上海交大網(wǎng)絡(luò)課程檢驗(yàn)微生物講義4

1、第十三章 彎曲菌屬和螺桿菌屬一、教學(xué)大綱要求（1）彎曲菌屬的主要特點(diǎn)及分類、臨床意義、細(xì)菌特性、實(shí)驗(yàn)室檢查。（2）螺桿菌屬的主要特性、分類。（3）幽門螺桿菌的臨床意義、細(xì)菌特性、實(shí)驗(yàn)室檢查。二、教材內(nèi)容精要（一）彎曲菌屬1彎曲菌屬的主要特點(diǎn)及分類彎曲菌屬(Campylobacter) 是一類呈逗點(diǎn)狀或S形的革蘭陰性桿菌，廣泛分布于動物界，其中有些可引起動物和人類的腹瀉、胃腸炎和腸道外感染。目前彎曲菌屬共有18個(gè)菌種和亞種，引起人類疾病的主要是空腸彎曲菌空腸亞種，其次是胎兒彎曲菌和大腸彎曲菌等。 2細(xì)菌特性（1）形態(tài)染色 本屬細(xì)菌為革蘭陰性無芽孢的彎曲短桿菌，不易染色，菌體彎曲呈S狀或海鷗展翅狀

2、等，一端或兩端各有一根鞭毛，運(yùn)動活潑，暗視野顯微鏡下呈“投標(biāo)樣”運(yùn)動。（2）培養(yǎng)特性 微需氧菌，最適生長環(huán)境是含氧氣5、二氧化碳10、氮?dú)?5；孵育溫度通常取決于所需要分離的菌株，在不同的溫度下培養(yǎng)基的選擇性也不同，通常絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室用42作為初始分離溫度，這一溫度對空腸彎曲菌、大腸彎曲菌的生長有利，相反其他菌株在37生長良好。營養(yǎng)要求高，在普通培養(yǎng)基上不生長，分離彎曲菌常用的選擇性培養(yǎng)基大多含有抗生素（主要為頭孢哌酮），以抑制腸道正常菌群。常用的有含血的Skirrow培養(yǎng)基、頭孢哌酮-萬古霉素-兩性霉素瓊脂培養(yǎng)基（CVA）和不含血的碳-頭孢哌酮-去氧膽酸鹽（CCDA）、碳基選擇性培養(yǎng)基（CS

3、M）和半固體動力培養(yǎng)基等。（3）生化反應(yīng) 氧化酶和觸酶陽性，可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，不分解和不發(fā)酵各種糖類，不分解尿素，具體生化反應(yīng)見表131。（4）抵抗力 本屬細(xì)菌的抵抗力弱，對一般消毒劑敏感，但耐寒，在4冰箱或水中可存活達(dá)4周。 表13-1 彎曲菌屬的生化特征生化試驗(yàn)空腸彎曲菌空腸亞種空腸彎曲菌多氏亞種大腸彎曲菌胎兒彎曲菌胎兒亞種胎兒彎曲菌性病亞種海鷗彎曲菌烏普薩拉彎曲菌豕腸炎彎曲菌唾液彎曲菌唾液生物型唾液彎曲菌牛生物型唾液彎曲菌糞生物型瑞士彎曲菌粘膜彎曲菌簡明彎曲菌屈曲彎曲菌糞彎曲菌昭和彎曲菌氧化酶+V+W+-+-+硝酸鹽還原+-+亞硝酸鹽還原-+ND+ND需H2-V-+脲酶-V-+H2

4、S-+-+馬尿酸鹽水解+V-醋酸吲哚酚水解+-+-+-+15生長-25生長-+-+-42生長+-+-+W+3.5%NaCl生長-+-V-1甘油+-+V+V+V麥康凱培養(yǎng)基+-+-+-+ND+NDNDND萘啶酸VSSVRRSRSRRSRRSSR頭孢噻吩RSRSSRSSSSSSSRNDNDS注：+，90陽性；-，10陽性；V，可變；ND，未定；W，反應(yīng)較弱；S，敏感；R，耐藥3臨床意義彎曲菌的傳播途徑主要為食物和水，傳播方式多為經(jīng)口傳播，食用未煮熟的雞、飲用未經(jīng)處理的水和未經(jīng)消毒的牛奶均可引起彎曲菌腸炎的發(fā)生。本菌具有黏附定居和入侵上皮細(xì)胞的能力，通過產(chǎn)生的腸毒素、細(xì)胞毒素和內(nèi)毒素等多種毒力因子致

5、病，病變部位通常在空腸、回腸，也可蔓延至結(jié)腸?？漳c彎曲菌空腸亞種是彎曲菌中最重要也是最常見的的人體致病菌（占彎曲菌腹瀉的8090），腹瀉是空腸彎曲菌感染最常見的臨床表現(xiàn)。除腸炎外，近年來也出現(xiàn)了空腸彎曲菌繼發(fā)關(guān)節(jié)炎敗血癥、腦膜炎和格林巴利綜合征。GBS病人分離到的空腸彎曲菌大都具有特殊的血清型O:19，可與人體的神經(jīng)組織發(fā)生交叉免疫反應(yīng)而致病。胎兒彎曲菌主要引起腸道外感染，其中胎兒亞種和貓、綿羊的感染性流產(chǎn)關(guān)系密切，較少引起人類感染，感染人體常引起全身癥狀。4微生物學(xué)檢驗(yàn)（1）檢驗(yàn)程序 見圖13-1。 糞便、肛拭、剩余食物 血液、腦脊液直接檢查 卡-布運(yùn)送培養(yǎng)基 布氏肉湯增菌分離培養(yǎng)動力檢查

6、直接鏡檢 （彎曲菌選擇性培養(yǎng)基） 7天后不生長棄去 微需氧環(huán)境 25、37、42 4872h 可疑菌落 （粉紅、光滑、半透明） 動力觀察 涂片、革蘭染色 （投標(biāo)樣運(yùn)動） 革蘭陰性、彎曲菌 氧化酶（+） 生化反應(yīng)鑒定 報(bào)告 圖13-1 彎曲菌屬的檢驗(yàn)程序（2）標(biāo)本采集 可采集糞便、肛拭子及剩余食物，標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢，或?qū)?biāo)本接種于卡-布運(yùn)送培養(yǎng)基中送檢；對于高燒和患腦膜炎的病人，可于用藥前抽取靜脈血或腦脊液，注入布氏肉湯中送檢。（3）檢驗(yàn)方法1）顯微鏡檢查 懸滴法動力檢查：顯微鏡下觀察有無螺旋狀或投標(biāo)樣運(yùn)動，腦脊液標(biāo)本經(jīng)離心沉淀后再制成懸滴標(biāo)本檢查；染色標(biāo)本檢查：取新鮮糞便或腦脊液離心沉淀物

7、涂片、革蘭染色，查找革蘭陰性、彎曲呈S狀或螺旋狀桿菌，鞭毛染色見一端或兩端單根鞭毛；2）分離培養(yǎng) 可將標(biāo)本直接接種于選擇性培養(yǎng)基上，也可將標(biāo)本過濾后培養(yǎng)，彎曲菌形成的菌落為灰色、扁平、表面濕潤、圓形凸起、邊緣不規(guī)則，常沿穿刺線蔓延生長的菌落，在血平板上不溶血。本屬細(xì)菌在布氏肉湯中呈均勻混濁生長。培養(yǎng)時(shí)需注意氣體環(huán)境和適合的溫度，空腸彎曲菌最適的溫度為4243，胎兒彎曲菌在42不生長。3）鑒定 彎曲菌屬的鑒定比較復(fù)雜，必須綜合多種試驗(yàn)才能確定。通常在彎曲菌選擇培養(yǎng)基上氧化酶陽性、革蘭染色陰性、彎曲呈S形或螺旋形的細(xì)菌初步鑒定為彎曲菌，進(jìn)一步的鑒定試驗(yàn)有：馬尿酸鹽水解試驗(yàn)：本試驗(yàn)是鑒別空腸彎曲菌空

8、腸亞種和多氏亞種的重要試驗(yàn)，在彎曲菌選擇性培養(yǎng)基上經(jīng)42孵育，氧化酶陽性、有特征性的彎曲菌形態(tài)、輔以馬尿酸鹽試驗(yàn)陽性即可報(bào)告為空腸彎曲菌空腸亞種；醋酸吲哚水解試驗(yàn)：本試驗(yàn)空腸彎曲菌為陽性而胎兒彎曲菌為陰性；萘啶酸、頭孢噻吩耐藥試驗(yàn)：空腸彎曲菌和大腸彎曲菌對萘啶酸敏感，對頭孢噻吩耐藥；胎兒彎曲菌對萘啶酸耐藥而對頭孢噻吩敏感。近來出現(xiàn)了對萘啶酸耐藥的空腸彎曲菌和大腸彎曲菌，應(yīng)結(jié)合馬尿酸鹽水解試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。彎曲菌的其余鑒定試驗(yàn)有：不同溫度的生長試驗(yàn)（25、37、42）、觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)等（見表13-1）。（4）耐藥性 由于彎曲菌感染大多呈輕癥和自限性，一般不需特異性治療。體外試

9、驗(yàn)顯示，絕大多數(shù)彎曲菌對頭孢菌素和青霉素耐藥，環(huán)丙沙星治療彎曲菌感染非常有效，但近年來也出現(xiàn)了不少耐藥菌株?？漳c彎曲菌通常對紅霉素敏感，其耐藥率小于5；而80以上的大腸彎曲菌對紅霉素耐藥。胎兒彎曲菌引起的全身感染可用紅霉素、氨芐西林、氨基糖苷類和氯霉素治療。（二）幽門螺桿菌1螺桿菌屬的主要特點(diǎn)及分類螺桿菌屬（Hilicobacter）是一群氧化酶和觸酶陽性、微需氧、37能夠生長、在25和42均生長不良的革蘭陰性彎曲菌。本屬細(xì)菌最早根據(jù)形態(tài)染色、培養(yǎng)條件等歸于彎曲菌屬，1989年Goodwin根據(jù)其超微結(jié)構(gòu)、酶活性、脂肪酸序列、生長特性等的不同，建議將其從彎曲菌屬中劃分出來而成立一個(gè)新的屬Hil

10、icobacter（螺桿菌屬）。本屬中現(xiàn)已鑒定的有19個(gè)種，研究得最多、最常見的是幽門螺桿菌（H. pylori，Hp）。2幽門螺桿菌的細(xì)菌特性（1）形態(tài)染色 HP為革蘭陰性、無芽孢、呈螺旋狀彎曲的桿菌，尤其在胃黏膜環(huán)境中，HP具有典型的螺旋形或彎曲形形態(tài)，但在陳舊培養(yǎng)物中菌體可呈圓球狀；大多數(shù)細(xì)菌具有位于菌體一端的多根帶鞘鞭毛，運(yùn)動活潑。（2）培養(yǎng)特性 HP為微需氧菌，在需氧及厭氧環(huán)境下均不能生長，在潮濕環(huán)境37同時(shí)提供510O2 、512CO2的條件下生長良好，510H2可刺激其生長；最適生長溫度3537，30和42均生長不良，此點(diǎn)可與其他彎曲菌相區(qū)別，pH5.58.5均能生長；營養(yǎng)要求高

11、，普通培養(yǎng)基不能生長，常用的培養(yǎng)基有心腦浸出液瓊脂、布氏瓊脂、哥倫比亞瓊脂等，培養(yǎng)基中需補(bǔ)充一些特殊物質(zhì)如血液、血清、淀粉、活性炭等，在Campy-BAP培養(yǎng)基上不生長。選擇培養(yǎng)基可用改良的Skirrow瓊脂培養(yǎng)基加入萬古霉素、兩性霉素和cefsulodin，本菌在非選擇性血平板上經(jīng)35天孵育后形成小的半透明灰色菌落，有微弱的溶血環(huán)，革蘭染色很淺。（3）生化反應(yīng) 生化反應(yīng)不活潑，氧化酶和觸酶陽性，不分解任何糖類，脲酶強(qiáng)陽性，可與本屬其他細(xì)菌區(qū)別，也是檢測HP的快速診斷方法之一。具體生化特征見表13-2。表13-2 螺桿菌屬各菌種的生化特征菌種觸酶硝酸鹽還原堿性磷酸酶脲酶醋酸吲哚酚水解谷氨酸轉(zhuǎn)肽

12、酶42生長1甘油萘啶酸頭孢噻吩幽門螺桿菌+-+-RS畢氏螺桿菌+-RS犬螺桿菌-+-+ND+NDSI同性戀螺桿菌+-+SI菲氏螺桿菌+-+-+-+SS幼禽螺桿菌+-ND+NDRSH.westmeadii+-NDND-NDSR注：+，90陽性；-，10陽性；ND，未定；S，敏感；R，耐藥；I，中介（4）抵抗力 HP對酸敏感，尿素對HP可起到保護(hù)作用，1膽鹽可抑制HP生長。2臨床意義HP有較強(qiáng)的鞭毛動力和對胃黏膜/黏液有較強(qiáng)的黏附力，使HP能在接近中性的黏膜層中定植，產(chǎn)生強(qiáng)活性的尿素酶，分解尿素，在菌體周圍形成保護(hù)性氨環(huán)境，以抵抗胃黏膜上皮細(xì)胞分泌的胃酸；HP產(chǎn)生的蛋白酶能有效分解黏液蛋白，提供營

13、養(yǎng)。HP在胃內(nèi)定植后，通過對胃黏膜上皮細(xì)胞的黏附性、胃腸激素的作用、細(xì)胞壁脂多糖中脂質(zhì)A的致炎作用、產(chǎn)生多種酶（包括：尿素酶、蛋白酶、過氧化氫酶、脂酶和磷脂酶等）以及產(chǎn)生的細(xì)胞毒素等等，這些因素的共同作用導(dǎo)致臨床疾病的發(fā)生。在臨床上主要引起消化性潰瘍（十二指腸潰瘍、胃潰瘍）、慢性活動性胃竇炎等，長期感染易發(fā)展為萎縮性胃炎、胃腺癌和胃黏膜淋巴組織淋巴瘤。3微生物學(xué)檢驗(yàn)（1）檢驗(yàn)程序 見圖13-2。 胃、十二指腸活檢標(biāo)本 血清、胃液顯微鏡檢查 PCR 分離培養(yǎng) 血清檢測 快速尿素 微需氧 高濕度革蘭 病理 免疫 酶試驗(yàn) 30、 37、42 IgG SIgA染色 切片 組化 37d 特殊 染色 初報(bào)

14、 30不長 37生長 42不長 可疑菌落革蘭染色、氧化酶（） 觸酶（）動力（） 生化反應(yīng) 報(bào)告圖13-2 幽門螺桿菌檢驗(yàn)程序（2）標(biāo)本采集 多部位采集胃、十二指腸黏膜標(biāo)本，標(biāo)本要新鮮，保持濕潤，置2ml無菌等滲鹽水中保存，在運(yùn)送途中不超過3h，在4下最多保存5h。流行病學(xué)調(diào)查和檢測治療效果時(shí)可取血清檢查。（3）檢驗(yàn)方法1）顯微鏡檢查 直接鏡檢：取胃、十二指腸黏膜活檢標(biāo)本作革蘭染色，在油鏡下查找細(xì)長彎曲或呈海鷗展翅狀排列的菌體；由于涂片是在HP定植部位的黏膜進(jìn)行觀察，陽性率很高，是簡便、實(shí)用、準(zhǔn)確和較快速的診斷方法；組織學(xué)切片：可行Warthin-Starry銀染色、改良Giemsa染色、甲苯胺

15、藍(lán)染色、石炭酸復(fù)紅染色等。2）分離培養(yǎng) 用含5綿羊血的布氏瓊脂或加入7馬血的心腦浸液作為非選擇性培養(yǎng)基，用改良的Skirrow瓊脂（加入萬古霉素10mg/L、兩性霉素B10mg/L、甲氧芐啶5mg/L）作為選擇性培養(yǎng)基，在含5O2、10CO2、85N2的微需氧環(huán)境中37孵育35天，長出細(xì)小、灰白色、半透明、不溶血的菌落。3）快速檢查 快速脲酶試驗(yàn)：取一小塊新鮮活檢標(biāo)本置于含尿素的培養(yǎng)基中，由于幽門螺桿菌產(chǎn)生大量的細(xì)胞外尿素酶（相當(dāng)于普通變形桿菌的2070倍），可分解尿素產(chǎn)大量的氨，使培養(yǎng)基pH升高，指示劑變色，能在5min30min內(nèi)檢測出幽門螺桿菌；這是一種簡便實(shí)用、快速靈敏且較為準(zhǔn)確的檢測Hp方法，適合胃鏡檢查的病人；核素標(biāo)記試驗(yàn)：本試驗(yàn)的敏感性和特異性均很高，但操作起來稍繁瑣；PCR：是一種高度敏感和特異的方法，但由于實(shí)驗(yàn)條件要求較高，目前僅用于實(shí)驗(yàn)研究；抗原檢測：可用已有的商品化試劑盒，用ELISA法直接