2010實驗八不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、1234實驗分組（每人做一管，每組配一份膠）實驗分組（每人做一管，每組配一份膠）認清試劑（試劑和吸管對號、量器的使用）認清試劑（試劑和吸管對號、量器的使用）封管封管分離膠配制與灌膠（濃度為分離膠配制與灌膠（濃度為6%6%，化學聚合，化學聚合，A1C2H2G5A1C2H2G5，每組總，每組總體積為體積為10ml10ml，灌膠高度為，灌膠高度為7-8cm7-8cm）封正丁醇封正丁醇3mm3mm（手法、高度、（手法、高度、15min15min左右出現(xiàn)折光線時可進行左右出現(xiàn)折光線時可進行下一步操作）下一步操作）1.1分離膠的配制分離膠的配制561.2濃縮膠的配制濃縮膠的配制781.3安裝、加樣、電泳安

2、裝、加樣、電泳910112.1電泳的概念電泳的概念122.2電泳的基本原理電泳的基本原理132.3電泳分離蛋白質(zhì)的原理電泳分離蛋白質(zhì)的原理142.4實驗室中常用到的電泳方法實驗室中常用到的電泳方法（以介質(zhì)分類）（以介質(zhì)分類）15163.1聚丙烯酰胺凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠電泳原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱簡稱PAGE)PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。 1 1、

3、聚丙烯酰胺凝膠由、聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺單體丙烯酰胺和和甲基雙丙烯酰胺甲基雙丙烯酰胺聚合而形成聚合而形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚合過程由自由基催化完成。的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚合過程由自由基催化完成。 2 2、催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合法。、催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合法。 (1)(1)在化學聚合過程中，以在化學聚合過程中，以過硫酸銨（過硫酸銨（APAP）為催化劑，以為催化劑，以四甲基乙四甲基乙二胺（二胺（TEMEDTEMED）為加速劑為加速劑, TEMED, TEMED催化催化APAP產(chǎn)生自由基；產(chǎn)生自由基； (2)(2)在光聚合過程中，以在光聚合過程中，以核黃素

4、核黃素為催化劑，光催化核黃素產(chǎn)生自由為催化劑，光催化核黃素產(chǎn)生自由基。自由基引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲基雙丙烯酰胺與丙烯基。自由基引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲基雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲基鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。酰胺鏈間產(chǎn)生甲基鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。173.2聚丙烯酰胺凝膠的特性聚丙烯酰胺凝膠的特性(1)(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)(2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應(yīng)，在很多溶劑中化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；不溶；(3)(3)對對pHpH和溫度變化較穩(wěn)定；和溫度變化較穩(wěn)

5、定；(4)(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要幾乎無吸附和電滲作用，只要AcrAcr純度高，操作條件一致，純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；則樣品分離重復(fù)性好；(5)(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達1010-6-6g g(6)(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因

6、而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。等有更高的分辨率。183.3聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類1. 1. 根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：（1 1）連續(xù)系統(tǒng)）連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pHpH值及凝膠濃度相同，帶值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng) （2 2）不連續(xù)系統(tǒng)）不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pHpH，凝膠濃，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆

7、粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。前者佳。 2. 2. 根據(jù)蛋白質(zhì)樣品變性與否，分為：根據(jù)蛋白質(zhì)樣品變性與否，分為：（1 1）變性電泳）變性電泳也就是也就是SDS-PAGESDS-PAGE，蛋白質(zhì)失去二三級結(jié)構(gòu)；，蛋白質(zhì)失去二三級結(jié)構(gòu)；（2 2）非變性電泳）非變性電泳 蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。量大小

8、、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。3.3.根據(jù)電泳槽體系的類型，分為：根據(jù)電泳槽體系的類型，分為： （1 1）圓盤電泳）圓盤電泳（2 2）板狀電泳）板狀電泳兩者電泳原理完全相同。兩者電泳原理完全相同。 19202122232425 SDS-PAGE SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由最初由shapiroshapiro于于19671967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分入

9、離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素），其原理在于：子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀?，其原理在于：1.1.去電荷：去電荷：由于由于SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）產(chǎn)生的十二烷基硫酸根帶負電，（十二烷基硫酸鈉）產(chǎn)生的十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質(zhì)使各種蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量，白質(zhì)分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別；因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別； 2.2.破壞結(jié)構(gòu)：破壞結(jié)構(gòu)：SDSSDS能斷裂分子內(nèi)和

10、分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應(yīng)于各個亞基的幾條帶；可能會形成分別對應(yīng)于各個亞基的幾條帶；3.3.統(tǒng)一構(gòu)象：統(tǒng)一構(gòu)象：SDSSDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合復(fù)合物形成近似物形成近似“雪茄煙雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDSSDS復(fù)合物的短軸長復(fù)合物的短軸長度都一樣，約為度都一樣，約為18A18A；

11、 這樣的蛋白質(zhì)這樣的蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原來的復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原來的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小。SDS-PAGESDS-PAGE的原理的原理26274.1 4.1 不連續(xù)不連續(xù)PAGEPAGE的原理的原理284.2不連續(xù)體系的組份不連續(xù)體系的組份 不連續(xù)體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液所組成。不連續(xù)體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液所組成。1. 1. 濃縮膠是由核黃素催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為濃縮膠是由核黃素催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7pH6.7的的Tris-H

12、C1Tris-HC1。2. 2. 分離膠是由分離膠是由APAP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 pH8.9 Tris-HC1Tris-HC1。3. 3. 電極緩沖液是電極緩沖液是pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。甘氨酸緩沖液。 2 2種孔徑的凝膠、種孔徑的凝膠、2 2種緩沖體系、種緩沖體系、3 3種種pHpH值使不連續(xù)體系形成值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、了凝膠孔徑、pHpH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素?？s的主要因素。294.3樣品濃縮效應(yīng)樣品濃縮效應(yīng)1.1.凝

13、膠孔徑不連續(xù)性；凝膠孔徑不連續(xù)性；2.2.緩沖體系離子成分及緩沖體系離子成分及pHpH值的不連續(xù)性；值的不連續(xù)性；v在在pH6.7pH6.7的凝膠緩沖體系中的凝膠緩沖體系中 前導(dǎo)離子或快離子：前導(dǎo)離子或快離子：HC1HC1解離出的氯根解離出的氯根(C1(C1- -) ) 尾隨離子尾隨離子(trailing ion)(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根或慢離子：甘氨酸根 m mclcl clclmmp p p p m mG G G G(Cl(Cl代表氯根，代表氯根，P P代表蛋白質(zhì)，代表蛋白質(zhì)，G G代表甘氨代表甘氨酸根酸根) )有效遷移率有效遷移率= =m m ，m m為遷移率，為遷移率， 為解離度為解離度) )v當進入當進入pH