳技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 核酸提取技術(shù)核酸提取技術(shù)Part OneTechniques of Nucleic Acid Isolation第一部分：第一部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對策原因分析及其對策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡介提取方法簡介第四部分：第四部分：RNA提取及其提

2、取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對策問題、原因分析及其對策核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學實驗技術(shù)中最重要、此核酸的提取是分子生物學實驗技術(shù)中最重要、最基本的操作最基本的操作 。第一部分：第一部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對策原因分析及其對策第三部分：第三部分：RNA提取方法簡介提取方法簡介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析

3、及其對策問題、原因分析及其對策第一部分：第一部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介第一部分：第一部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介Break down the cell wall and membranesCentrifuge to separate the solids from the dissolved DNAPrecipitate the DNA using isopropanolCentrifuge to separate the DNA from the dissolved salts and sugarsWash the DNA pellet with Ethanol and d

4、ry the pelletDissolve DNAOverview of DNA ExtractionDNA提取提取的基的基本步本步驟驟q 基因組基因組DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它q 非基因組非基因組DNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取的提取 堿裂解法堿裂解法 煮沸法煮沸法線粒體、葉綠體線粒體、葉綠體DNA的提取的提取 差速離心結(jié)合差速離心結(jié)合SDS裂解法裂解法qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取經(jīng)典方法）提取經(jīng)典方法）CTAB（cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，

5、可溶解細胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機溶劑）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。出來。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15。qCTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方提取緩沖液的經(jīng)典

6、配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使提供一個高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧

7、化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除qCTAB提取緩沖液的改進配方提取緩沖液的改進配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能中酚的污染

8、；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。和多糖結(jié)合，有效去除多糖。Disruption of cell walls by grindingLysis of cells in extraction bufferStep 1+2: mechanical disruption and homogenization in extraction bufferExtraction/Precipitation MethodGrind sample into a fine powder to shear cell walls and membranesMix thoroughly with extraction

9、 buffer to dissolve cell membranes and inhibit nuclease activityA homogenizer allows cells to be mechanically disrupted within the extraction bufferCrude lysate十六烷基三十六烷基三甲基溴化銨甲基溴化銨qCTAB法流程圖法流程圖植物材料植物材料裂解液裂解液上層溶液上層溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提細胞裂解細胞裂解干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q CTAB法實例法實例1、1.5ml離心管中加入離心管中加入0.3

10、ml提取液置提取液置65預(yù)熱。預(yù)熱。2、取材料、取材料0.03g，用液氮研磨（加入，用液氮研磨（加入0.003gPVP及少許石英沙）迅速研磨成粉及少許石英沙）迅速研磨成粉。 3、將凍粉迅速轉(zhuǎn)入提取液中，盡快用移液槍混勻，在溫度、將凍粉迅速轉(zhuǎn)入提取液中，盡快用移液槍混勻，在溫度65水浴水浴30min，期，期間輕輕搖動幾次（防止間輕輕搖動幾次（防止DNA斷裂）。斷裂）。4、取出離心管，冷至室溫，每管加等體積氯仿、取出離心管，冷至室溫，每管加等體積氯仿/異戊醇（異戊醇（24：1），輕輕混勻，），輕輕混勻，顛倒混勻靜止顛倒混勻靜止10min，10000rpm離心離心10min。5、吸取上清夜于另一離心

11、管中，加入、吸取上清夜于另一離心管中，加入1/10體積的體積的3%CTAB，混勻；再加入等，混勻；再加入等體積的氯仿體積的氯仿/異戊醇（異戊醇（24：1），輕緩顛倒混勻，室溫放置），輕緩顛倒混勻，室溫放置15min，然后，然后10000rpm離心離心10min去上清。去上清。6、分別用、分別用70%、80%酒精洗滌沉淀。在風扇下將沉淀吹干。酒精洗滌沉淀。在風扇下將沉淀吹干。q CTAB法實例法實例7、加、加30lTE緩沖液回溶緩沖液回溶DNA沉淀（不要反復(fù)吸打，用手指輕彈），同時加入沉淀（不要反復(fù)吸打，用手指輕彈），同時加入終濃度終濃度50l/mg RNase，置，置37處理處理1h。8、加入

12、等體積的氯仿、加入等體積的氯仿/異戊醇異戊醇 （24：1）抽提）抽提1-3次。次。9、吸取上清，加入終濃度為、吸取上清，加入終濃度為0.2-0.4mol/l的的NaCL，2倍體積的無水乙醇，放置倍體積的無水乙醇，放置1h左右，左右，10、12000rpm 離心離心 10min 除去上清夜。除去上清夜。11、用、用70%乙醇洗滌沉淀乙醇洗滌沉淀2-3次，自然干燥后，溶于次，自然干燥后，溶于30l去離子水中形成去離子水中形成DNA提取液。提取液。12、以、以DNA提取液提取液/去離子水去離子水 1/100的比例加入石英杯中在蛋白質(zhì)核酸分析儀的比例加入石英杯中在蛋白質(zhì)核酸分析儀中進行測定。中進行測定

13、。q SDS法原理法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能裂解細）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽提高鹽(KAc或或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。沟鞍踪|(zhì)及多糖濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份組份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS終濃度終濃度 10 mM

14、20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取緩沖液提取緩沖液q SDS SDS法流程圖法流程圖組織組織細胞裂解細胞裂解上層溶液上層溶液組織勻漿組織勻漿抽提抽提干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q SDS SDS法實例法實例1、取、取0.03g新鮮材料，置液氮中研磨成粉。新鮮材料，置液氮中研磨成粉。2、將凍粉轉(zhuǎn)移置、將凍粉轉(zhuǎn)移置65預(yù)熱的預(yù)熱的450l DNA提取液中，輕輕晃動，使凍粉充分散提取液中，輕輕晃動，使凍粉充分散開。開。3、加入、加入30l 10%SDS充分混勻，置充分混勻，置65水浴中保溫水浴中保溫10-15 min （間隔晃動（間隔晃動2-3次）次

15、）4、加入、加入48l KAC充分混勻，冰浴中放置充分混勻，冰浴中放置30 min 。5、4 12000rpm 離心離心15 min。6、上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積氯仿、上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇（異戊醇（24：1），輕扣，倒離），輕扣，倒離心管數(shù)次，放置片刻，于心管數(shù)次，放置片刻，于48000rpm離心離心10min。7、按、按6-7重復(fù)重復(fù)1-2次。次。8、將上清轉(zhuǎn)移另一離心管，加入、將上清轉(zhuǎn)移另一離心管，加入2倍體積冷無水乙醇。輕緩搖勻，置倍體積冷無水乙醇。輕緩搖勻，置-20沉沉淀淀0.5-1h。4 10000rpm離心離心10min。9、倒掉上清，用、倒掉上清，

16、用70%乙醇洗滌沉淀乙醇洗滌沉淀2-3次，吹干后，用次，吹干后，用30l去去TE緩沖液溶解緩沖液溶解沉淀。沉淀。 10、DNA溶液加入溶液加入RNase 1l，于，于37保溫保溫0.5-1h。11、用等體積的氯仿、用等體積的氯仿/異戊醇（異戊醇（24：1）抽提）抽提1-3次次12、70%乙醇洗滌沉淀乙醇洗滌沉淀2-3次，自然干燥后，溶于次，自然干燥后，溶于30l 去離子水形成去離子水形成DNA提取提取液。液。13、以、以DNA提取液提取液/去離子水去離子水 1/100的比例加入石英杯中在蛋白質(zhì)核酸分析儀的比例加入石英杯中在蛋白質(zhì)核酸分析儀中進行測定。中進行測定。 一步法一步法:1、0.03mg

17、材料，加材料，加200l 0.5mol/l NAOH研磨后，取研磨后，取60l研磨液，加研磨液，加300l 100mol/l Tris-HCL（PH 7.6）緩沖液中）緩沖液中8000rpm離心離心5min，取上清即為，取上清即為DNA提取液。提取液。2以以DNA提取液提取液/去離子水去離子水 1/100的比例加入石英杯中在蛋白質(zhì)核酸分析儀中的比例加入石英杯中在蛋白質(zhì)核酸分析儀中進行測定。進行測定。 物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法超聲波法、研磨法、凍融法 化學方式化學方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法：異硫氰酸胍法、堿裂解法 生物方式生物方式：酶法：酶法q根據(jù)細胞裂

18、解方式的不同有：根據(jù)細胞裂解方式的不同有：吸附材料結(jié)合法：吸附材料結(jié)合法：q根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂磁珠磁珠高鹽低高鹽低pHpH值結(jié)合核酸，低鹽高值結(jié)合核酸，低鹽高pHpH值洗脫。值洗脫。快捷高效?？旖莞咝?。低鹽高低鹽高pHpH值結(jié)合核酸，高鹽低值結(jié)合核酸，高鹽低pHpH值洗脫。值洗脫。適用于純度要求高的實驗。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。物，從而達到分離目的。濃鹽法濃鹽法：有機溶劑抽提法：有機溶劑抽提法：密度梯度離心法：密度梯

19、度離心法：利用利用RNA和和DNA在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物q堿裂解法原理堿裂解法原理 染色體染色體DNADNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNADNA分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體DNADNA為為線狀分線狀分子，而質(zhì)粒子，而質(zhì)粒DNADNA為共價閉合環(huán)狀分子；為共價閉合環(huán)狀分子； 當用堿處理當用堿處理DNADNA溶液時，線狀染色體溶液時，線狀染色體DNADNA容易發(fā)生變性，共容易發(fā)生

20、變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒價閉環(huán)的質(zhì)粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；時即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNADNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNADNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。中，從而可通過離心將兩者分開。l q堿裂解法流程圖堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體對數(shù)期菌體溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重懸充分重懸溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶

21、液溶液配制：溶液配制：溶液溶液1 1GETGET緩沖液：緩沖液： 50mmol/L50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.025mMTris-HCl pH8.0。溶液溶液2 20.2mol/L NaOH, 1%SDS0.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液溶液3 3乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)(3M, pH=4.8)： 60mL60mL的的5mol/L KAc,5mol/L KAc, 11.5ml 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H28.5mL H2 2O OTETE緩沖液或水（

22、緩沖液或水（+ 20+ 20 g/ml RNase g/ml RNase ）: : 10mmol/L 10mmol/L，Tris-HCl,Tris-HCl, 1mmol/L 1mmol/L，EDTA EDTA ， pH8.0, pH8.0, 100%100%乙醇，乙醇，7070乙醇乙醇注意：注意： 用移液器操作時，每一步都要格外小用移液器操作時，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液心，特別是在加入溶液II II 和和IIIIII后，后，一定不要劇烈振蕩，以免切碎一定不要劇烈振蕩，以免切碎DNA(DNA(包包括質(zhì)粒括質(zhì)粒DNADNA和基因組和基因組DNA)DNA)！1.1. 培養(yǎng)細菌：將帶有質(zhì)粒

23、的大腸桿菌接種到培養(yǎng)細菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml1.5-3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，3737培養(yǎng)培養(yǎng)12121616小時小時; ;2.2. 取液體培養(yǎng)液取液體培養(yǎng)液1.5-3ml1.5-3ml于于EppendorfEppendorf管中，管中，10000r/min10000r/min離心離心1min1min，去掉上清液，加入，去掉上清液，加入100100 l l溶液溶液1(GET) 1(GET) ，充分混勻放置，充分混勻放置3-53-5分鐘分鐘; ;3.3. 加入加入200200 l l新配制的新配制的0.2mol/L NaOH+10.2mo

24、l/L NaOH+1SDSSDS（變性液），加蓋顛倒（變性液），加蓋顛倒6-76-7次使之混勻，冰次使之混勻，冰上放置上放置5min;5min;質(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。嘿|(zhì)粒小量提取的方法（手工提取）：4.4. 加入加入150 150 l l乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液( (溶液溶液II)II)，加蓋后顛，加蓋后顛倒倒6-76-7次混勻，冰上放置次混勻，冰上放置5min;5min;5.5. 用臺式高速離心機，用臺式高速離心機，10000r/min10000r/min離心離心7min7min，上，上清移入另一干凈離心管，并加清移入另一干凈離心管，并加1ml 1001ml 100乙醇乙醇混勻，混勻，

25、12000r/min12000r/min離心離心5min5min，棄去上清液，棄去上清液; ;6.6. 沉淀用沉淀用0.5ml 700.5ml 70乙醇清洗一次，乙醇清洗一次， 12000r/min12000r/min離心離心5min5min，棄去上清液，小管倒置，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥; ;7.7. 加入加入30-5030-50 l l含有含有2020 g/ml RNaseg/ml RNase的滅菌蒸餾水的滅菌蒸餾水或或TE TE 緩沖液溶解提取物，室溫放置緩沖液溶解提取物，室溫放置15-30min15-30min，使，使DN

26、ADNA充分溶解充分溶解( (有時需要酚有時需要酚: :氯仿抽提氯仿抽提););8.8. 將分離出的質(zhì)粒將分離出的質(zhì)粒DNADNA置于置于-20-20保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩Ｓ梅止夤舛扔嫹ǘ坑梅止夤舛扔嫹ǘ緿NA Nucleic Acid Analysis via UV Spectrophotometryestimate the concentration of DNA and RNA. Nucleic acids have an absorption peak at 260nm.dsDNA A260 x (50 g/mL)ssDNA A260 x (33 g/mL)ssRNA A260 x

27、(40 g/mL)DNA Absorption SpectraNanoDrop ND-2000可根據(jù)在可根據(jù)在260nm260nm以及在以及在280nm280nm的讀數(shù)的比值的讀數(shù)的比值（ODOD260260/OD/OD280280）估計核酸的純度。一般）估計核酸的純度。一般DNADNA的純的純品，其比值為品，其比值為1.81.8，低于此值說明有蛋白質(zhì)或，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染其它雜質(zhì)的污染。6、記錄記錄ODOD值，通過計算確定值，通過計算確定DNADNA濃度濃度或純度，公式如下或純度，公式如下: : dsDNA=50 dsDNA=50(OD(OD260260) ) 稀釋倍數(shù)稀釋

28、倍數(shù)以上濃度單位為以上濃度單位為 g g /ml /ml 凝膠電泳檢測凝膠電泳檢測DNADNA的濃度的濃度0.8%0.8%的瓊脂糖凝膠，的瓊脂糖凝膠，100V,40100V,40分鐘。分鐘。NEB NEB 標準分子量片段標準分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)1 kbp and 100 bp laddersGenomic DNA of 5 species of cerealsExpected Results in a Research LabExpected Results in a Classroom Lab lThis is expected. Eve

29、n though this genomic DNA preparation is not perfect, it is suitable for use as a PCR templatelLane A: BarleyLane B: CornlLane C: OatlLane D: RicelLane E: WheatA B C D ELadderq煮沸法原理煮沸法原理 染色體染色體DNADNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNADNA分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體DNADNA為為線狀分線狀分子，而質(zhì)粒子，而質(zhì)粒DNADNA為共價閉合環(huán)狀分子；為共價閉合環(huán)狀分子； 當加熱處理當加熱處理DNADNA溶液

30、時，線狀染色體溶液時，線狀染色體DNADNA容易發(fā)生變性，共容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒價閉環(huán)的質(zhì)粒DNADNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNADNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNADNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。中，從而可通過離心將兩者分開。q差速離心法原理差速離心法原理 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速

31、進將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細胞器，自身可編碼蛋線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細胞器，自身可編碼蛋白，它們的白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細胞內(nèi)各也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細胞內(nèi)各種組分分級分離出來。種組分分級分離出來。 質(zhì)粒量質(zhì)粒量（ngng）緩沖液緩沖液(l)(l)* *Ec

32、oREcoR1 1（ll）XhoXho1 1（ll）H H2 2O O(l)(l)總體積總體積（ll）I I2002002 20 00 017-1917-192020IIII2002002 20.50.50 015-1715-172020IIIIII2002002 20.50.50.50.514-1614-162020* * 緩沖液隨不同的酶而不同緩沖液隨不同的酶而不同, ,本實驗用本實驗用 H bufferH buffer。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小時。酶解完成后，分小時。酶解完成后，分別加入別加入1010 l l 3 3倍的上樣緩沖液倍的上樣緩沖液, , 然后各

33、取然后各取1515 l l進進行電泳分析。行電泳分析。1) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的酶解的酶解Relaxed circleSuper-coiled form第一部分：第一部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對策原因分析及其對策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡介提取方法簡介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對策問題、原因分析及其對策第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對策原因分析及其對策I.I.材料準備材料準備II.II.破碎細胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎

34、細胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中最好使用新鮮材料，低溫保最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組提取血液基因組DNA時，要時，要選擇有核細胞（白細胞）選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成否則會造成DNA降解降解含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量較含量較少，提取前先富集少，提取前先富集基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNA

35、DNA的提取的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致導(dǎo)致DNA量少，純度低量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧厌槍Σ煌牧?，選擇適當?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：解預(yù)處理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨動物

36、組織勻漿或液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細胞蛋白酶組培細胞蛋白酶K細菌溶菌酶破壁細菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取菌體量適當菌體量適當培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（變性的時間不要過長（5分鐘），分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時間也不宜過長，否則會復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組有基因組DNA的污染的污染G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機械

37、法處理，以破壁用酶法或機械法處理，以破壁采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法去雜質(zhì)的方法基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取q 蛋白質(zhì)的去除：蛋白質(zhì)的去除： 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用變性劑變性（使用變性劑變性（SDSSD

38、S、異硫氰酸胍等）、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌高鹽洗滌 蛋白酶處理蛋白酶處理q 多糖的去除：多糖的去除： 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/21/2體體積的積的5M NaCl5M NaCl，高鹽可溶解多糖。，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2(1/2體積體積) )，氯苯可，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L D

39、NA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。q 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合q 鹽離子的去除：鹽離子的

40、去除： 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌當沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉當沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分淀會更充分沉淀時加入沉淀時加入1/10體積的體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于），有利于充分沉淀充分沉淀沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解緩沖液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNasepH值為值為8.0，可防止，可防止DNA發(fā)生酸解發(fā)生酸

41、解 基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)糖、多酚類雜質(zhì)2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)后續(xù)酶解反應(yīng)3.3.DNADNA中殘留有金屬離中殘留有金屬離子子1.1.重新純化重新純化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等雜白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）質(zhì)（具體方法見前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓酒精，讓酒精充分揮發(fā)充分揮發(fā)3.3.增加增加7070乙醇洗滌的乙醇洗滌的次數(shù)（次數(shù)（2-32-3次）次）q問題一：問題一：DNADN

42、A樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。 原原因因?qū)Σ卟?.1.材料不新鮮或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍融融2.2.未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈，烈，DNADNA被機械打斷被機械打斷4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反復(fù)凍融反復(fù)凍融1.1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融免反復(fù)凍融2.2.液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液前加入裂解緩沖液3.3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料

43、的的DNADNA時，可增加裂解液中螯合劑時，可增加裂解液中螯合劑的含量的含量4.4.細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔5.5.所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌溫滅菌6.6.將將DNADNA分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融q問題二：問題二：DNADNA降解。降解。對對策策 原原因因1.1.實驗材料不佳或量少實驗材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗滌時洗滌時DNADNA丟失丟失1.1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）的材料料2.2.動植物要

44、勻漿研磨充分；動植物要勻漿研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁或機械方式破壁3.3.高溫裂解時，時間適當延長高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增（對于動物細胞、細菌可增加加PKPK的用量）的用量）4.4.低溫沉淀，延長沉淀時間低溫沉淀，延長沉淀時間5.5.加輔助物，促進沉淀加輔助物，促進沉淀6.6.洗滌時，最好用槍頭將洗滌洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒液吸出，勿傾倒q問題三：問題三：DNADNA提取量少。提取量少。對對策策 原原因因第一部分：第一部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題

45、、原因分析及其對策原因分析及其對策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡介提取方法簡介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對策問題、原因分析及其對策第三部分：第三部分：RNA提取方法簡介提取方法簡介第三部分：第三部分：RNA提取方法簡介提取方法簡介q異硫氰酸胍異硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 原理：原理：細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；性，核酸釋放；釋放出來的釋放出來的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而分別位

46、于整個體下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；在酸性至中性條件下，系中的中間相和水相，從而得以分離；在酸性至中性條件下，DNADNA和蛋和蛋白質(zhì)一起變性通過離心去除，白質(zhì)一起變性通過離心去除，RNARNA仍留在上清液中，最后用異丙醇沉淀。仍留在上清液中，最后用異丙醇沉淀。有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNARNA。 q異硫氰酸胍異硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 步驟步驟: :材料準備：材料準備：盡量新鮮。盡量新鮮。裂解變性裂解變性：異硫氰酸胍異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-N-月桂肌氨酸等）。月桂肌氨酸等）。 使細胞及核蛋

47、白復(fù)合物變性，釋放使細胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNARNA，有效抑制核酸酶。，有效抑制核酸酶。純化分離：純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/ /氯仿可抽提去除雜物。氯仿可抽提去除雜物。洗滌：洗滌：7070乙醇。乙醇。沉淀：沉淀：異丙醇、無水乙醇。異丙醇、無水乙醇。 乙酸鈉（乙酸鈉（pH4.0pH4.0）：維持變性的細胞裂解液的）：維持變性的細胞裂解液的pHpH值，沉淀值，沉淀RNARNA。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNARNA。RNA提取實例提取實例-大豆總大豆總RNA的提取的提取 1) 配制提取液配制提取液 異硫氰酸胍異硫氰酸胍(4mol/l

48、) 4ml 苯酚苯酚 3ml 醋酸鈉醋酸鈉(2mol/l PH4.8) 0.3ml 氯仿氯仿 0.6ml PVP 0.04g2) 將研缽放在將研缽放在-80冰箱中預(yù)冷，取冰箱中預(yù)冷，取1.2g花生豆授粉后花生豆授粉后30天的未成熟種子放天的未成熟種子放入研缽中，加入液氮，迅速將花生豆研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至提取液中入研缽中，加入液氮，迅速將花生豆研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至提取液中，混勻，冰浴，混勻，冰浴30min。3) 4，8000rpm,離心離心13min。4) 取上清，加入等體積的苯酚取上清，加入等體積的苯酚:氯仿氯仿:異戊醇（異戊醇（25:24:1），），4，12000rpm,離心離心5min.5

49、) 取上清，加入取上清，加入0.5體積的體積的3mol/l KAc(PH4.8),混勻，冰浴混勻，冰浴30min, 4，13000rpm,離心離心15min. 6) 取上清，加入取上清，加入2倍體積無水乙醇，倍體積無水乙醇，-20放置放置1h, 4，8000rpm,離心離心13min。7) 棄上清，在沉淀中加入棄上清，在沉淀中加入1ml 4mol/LLicl,使溶解，移入使溶解，移入1.5mlEppendorf管管中，冰浴中，冰浴2h, 4，13000rpm, 離心離心15min.8) 棄上清，在沉淀中加入棄上清，在沉淀中加入400uldH2O（經(jīng)（經(jīng)DEPC處理），再加入處理），再加入400

50、ul氯仿氯仿，混勻，混勻，4，13000rpm, 離心離心6min.9) 取上清，加入取上清，加入0.1體積的體積的3mol/l NaAc(PH5.0),2倍體積無水乙醇，倍體積無水乙醇，-20放放置，置，30min，4，13000rpm,離心離心13min.10) 棄上清，將沉淀棄上清，將沉淀RNA用用70%乙醇洗滌乙醇洗滌2次，室溫下干燥（次，室溫下干燥（70%乙醇用乙醇用DEPC處理水配制）處理水配制）11) 加入加入100ul dH2O（經(jīng)（經(jīng)DEPC處理）溶解，處理）溶解，-20保存。保存。提取提取RNA電泳分析電泳分析q 材料材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料新鮮，切忌使用反復(fù)凍融

51、的材料如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔?？梢韵葘⒉牧先缛舨牧蟻碓蠢щy，且實驗需要一定的時間間隔。可以先將材料貯存在貯存在TRIzolTRIzol或樣品貯存液中，于或樣品貯存液中，于7070或或2020保存保存如要多次提取，請分成多份保存如要多次提取，請分成多份保存液氮長期保存，液氮長期保存，7070短期保存短期保存q 樣品破碎及裂解樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細胞：培養(yǎng)細胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀馔ǔ？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图毦航湍负图毦阂话阋话鉚RIzolTRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先可直接裂解，對于一些特

52、殊的材料可先用酶或者機械方法破壁用酶或者機械方法破壁動植物組織：動植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍速，樣品保持冷凍樣品量適當，保證充分裂解樣品量適當，保證充分裂解為減少為減少DNADNA污染，可適當加大裂解液的用量污染，可適當加大裂解液的用量q 純化：純化：在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；經(jīng)典的純化方法，如經(jīng)典的純化方法，如 LiCl LiCl 沉淀等，雖然經(jīng)濟，但操作時間長，沉淀等，雖然經(jīng)濟，但操作時間長，易造成易造成 RNA RNA 降解；降

53、解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA RNA 后續(xù)酶反后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。第一部分：第一部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對策原因分析及其對策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡介提取方法簡介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對策問題、原因分析及其對策第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見常見 問題、原因分析及其對策問題、原因分析及其對策

54、q RNA RNA 的降解的降解 q ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 電泳帶型異常電泳帶型異常q 下游實驗效果不佳下游實驗效果不佳q 新鮮細胞或組織：新鮮細胞或組織： 裂解液的質(zhì)量裂解液的質(zhì)量 外源外源RNaseRNase的污染的污染 裂解液的用量不足裂解液的用量不足 組織裂解不充分組織裂解不充分 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 ( (如脾臟，胸腺等如脾臟，胸腺等) )，很，很難避免難避免 RNA RNA 的降解。的降解。 建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液多裂解液。q 冷凍樣

55、品：冷凍樣品： 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70-70冰箱保存。樣品要相對小一點；冰箱保存。樣品要相對小一點； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時補充液氮。預(yù)冷，碾磨過程中及時補充液氮。ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 蛋白質(zhì)污染：蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時

56、間要足夠。層的離心力和時間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法解決辦法: :重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚殘留：苯酚殘留：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。層的離心力和時間要足夠。解決辦法解決辦法: :重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 抽提試劑殘留：抽提試劑殘留：確保洗滌時要徹底懸浮確保洗滌時要徹底懸浮 RNARNA，并且徹底

57、去掉，并且徹底去掉 75% 75% 乙醇。乙醇。解決辦法解決辦法: :再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 設(shè)備限制：設(shè)備限制：測定測定OD260 OD260 及及OD280 OD280 數(shù)值時，要使數(shù)值時，要使OD260 OD260 讀數(shù)在讀數(shù)在 0.10 - 0.50 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。之間。此范圍線性最好。q 用水稀釋樣品：用水稀釋樣品：測測 OD OD 時，對照及樣品稀釋液請使用時，對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris10 mM Tris，pH 7.5pH 7.5。用。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。 q 非變性電

58、泳：非變性電泳： 上樣量超過上樣量超過 3ug，電壓超過，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致均可能導(dǎo)致 28S 和和 18S 條帶分不開。條帶分不開。q 變性電泳條帶變淡：變性電泳條帶變淡： EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；變性電泳比非變性電泳要淡一些； 甲醛的質(zhì)量不高甲醛的質(zhì)量不高 。q RNA RNA 降解降解 q 抽提試劑的殘留抽提試劑的殘留 75% 75% 乙醇洗滌乙醇洗滌 q 樣品中雜質(zhì)的殘留樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 q DNA DN

59、A 污染污染 使用使用RNase-Free RNase-Free 的的 DNase I DNase I 消化抽提消化抽提RNA RNA RTRT常見問題分析和解決方案常見問題分析和解決方案問題一：問題一：少量或沒有少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物產(chǎn)物RNARNA降解降解分離無污染，高質(zhì)量的分離無污染，高質(zhì)量的RNARNA；防止；防止RNARNA降解降解RNARNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑7070（v/vv/v）乙醇清洗）乙醇清洗RNARNA沉淀，除去抑制劑沉淀，除去抑制劑起始起始RNARNA量太低量太低增加增加RNARNA的量的量 多糖同多糖同RNARNA共沉淀共沉淀用氯化鋰沉淀用氯化鋰

60、沉淀RNARNA以除去多糖以除去多糖合成合成cDNAcDNA第一鏈合成的引物第一鏈合成的引物退火失敗退火失敗確定退火溫度適合所用的引物確定退火溫度適合所用的引物RNARNA模板存在較多二級結(jié)構(gòu)模板存在較多二級結(jié)構(gòu)將將RNARNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/ /退火，退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度反轉(zhuǎn)錄成功，反轉(zhuǎn)錄成功，PCRPCR失敗失敗PCRPCR步驟中使用超過步驟中使用超過1/51/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物可能原因可能原因解決方案解決方案RTRT常見問題分析和解決方案常見問題分析和解決方案問題二：問題二：有非特異性帶有非特異性帶q