GSTpulldown實(shí)驗(yàn)技術(shù)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1GSTpulldown實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。第1頁(yè)/共22頁(yè)第二頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。第2頁(yè)/共22頁(yè)第三頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。第3頁(yè)/共22頁(yè)第四頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。第4頁(yè)/共22頁(yè)第五頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。p用于驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白的相互作用p篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白第5頁(yè)/共22頁(yè)第六頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。l GST-A融合蛋白的制備 B蛋白的制備 體外蛋白的結(jié)合 Western blot檢測(cè)第6頁(yè)/共22頁(yè)第七頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。1. GST-A融合蛋白

2、的制備第7頁(yè)/共22頁(yè)第八頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。1、活化凍存菌種GST和GST-A：按1: 50比例將表達(dá)蛋白的凍存菌液加入5ml LB(Amp)，37，200 rpm培養(yǎng)過(guò)夜；2、將過(guò)夜培養(yǎng)物按1:100比例接入200ml LB(Amp) ，220 rpm，30培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6;3、以預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳IPTG濃度、時(shí)間和溫度誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白（，20，200 rpm培養(yǎng)1016小時(shí)）;4、誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后，4，5000 rpm/min離心10min后棄上清（如需要該步沉淀能保存在-80）；第8頁(yè)/共22頁(yè)第九頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。5、重懸沉淀：按10ml

3、菌液沉淀用1ml PBS重懸，并加入PMSF；6、冰上超聲沉淀重懸液：5S 間隔5S 至懸液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重懸液超聲69min可透明）;7、12000 rpm/min，4離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，加DTT至終濃度1mmol/L。第9頁(yè)/共22頁(yè)第十頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。1、 在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積的50%Glutathione Sepharose 4B，4緩慢搖動(dòng)，反應(yīng)3060min；2、 3000 rpm/min，4離心3min，棄上清。該Sepharose上結(jié)合了GST-A融合蛋白。3、在管中加入預(yù)冷的200

4、微升PBS（沿壁加入，小心勿劇烈，以免打斷珠子與蛋白的連接），輕晃懸浮珠子，將Sepharose洗滌一次， 3000 rpm/min，4離心3min，棄上清;4、重復(fù)步驟3三次（最后一次以小槍頭吸凈珠子表面液體，吸凈但不吸走珠子），即獲得結(jié)合有GST-A融合蛋白的Sepharose；第10頁(yè)/共22頁(yè)第十一頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。5、如果用于檢測(cè)，在Sepharose 加入1520微升1蛋白電泳上樣緩沖液，于沸水中煮510min。6、12000 rpm/min離心5min，取上清做SDS-PAGE和WB檢測(cè)。第11頁(yè)/共22頁(yè)第十二頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。2. B蛋白的

5、制備第12頁(yè)/共22頁(yè)第十三頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。1、活化凍存菌種His和His-B：按1: 50比例將表達(dá)蛋白的凍存菌液加入5ml LB(Amp)，37，200 rpm培養(yǎng)過(guò)夜；2、將過(guò)夜培養(yǎng)物按1:100比例接入200ml LB(Amp) ，220rpm，30培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6;3、以預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳IPTG濃度、時(shí)間和溫度誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白（，28，200 rpm培養(yǎng)1016小時(shí)）;4、誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后，4，5000 rpm/min離心10min后棄上清（如需要該步沉淀能保存在-80）；第13頁(yè)/共22頁(yè)第十四頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。5、重懸沉淀：按10

6、ml菌液沉淀用1ml PBS重懸，并加入PMSF；6、冰上超聲沉淀重懸液：5S 間隔5S 至懸液透明（一般可溶性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重懸液超聲69min可透明）;7、12000 rpm/min，4離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，加DTT至終濃度1mmol/L。第14頁(yè)/共22頁(yè)第十五頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。1、 在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積的Ni-NTA珠子，4緩慢搖動(dòng)，反應(yīng)3060min；2、 3000 rpm/min，4離心5min，棄上清。該Ni-NTA珠子上結(jié)合了His-B融合蛋白。3、在管中加入預(yù)冷的200微升Wash Buffer（沿壁

7、加入，小心勿劇烈，以免打斷珠子與蛋白的連接），輕晃懸浮珠子，將珠子洗滌一次， 3000 rpm/min，4離心3min，棄上清;4、重復(fù)步驟3三次（最后一次以小槍頭吸凈珠子表面液體，吸凈但不吸走珠子），即獲得結(jié)合有His融合蛋白的Ni-NTA；第15頁(yè)/共22頁(yè)第十六頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。5、加入適量體積Elution Buffer，不必吹打，晃動(dòng)洗脫蛋白。 3000 rpm/min，4離心5min，吸凈上清，His-B融合蛋白即在上清中；6、如果用于檢測(cè)，取10微升樣品，加入10微升1蛋白電泳上樣緩沖液，于沸水中煮510min；7、12000 rpm/min離心5min，取上清

8、做SDS-PAGE和WB檢測(cè)。第16頁(yè)/共22頁(yè)第十七頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。1、將編碼B蛋白的ORF克隆到編碼標(biāo)簽蛋白（如HA/Myc/Flag）的真核表達(dá)載體上，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；2、轉(zhuǎn)染后3648h，取出細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗2遍;3、加入適量體積1RIPA（含PMSF），于冰上或4裂解細(xì)胞1030min;4、 12000 rpm/min，4離心5min，取上清保存在-80或進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。第17頁(yè)/共22頁(yè)第十八頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。3. 體外蛋白的結(jié)合1、 將結(jié)合有GST-A融合蛋白的Sepharose 4B懸浮在適量體積緩沖液中，加入2030微升含有B蛋白的溶液

9、（原核表達(dá)或真核表達(dá)產(chǎn)物），同時(shí)采用結(jié)合有GST蛋白的Sepharose 作為陰性對(duì)照；2、 在水平搖床上4晃動(dòng)48h；3、3000 rpm/min，4離心3min，棄上清（注意不要擾動(dòng)底層的Sepharose）；4、加入預(yù)冷的200微升緩沖液對(duì)Sepharose進(jìn)行洗滌（沿壁加入，不要直接沖擊Sepharose，隨后輕柔晃動(dòng)，使Sepharose重懸即可;第18頁(yè)/共22頁(yè)第十九頁(yè)，編輯于星期六：十二點(diǎn) 二十三分。3. 體外蛋白的結(jié)合5、3000 rpm/min，4離心3min，棄上清（注意不要擾動(dòng)底層的Sepharose）；6、重復(fù)步驟5三次;7、吸干Sepharose上面的液體后，加入2030微升1 蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴4min，凍存于-20備