碩士研究生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義（碩士研究生試用）山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室2010.6實(shí)驗(yàn)一 動(dòng)物組織蛋白質(zhì)的提取【目的要求】1掌握動(dòng)物組織蛋白質(zhì)的提取方法。 2了解動(dòng)物組織蛋白質(zhì)提取的原理。【實(shí)驗(yàn)原理】 由于蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)上的差異很大，即或是同類蛋白質(zhì)，因選用材料不同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。但多數(shù)分離工作中的關(guān)鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度的差異

2、，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團(tuán)與極性親水基團(tuán)的比例，其次取決于這些基團(tuán)的排列和偶極矩。故分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)是不同蛋白質(zhì)溶解差異的內(nèi)因。溫度、pH、離子強(qiáng)度等是影響蛋白質(zhì)溶解度的外界條件。提取蛋白質(zhì)時(shí)常根據(jù)這些內(nèi)外因素綜合加以利用，將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取出來(lái)，并與其它不需要的物質(zhì)分開。但動(dòng)物材料中的蛋白質(zhì)有些以可溶性的形式存在于體液（如血漿、消化液等）中，可以不必經(jīng)過(guò)提取直接進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質(zhì)，只需要適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質(zhì)，最后剩下的就是不溶性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當(dāng)溶劑，將蛋白質(zhì)溶解出來(lái)，再用

3、離心法除去不溶物，即得粗提取液?！驹噭┢鞑摹? 實(shí)驗(yàn)小鼠2 0.9%NaCl3 動(dòng)物組織蛋白裂解緩沖液Tris 50mMNaCl 150mMEDTA 0.5mMDTT 1mMTriton X-100 1%去氧膽酸鈉 0.5%SDS 0.1%4 PMSF/異丙醇儲(chǔ)備液 100mM（174mg/10ml）于-20儲(chǔ)存5 -20儲(chǔ)存的冰塊【操作步驟】1. 頸椎脫臼處死小鼠，75%酒精擦拭皮膚，剪開腹部，剪切肝臟組織，稱取0.6g，置于含預(yù)冷0.9%NaCl（6mL）的平皿中。2. 在平皿中剪碎肝臟組織，并轉(zhuǎn)移到勻漿器中。3. 在預(yù)冷的裂解緩沖液中添加PMSF/異丙醇儲(chǔ)備液（20L/2mL）。4. 迅

4、速將2mL 預(yù)冷的裂解緩沖液加入勻漿器中，冰浴條件下充分研磨。5. 將組織研磨液轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，于4離心（1 4000rpm，10min）。6. 離心完畢吸取上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管中，即為組織蛋白粗提取液。7. 所獲蛋白提取液可保存于-20用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或用考馬斯亮藍(lán)等方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定后保存?zhèn)溆?。【注意事?xiàng)】在整個(gè)制備過(guò)程中使組織始終處于冰浴狀態(tài)，以防蛋白質(zhì)的降解。實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)的定量（Bradford法）【目的要求】掌握考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度是利用蛋白質(zhì)與染

5、料結(jié)合的原理，定量測(cè)定微量蛋白質(zhì)濃度，具有快速、靈敏的特點(diǎn)?？捡R斯亮藍(lán)G-250存在兩種不同的顏色形式：紅色和藍(lán)色。當(dāng)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后由紅色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式。蛋白質(zhì)與G250的結(jié)合是通過(guò)范德華力實(shí)現(xiàn)的，并且在一定濃度范圍內(nèi)二者的結(jié)合顯色符合朗伯-比爾定律。結(jié)合后的產(chǎn)物在595nm處具有最大吸收峰，通過(guò)對(duì)溶液的光吸收測(cè)定可獲得與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量?！驹噭┢鞑摹?. 考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg溶于25mL甲醇中，加入800 mL蒸餾水，再加入 100 mL 85磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL，濾紙過(guò)濾。2. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（1mg /mL）：牛血清白蛋白100mg，加0.9N

6、aCl至100 mL。3. 試管及試管架，吸管。4. 比色計(jì)。【操作步驟】 一、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取5支試管，編號(hào)，按下表操作編 號(hào) 1號(hào)液 2號(hào)液 3號(hào)液 4號(hào)液 5號(hào)液標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（mL） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（1mg /mL）0.9NaCl（mL） 0.8 0.6 0.4 0.2 蛋白質(zhì)濃度 200 400 600 800 1000（g /mL）另取6支試管，編號(hào)為05，按下表操作 編 號(hào) 0 1 2 3 4 5 1號(hào)液 2號(hào)液 3號(hào)液 4號(hào)液 5號(hào)液 不同濃度蛋白質(zhì)溶液（mL） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.9NaCl（mL） 0.1 考馬斯亮藍(lán)試劑（

7、mL） 5 5 5 5 5 5 蛋白質(zhì)含量（g） 0 20 40 60 80 100 混勻各管，室溫下靜置10分鐘，于595 nm處進(jìn)行比色。二、 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A 595 nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。三、 測(cè)定未知樣品蛋白質(zhì)濃度：測(cè)定方法同上，取適量未知樣品，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A 595 nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。【注意事項(xiàng)】1 在考馬斯亮藍(lán)試劑加入后的520分鐘內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵诖硕螘r(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。2 測(cè)定中，蛋白染料復(fù)合物會(huì)有少量吸附于比色杯壁上，實(shí)驗(yàn)證明此復(fù)合物的吸

8、附量是可以忽略的，測(cè)定后可用乙醇將比色杯洗干凈。實(shí)驗(yàn)三 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳【目的要求】1.了解并掌握SDS-PAGE電泳原理及方法。2.掌握垂直板電泳的操作方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳可根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別分離蛋白質(zhì)，并可測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，其原理主要與電泳過(guò)程中存在的特殊物理效應(yīng)有關(guān)：1凝膠的分子篩效應(yīng)：聚丙烯酰胺凝膠是在催化劑的作用下聚合而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的微孔凝膠，蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中通過(guò)此凝膠時(shí)，會(huì)受到阻礙。大分子蛋白質(zhì)受到的阻力大，電泳速度小，而小分子蛋白質(zhì)受到的阻力小，移動(dòng)快，因而最終在凝膠中得以分離。2電荷效應(yīng)：SDS

9、是一種表面活性劑，在蛋白樣品和PAGE凝膠中加入SDS，則能與蛋白質(zhì)分子上的疏水基團(tuán)結(jié)合，使蛋白質(zhì)表面覆蓋一層SDS分子。由于十二烷基硫酸根帶有大量負(fù)電荷，且電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的帶電量，因而掩蓋了蛋白質(zhì)分子本身的電荷差別，使各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有均等密度的負(fù)電荷，分子之間的電荷差異消失。 3變性效應(yīng)：SDS同時(shí)還破壞了蛋白質(zhì)中的非共價(jià)鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在溶液中呈現(xiàn)相似的形狀。因此，蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而主要取決于分子量的大小。在進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)，同時(shí)使用蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品，則可以在電泳

10、完畢后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量大小得知樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。4凝膠對(duì)樣品的濃縮效應(yīng)：SDS-PAGE使用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，即分為低濃度的濃縮膠和較高濃度的分離膠，配制這兩種凝膠所用緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度也不相同。電泳時(shí)，樣品中的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物首先經(jīng)過(guò)濃縮膠，體積得到極大的濃縮，然后再經(jīng)過(guò)分離膠被分離。SDS-PAGE凝膠已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室常用的蛋白質(zhì)分離方法，通常被用于蛋白質(zhì)制品純度的鑒定和蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。【試劑器材】130%凝膠貯備液 稱取 30g 丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺0.8g，用去離子水配制成100ml 的溶液，過(guò)濾，貯存于棕色瓶中，4冰箱保存。210%凝膠貯備液 稱取10

11、g丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺0.5g，用去離子水配制成100ml 的溶液，過(guò)濾，貯存于棕色瓶中，4冰箱保存。310% SDS 用去離子水配制，貯存于室溫中。41% TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺）。510% 過(guò)硫酸銨 用去離子水在臨用前配制。6Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH 8.3）： Tris 6.0g甘氨酸 28.8g10% SDS溶液 10 ml用蒸餾水定容至 1000ml71.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl 緩沖液 稱取Tris 181.5g，加適量蒸餾水溶解，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至8.8，加蒸餾水至1000 ml。80.5 mol/L pH6.8 T

12、ris-HCl 緩沖液 稱取Tris 60.6g，加500ml蒸餾水溶解，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至6.8，加蒸餾水至1000 ml。90.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液 稱取Tris 6.1g，加500ml蒸餾水溶解，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0，加蒸餾水至1000 ml。102樣品緩沖液： 蔗糖 4g溴酚藍(lán) 2mg10% SDS溶液 2ml5% 巰基乙醇 0.5ml0.05mol/L Tris-HCl（pH 8.0） 2ml用蒸餾水定容至 10.0ml110.25%考馬斯亮藍(lán)R250 將2.5g考馬斯亮藍(lán)R250溶解于450 ml 甲醇中，再加入450ml蒸餾水和100

13、ml 冰乙酸，混勻，過(guò)濾除去顆粒物質(zhì)。12洗脫液 將50ml 甲醇和75ml 冰乙酸溶解于875ml蒸餾水中，混勻。13預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn):117kD、90kD、49kD、35kD、26kD、19kD共6種蛋白質(zhì)14電泳槽、電泳儀、掃描儀、染色缸、搖床、一次性手套、微量加樣器等?！静僮鞑襟E】1 制備凝膠（1）準(zhǔn)備玻璃板，洗凈、晾干。按電泳槽使用說(shuō)明裝好，按下表配制12%分離膠溶液和5%濃縮膠溶液： 表3-1：濃縮膠與分離膠的配制溶液成分 12%分離膠溶液(ml) 5%濃縮膠溶液(ml)30% 凝膠貯備液 4.0 10% 凝膠貯備液 2.51.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl 2

14、.5 0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl 1.2510% SDS 0.1 0.051% TEMED 0.8 0.4蒸餾水 2.5 0.7510% 過(guò)硫酸銨 0.1 0.05 總體積 10.0 5.0（2）小心將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃間隙中，并為濃縮膠留有空間。輕輕在頂層加入幾毫升去離子水，以阻止空氣中的氧對(duì)凝膠聚合的抑制作用。（3）凝膠聚合后，倒掉上層水，用濾紙吸干凝膠頂端的水。（4）按表3-1配制濃縮膠，注入分離膠上端，插入梳子，應(yīng)小心避免產(chǎn)生氣泡。2點(diǎn)樣（1）待測(cè)蛋白樣品的制備：若樣品為水溶液，且蛋白質(zhì)含量大于10 mg/ml，可將待測(cè)液與樣品緩沖液等體積混勻，100加熱3m

15、in。（2）濃縮膠聚合后，拔去梳子，將凝膠放入電泳槽中；在上、下槽中加入電泳緩沖液。（3）將樣品混合液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白按次序加入梳孔中。3電泳 起始電壓為8V/cm，當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至15V/cm，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，關(guān)閉電源。4染色 取下凝膠，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中，在搖床上室溫緩慢搖動(dòng)3060min。5脫色 換洗脫液，于搖床上室溫緩慢搖動(dòng)12 小時(shí)，其間更換12次洗脫液。洗脫后的凝膠可以照像或干燥，也可置于含有20%甘油的水中密閉保存。【注意事項(xiàng)】1SDS-PAGE電泳要求樣品的離子強(qiáng)度盡量要低，如果離子強(qiáng)度過(guò)高，應(yīng)經(jīng)透析或離子交換除鹽后再進(jìn)行電泳。2丙烯酰胺試劑

16、是一種神經(jīng)毒素，可通過(guò)皮膚吸收，會(huì)因多次積蓄而中毒。操作時(shí)應(yīng)極其小心，需要帶一次性手套。3上樣量以1015l為宜，如果樣品蛋白含量過(guò)少，為保證區(qū)帶清晰，可增加上樣量，同時(shí)應(yīng)將樣品緩沖液濃度提高二倍或更高。 4溴酚藍(lán)染料是指示劑，為電泳時(shí)可見的遷移標(biāo)志物。5凝膠聚合的時(shí)間與溫度有關(guān)，夏天聚合快，可置于冰浴中減慢聚合；冬天室溫低，可放入溫箱中加快聚合。實(shí)驗(yàn)四 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn)（半干式）【目的要求】1掌握半干式蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印技術(shù)的基本操作。 2掌握蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印后的檢測(cè)方法。【實(shí)驗(yàn)原理】 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）是將蛋白質(zhì)電泳分離技術(shù)與免疫標(biāo)記技術(shù)結(jié)合所形成的一種鑒定特異性抗原的方法。蛋

17、白質(zhì)轉(zhuǎn)印應(yīng)先將含某抗原的蛋白混合物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，使各種蛋白成分根據(jù)分子量的不同分離開來(lái)；再通過(guò)電轉(zhuǎn)移將各種蛋白成分轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC）或PVDF膜上；通過(guò)特異試劑（抗體）作為探針，與膜上的相應(yīng)抗原發(fā)生結(jié)合，再與酶標(biāo)記的抗Ig 抗體結(jié)合，洗滌后加入底物進(jìn)行顯色。根據(jù)顯色條帶的位置和深淺，可以對(duì)抗原及其分子量或相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)。蛋白質(zhì)的Western 印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)到低至1-5ng的靶蛋白。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是采用半干式電轉(zhuǎn)移將SDS-PAGE凝膠電泳分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持材料上。裁剪

18、與凝膠一樣大小的硝酸纖維素膜，用去離子水浸濕后，再浸入轉(zhuǎn)移緩沖液內(nèi)，隨后取出進(jìn)行轉(zhuǎn)移（半干式電轉(zhuǎn)移在室溫操作，所需時(shí)間較短）；將凝膠及與之相貼的硝酸纖維素膜夾于事先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過(guò)的濾紙之間，平放在電轉(zhuǎn)儀上，負(fù)極在上，正極在下，凝膠在陰極端，薄膜在陽(yáng)極端，轉(zhuǎn)移方向從陰極到陽(yáng)極；根據(jù)凝膠面積設(shè)置電流，室溫下進(jìn)行轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移結(jié)束，取出薄膜，麗春紅染色檢測(cè)轉(zhuǎn)印效果。【試劑器材】1 半干式電泳轉(zhuǎn)印槽2 硝酸纖維素膜3 濾紙 4 轉(zhuǎn)移電泳儀5 培養(yǎng)皿 6 萬(wàn)向旋轉(zhuǎn)搖床7 轉(zhuǎn)印緩沖液【操作步驟】 1 將電泳后的SDS-PAGE 凝膠浸在轉(zhuǎn)印緩沖液中，洗10 min。2 去掉濃縮膠，測(cè)量剩余膠的尺寸大小。3

19、 剪1張和膠大小一致的硝酸纖維素膜，用鉛筆在膜的右下角做一個(gè)標(biāo)記，用于定位。剪6張和膠大小一致的濾紙（尺寸一定不能大于膠的尺寸，否則多出的部分會(huì)在膠的邊緣接觸，形成短路，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移不充分）。 4 將膜及濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)印緩沖液中浸潤(rùn)10 min 。5 將3張濕濾紙放到半干電轉(zhuǎn)儀的底部平板電極上（負(fù)極），然后依次放置膠、硝酸纖維素膜、濾紙（3張），注意堆放整齊，同時(shí)注意每層之間避免氣泡存在，一般可用試管碾壓趕走氣泡（注意：一旦膠和膜接觸，位于膠表面的蛋白就會(huì)結(jié)合到膜上，所以膠一定要一次成功，不要試圖調(diào)整膠的位置，否則蛋白質(zhì)色帶可能會(huì)印上去，最后產(chǎn)生重迭影像）。6 待所有的膜和膠都放好后，蓋上轉(zhuǎn)印儀的上蓋，

20、讓上部的平板電極壓緊由濾紙、膜、膠形成的三明治結(jié)構(gòu)（注意正負(fù)極，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，才可以打開上蓋）。7 連接轉(zhuǎn)移電泳儀，電流通常設(shè)為1 mA/cm2左右。8 cm X 7 cm的膠通常使用100 mA恒流轉(zhuǎn)移。大膠必須限制電流在0.8 mA/cm2，防止電流過(guò)大，產(chǎn)生過(guò)多熱量，影響轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印時(shí)間如下表所示。表4-1轉(zhuǎn)印時(shí)間和蛋白分子量的關(guān)系*分子量 (MW)轉(zhuǎn)印時(shí)間 80 kDa90 分鐘* 以8X7 cm的迷你膠在100 mA恒流的條件為例8 轉(zhuǎn)印結(jié)束，取出轉(zhuǎn)印三明治，打開后依次取出轉(zhuǎn)印膜及凝膠。9 將轉(zhuǎn)印膜浸入麗春紅染色液中，觀察是否有紅色蛋白條帶出現(xiàn)；轉(zhuǎn)印后的凝膠可以進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，看有無(wú)

21、蛋白質(zhì)殘留；若電泳時(shí)加有預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker ，則可在轉(zhuǎn)印膜上看到相應(yīng)色帶，幫助確定轉(zhuǎn)印成功，并可評(píng)估轉(zhuǎn)印效率。10 若繼續(xù)進(jìn)行免疫雜交實(shí)驗(yàn)，則用去離子水漂洗轉(zhuǎn)印膜后可進(jìn)行封閉。【注意事項(xiàng)】1. 不要切去膠的一角以作標(biāo)記，因?yàn)檫@樣容易導(dǎo)致短路或轉(zhuǎn)移不充分。盡可能在電泳結(jié)束后就進(jìn)行轉(zhuǎn)印，防止樣品在膠內(nèi)彌散開來(lái)。2. 丙烯酰胺濃度越低，蛋白越容易轉(zhuǎn)移下來(lái)。所以應(yīng)選擇可以分離蛋白最低濃度的凝膠進(jìn)行電泳。梯度膠適用于轉(zhuǎn)印一系列不同大小的蛋白，因?yàn)槟z的孔與不同大小的蛋白匹配良好。3. 蛋白質(zhì)結(jié)合到硝酸纖維素膜上主要是通過(guò)疏水鍵，對(duì)于常規(guī)使用效果非常好。但對(duì)于小的多肽，建議使用小孔徑(0.2 m)

22、的膜。 4. PVDF膜比硝酸纖維素膜更疏水，在轉(zhuǎn)印過(guò)程中結(jié)合蛋白更緊密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF膜一般比硝酸纖維素膜需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆忾]條件，適用于蛋白測(cè)序。尼龍膜通過(guò)疏水和靜電相互作用結(jié)合，其SDS耐受度甚至高于PVDF膜，但也需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆忾]條件，主要建議用于Northern和Southern雜交。實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒DNA的提取（堿裂解法）【目的要求】1掌握堿裂解法制備質(zhì)粒DNA的原理和方法, 進(jìn)一步認(rèn)識(shí)質(zhì)粒 DNA 的性質(zhì)。2初步掌握分子克隆基本操作技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】質(zhì)粒（plasmid），是能在染色體外自我復(fù)制的穩(wěn)定共生型遺傳單位，主要存在于細(xì)菌、放線菌、真菌和某些動(dòng)植物細(xì)胞中。它

23、能在細(xì)菌中垂直遺傳，且保持穩(wěn)定的拷貝數(shù)，賦予宿主細(xì)胞某些特殊的表型。迄今為止從細(xì)菌中分離得到的質(zhì)粒都是雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子, 大小為1 kb200 kb。在基因工程研究中，質(zhì)粒是最常用的一種基因克隆載體，用于運(yùn)載外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞。因此，質(zhì)粒DNA的提取和純化是分子生物學(xué)技術(shù)中的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作。質(zhì)粒DNA提取的關(guān)鍵是要與細(xì)菌染色質(zhì)DNA分開。常用的提取方法有煮沸法、堿裂解法、去污劑法、有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等, 不同方法各有利弊，應(yīng)根據(jù)不同質(zhì)粒的性質(zhì)、不同宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合加以選擇。一般以堿裂解法最為常用，因?yàn)樗鼘?duì)細(xì)菌的裂解完全，對(duì)染色質(zhì)DNA和蛋白質(zhì)的變性充分，因而所

24、提取的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高、純度高。但如果堿變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，有可能會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA變性，導(dǎo)致隨后的內(nèi)切酶酶切困難。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的主要原理和步驟是：1接種含質(zhì)粒的單個(gè)菌落到培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。隨著細(xì)菌的生長(zhǎng), 質(zhì)粒DNA也隨之自主復(fù)制。必要時(shí)，可以在細(xì)菌生長(zhǎng)后期在培養(yǎng)基中適量加入氯霉素，以抑制宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和染色質(zhì)DNA的復(fù)制，細(xì)菌的數(shù)量不再增加，而質(zhì)粒DNA的復(fù)制基本不受影響，從而大量擴(kuò)增質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)。2離心收集細(xì)菌。3加入強(qiáng)堿溶液裂解菌體，必要時(shí)可以適量加入溶菌酶。此時(shí)大分子量線狀的細(xì)菌染色質(zhì)DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生變性，而閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA多數(shù)仍不變性，處于自然狀態(tài)。4幾分鐘后加

25、入中和液，將pH值調(diào)至中性。在高鹽濃度條件下，大部分染色質(zhì)DNA與蛋白質(zhì)不能復(fù)性，交連成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在去污劑SDS的作用下形成絮狀沉淀。而質(zhì)粒DNA分子量小，且為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，少數(shù)變性的質(zhì)粒DNA也能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)。5離心，去除大部分細(xì)胞碎片、染色質(zhì)DNA、RNA和蛋白質(zhì)。質(zhì)粒DNA保留在上清中。6最后再用RNA酶消化，酚/氯仿抽提、透析和乙醇（或異丙醇）沉淀等方法進(jìn)一步去除殘余蛋白質(zhì)和核酸，純化質(zhì)粒DNA?！驹噭┢鞑摹?LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g, 酵母抽提液5 g，NaCl 10 g, 加蒸餾水至1 000 mL, 用NaOH調(diào)pH至7.5 , 高壓蒸汽消毒20 min。2I號(hào)

26、液：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L TrisCl（pH 8.0），10mmol/L EDTA（必要時(shí)在使用前加溶菌酶4mg/mL）3II號(hào)液：0.2mol/L NaOH，含1%SDS（II號(hào)液必須在實(shí)驗(yàn)時(shí)新鮮配制）4III號(hào)液：5mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml（含3mol/L鉀，5mol/L醋酸，pH4.8）5RNase：10mg/mL 20保存?zhèn)溆?TE：10mmol/L TrisHCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)。高壓滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?STE ：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl

27、 （pH 8.0），1mmol/L EDTA8酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）9乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇），-20保存?zhèn)溆?0臺(tái)式低溫高速離心機(jī)11渦旋混合器（Vortex）121.5ml eppendorf離心管（滅菌）13移液器【操作步驟】1培養(yǎng)：在5ml含適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)液中接種含質(zhì)粒的單個(gè)菌落，37，150rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2收菌：取1-1.5ml培養(yǎng)液于1.5ml Ependorf管中，5000rpm離心3分鐘，棄上清，收集細(xì)菌。3重懸：棄上清，在沉淀中加入預(yù)冷的I號(hào)液 100l，vortex強(qiáng)烈振蕩，充分懸浮菌體。4裂解：加新鮮配制的II號(hào)液200l，立即溫和顛倒離心管5

28、次，混勻。置冰水浴中3-5分鐘。5中和：加入150l預(yù)冷的III號(hào)液，立即溫和顛倒混勻數(shù)次，混勻。置冰水浴中3-5分鐘。6沉淀：12 000 rpm離心10分鐘，取上清液置新Ependorf管中。7酚/氯仿抽提：加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩混勻，12000rpm離心2分鐘。取上清液（小心不要吸到中間蛋白膜），轉(zhuǎn)入另一個(gè)Eppendorf管中。8氯仿抽提：加入等體積的氯仿，振蕩混勻，12000rpm離心2分鐘，取上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)Eppendorf管中。 9乙醇沉淀：加入2倍體積的無(wú)水乙醇（或0.6倍體積異丙醇），混勻，室溫放置10分鐘。4，12000rpm離心5分鐘。10

29、洗滌：棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌，4，12000rpm離心2分鐘。11干燥：棄上清，用消毒濾紙條小心吸凈管壁乙醇滴。將Eppendorf管倒置于濾紙上，室溫蒸發(fā)乙醇10分鐘。 12溶解：加入20l TE（含無(wú)DNA酶的RNA 酶20g/ml），溫和振蕩2分鐘。置于20冰箱保存。實(shí)驗(yàn)六 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體外擴(kuò)增DNA【目的要求】掌握PCR的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種通過(guò)體外酶促反應(yīng)大量、快速、選擇性地合成目的DNA片段的核酸合成技術(shù)，具有高度特異性、操作簡(jiǎn)單、高效快速、靈敏度高等特點(diǎn)，是最常用的分子生物

30、學(xué)技術(shù)之一。圖6-1：PCR原理示意圖PCR的基本原理如圖6-1所示。PCR反應(yīng)體系主要由以下5種成分組成：與目的基因上下游互補(bǔ)的兩條單鏈DNA引物（primer）、含目的基因片段的模板DNA、耐熱DNA聚合酶、四種dNTP底物和緩沖液。經(jīng)過(guò)約94的熱變性（使雙鏈DNA模板解離為單鏈）、3760退火（使引物與模板特異性結(jié)合）、72延伸（在DNA聚合酶的催化下合成DNA互補(bǔ)鏈）三步反應(yīng)為一個(gè)循環(huán)。每循環(huán)一次，目的基因片段數(shù)量即大約增加1倍（理論值為2n），而每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA又成為了下一次循環(huán)的模板。通過(guò)2030次變性、退火、延伸三種溫度的循環(huán)，目的基因片段的數(shù)量可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)以指數(shù)形式

31、擴(kuò)增上百萬(wàn)倍。因此可以迅速地從極其微量的樣品（如一根毛發(fā)、一滴血）中大量獲取目的基因片段。PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化：優(yōu)化的目的主要有兩個(gè)，即提高擴(kuò)增產(chǎn)物特異性和提高產(chǎn)物產(chǎn)量。但在多數(shù)情況下，這兩個(gè)目的卻是互相矛盾的。總體來(lái)說(shuō)，適當(dāng)減少模板、引物、聚合酶、Mg2+的濃度和適當(dāng)提高退火溫度、減少循環(huán)次數(shù)，可以提高產(chǎn)物的特異性，但相應(yīng)會(huì)減少產(chǎn)量；反之，則可以提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，但增加非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠磉x擇最佳反應(yīng)條件，必要時(shí)可進(jìn)行多次預(yù)實(shí)驗(yàn)反復(fù)摸索。1引物：引物是決定PCR成敗的最關(guān)鍵因素。必須保證引物堿基序列的高度特異性；引物長(zhǎng)度一般為15-30bp，過(guò)短則特異性降低；G+C含量控

32、制在40-60%，且兩個(gè)引物的Tm值不得相差太大；引物自身不得存在3bp以上的互補(bǔ)堿基序列；兩條引物之間不應(yīng)存在4個(gè)以上連續(xù)的同源性或互補(bǔ)性堿基；避免4個(gè)以上同一堿基的連續(xù)出現(xiàn)；引物合成質(zhì)量要好，并需要純化；反應(yīng)體系中引物濃度一般應(yīng)控制在0.2-1mol/L，過(guò)低則產(chǎn)量降低，過(guò)高則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。2耐熱DNA聚合酶：通常Taq DNA聚合酶用量為0.5-5U/100l，酶量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加；傳統(tǒng)使用的Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命缺點(diǎn)是不具備 35校正外切酶活性，錯(cuò)配率高（大約每聚合9000個(gè)核苷酸發(fā)生一次錯(cuò)誤摻入，經(jīng)過(guò)約20個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物中隨機(jī)突變率大致為1/400-1/90

33、0），導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生突變?，F(xiàn)已有多種高保真耐熱DNA聚合酶（如Pfu DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶等）可供選擇，用于某些精度要求高的實(shí)驗(yàn)。3模板：PCR對(duì)模板的質(zhì)和量要求都不是太高。RNA也可作為模板，但須先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。模板不需要太純，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白。對(duì)于擴(kuò)增哺乳動(dòng)物基因組中單拷貝序列，模板DNA的加入量一般為0.2-2g。對(duì)于質(zhì)粒DNA模板只需要20ng。模板量過(guò)多，會(huì)增加非特異性擴(kuò)增機(jī)會(huì)。4Mg2+濃度：Mg2+是維持Taq DNA聚合酶活性所必需的，還影響DNA的Tm值、產(chǎn)物的特異性及引物二聚體的形成。Mg2

34、+濃度過(guò)低時(shí)，酶活性顯著降低，使產(chǎn)量降低；過(guò)高時(shí)，易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。由于模板DNA、引物、EDTA和dNTP均可與Mg2+結(jié)合而降低游離Mg2+濃度，因此Mg2+的濃度應(yīng)比dNTP高0.2-2.5 mmol/L，模板的DNA應(yīng)溶于10mmol/L Tris-HCl(pH7.6)/0.1mmol/L EDTA中。5dNTPs：dNTP具有較強(qiáng)的酸性，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5。濃度范圍為20-200mol/L，高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而濃度太低則降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。四種dNTP應(yīng)等當(dāng)量配制，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會(huì)誘導(dǎo)錯(cuò)誤摻入，降低合成速度，過(guò)早終止反應(yīng)。決定最低dNT

35、P濃度的因素是靶序列DNA的長(zhǎng)度和組成。在100l反應(yīng)體系中，20mol/L dNTPs基本滿足合成2.6g DNA，50mol/L dNTPs可以合成6.6g DNA，而200mol/L dNTPs則足以合成25gDNA。6變性溫度與時(shí)間：通常采用94-95變性1分鐘。一般在第1次熱循環(huán)前預(yù)先94變性5-10分鐘，然后再進(jìn)入循環(huán)過(guò)程的94變性階段。7復(fù)性溫度與時(shí)間：這是決定PCR成敗的又一個(gè)關(guān)鍵因素，它直接決定了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。合適的復(fù)性溫度應(yīng)低于PCR條件下真實(shí)Tm值。降低溫度可提高產(chǎn)量，但增加非特異性擴(kuò)增；反之則提高特異性但降低產(chǎn)量。8、延伸溫度和時(shí)間：延伸溫度一般為72。延伸時(shí)間主要

36、視目標(biāo)DNA片段長(zhǎng)度而定。正常摻入速度為35-100nt/秒，一般情況下30-60秒就足夠，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也增加非特異性擴(kuò)增。但最后一個(gè)循環(huán)可將時(shí)間延長(zhǎng)到4-10分鐘。9循環(huán)次數(shù)：在PCR反應(yīng)后期，由于底物和引物的消耗、酶活性的下降、終產(chǎn)物（雙鏈DNA、焦磷酸）的堆積等原因，導(dǎo)致產(chǎn)物從原來(lái)以指數(shù)級(jí)增加的形式轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性形式，即所謂平臺(tái)效應(yīng)。所以即便再增加循環(huán)數(shù)，由于產(chǎn)物的增加量有限，反而會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的機(jī)會(huì)。常規(guī)循環(huán)數(shù)為25-40，多數(shù)為30次左右。如果要進(jìn)一步提高產(chǎn)量，可將樣品稀釋1000-10000倍后進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。10、其它因素：50mmol/L KCl可提高酶促效率。BSA、DTT

37、、明膠、Tween- 20等能有助于酶的穩(wěn)定。5-10%DMSO有利于DNA變性，但抑制酶活性。5-20%甘油有利于DNA復(fù)性?！驹噭┢鞑摹?DNA模板（0.5mg/ml）210 pmol/L上游引物310 pmol/L下游引物410 PCR buffer：200 mmol/L Tris-HCl pH 8.315 mmol/L MgCl2250 mmol/L KCl0.5% Tween-20l mg/ml BSA510 mmol/L dNTPs：四種dNTP各2.5mmol/L6Taq DNA聚合酶（1 U/l）7PCR儀80.2ml Eppendorf離心管9微量移液器【操作步驟】1在0.2

38、ml離心管中加入： 10PCR緩沖液 5.0l 10 mmol/L dNTPs 4.0l 上游引物 2.0l 下游引物 2.0l 模板DNA 10lTaq DNA聚合酶 0.3-0.5l（1-2U）。 加去離子水至終體積為 50l2混勻后，短暫離心。3將離心管置PCR儀中。4設(shè)定熱循環(huán)參數(shù)： 94 5分鐘 94 30秒55 30秒 循環(huán)30次72 30秒72 10分鐘4 1小時(shí)5進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)（約2-3小時(shí)）。6取出反應(yīng)管，吸取少量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。其余樣品置-20保存?zhèn)溆谩?實(shí)驗(yàn)七 DNA的瓊脂糖凝膠電泳【目的要求】學(xué)習(xí)并掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳基本原理和操作，了解如何通過(guò)電泳判斷DNA

39、純度、含量和分子量。【實(shí)驗(yàn)原理】凝膠電泳是分離、純化和鑒定DNA的常用方法。因?yàn)镈NA分子是兩性解離分子，在pH高于其等電點(diǎn)（約3.5）的中性或堿性溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極方向泳動(dòng)。DNA凝膠電泳的介質(zhì)主要有兩種：瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯凝膠的孔徑較小，適合于分離5-500bp的小片段DNA；而瓊脂糖凝膠的孔徑較大，可以分離100bp-60kb的較大片段DNA。不同濃度的瓊脂糖凝膠適合于分離不同大小的DNA片段（表7-1）。 瓊脂糖是從海藻中提取出來(lái)的一種線狀高聚物，當(dāng)熔化后再凝固時(shí)就會(huì)形成固體基質(zhì)，具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小取決于瓊脂糖濃度。DNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，受到

40、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)的雙重影響。電荷效應(yīng)由分子所帶的電荷量多少來(lái)決定，而分子篩效應(yīng)則與分子大小和構(gòu)象有關(guān)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的泳動(dòng)速度主要取決于分子量表7-1：不同濃度瓊脂糖凝膠對(duì)DNA的有效分離范圍瓊脂糖濃度（%）線性DNA有效分離范圍(kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3大小和構(gòu)象。線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠介質(zhì)中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比。分子越大，遷移速度越慢，從而可以將不同大小的DNA分子分開。因此，通過(guò)與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物（MW marker）的遷移率對(duì)照，可以鑒定DNA分子的

41、大小。DNA分子的構(gòu)象也可以明顯影響其遷移率。在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA有3種構(gòu)象：超螺旋的共價(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的開環(huán)DNA（open circular DNA，ocDNA）和線性DNA，在瓊脂糖凝膠電泳中，其泳動(dòng)速度依次為：cccDNA 線性DNA ocDNA，因而未酶切的質(zhì)粒DNA在電泳中多顯示為3條帶，泳動(dòng)速度最快的超螺旋帶越亮，說(shuō)明質(zhì)粒DNA提取質(zhì)量越好。DNA的遷移率還與電場(chǎng)強(qiáng)度（即單位長(zhǎng)度的電壓降）有關(guān)，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，泳動(dòng)速度越快。當(dāng)需要快速觀察電泳結(jié)果時(shí)，可以適當(dāng)加大電場(chǎng)強(qiáng)度。但是電泳分辨率會(huì)隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大而縮小，因?yàn)楦叻肿痈咚倭鲃?dòng)時(shí)摩擦力增加，相對(duì)分子質(zhì)量與移動(dòng)速度就不一定成正比，因此一般電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)不超過(guò)5V/cm。特別是當(dāng)需要較精確測(cè)定DNA片段大小、獲得理想的分辨率和漂亮的帶型時(shí)，應(yīng)該適當(dāng)降低電場(chǎng)強(qiáng)度，相應(yīng)的適當(dāng)延長(zhǎng)電泳時(shí)間，并選用相對(duì)較低的凝膠濃度。為了顯示凝膠中DNA的泳動(dòng)位置，需要加入染色劑染色。最常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間，在紫外線的激發(fā)下發(fā)出橘紅色熒光。一般是在凝膠中直