生物化學技術原理及應用

1、生物化學技術原理及應用生物化學技術原理及應用題型:1 .填 空 題：（0.5分/空，共20分）2 .名詞解釋：（2分/個，共10分）3 .判斷題：（1分/題，共20分）4 .簡答題：（10分/題，共50分）第一章生物大分子物質的制備1 .相關概念：1 .抽提：用抽提液（常用緩沖液，稀酸，稀堿，有機溶劑例如丙酮，乙醇）進行反復萃 取，將原料中有效成分最大限度分離出來的過程。2 .知識點：1 .理想抽提液具備：有效成分溶解度大，雜質不溶解或溶解度很小，來源廣泛，價格低 廉，操作安全。2 .影響有效成分抽提的因素：溶液PH （偏離等電點的穩(wěn)定范圍內），離子強度（極性大在離子強度高，極性小在離子強度低

2、），溫度（低溫0攝氏度時最穩(wěn)定），攪拌（促使抽提物抽提液相互接觸，增加溶解度，采用溫和適中的速度，速度慢起不到攪拌作用， 速度快產(chǎn)生氣泡，使酶變性失活）氧化（氧化劑氧化分子與疏基導致失活，加入還原劑 防止氧化），水解酶（蛋白受本身固有水解酶影響，加入抑制劑后使水解酶喪失活性），金屬離子（蛋白與金屬離子結合生成沉淀復合物，用無離子水或重蒸水配制試劑， 配制試劑中加13mmo/L EDTA ,抽提液與抽提物比例（5:1,抽提液過多有利于有效成分 提取，不利于純化程序。否則，反之 ）。3 .濃縮常用方法沉淀法，吸附法，超過濾法，透析法，離心法，干燥法。4 .影響生物大分子保存的主要因素空氣（隔絕），

3、溫度（低溫方面），水分，光線，樣品的 PH時間。第二章離心一.知識點：1 .離心的基本原理：生物樣品懸浮液在高速旋轉下， 在巨大的離心力作用下， 離心力大 于懸浮力，使懸浮顆粒以一定的速度沉降下來。2 .離心力表示方法：rpf3 .離心機的種類：普通離心機（轉速小于1000）,高速離心機，超速離心機（轉速大于 2000）。4 .離心機主要構件：轉子，離心管5 .離心基本方法：沉淀離心，差速離心，密度梯度離心6 .離心機操作時注意：（1）轉速設定，離心力 懸浮力/ 2。（2）對稱于中心的兩個離心管 重量要平衡。（3）加樣量勿超過 3/4。（4）對于低溫離心機要預先設置低溫。（5）離心過程中注意聽

4、聲音，看儀表。第三章電泳技術一.相關概念：1 .電泳：帶電顆粒在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。2 .電泳遷移率：帶電粒子在單位時間內移動的距離叫電泳遷移率。3 .電滲現(xiàn)象：液體層相對于介質移動的現(xiàn)象。4 .兩性電解質：所帶電荷隨著溶液酸堿度的變化而變化，酸性溶液中帶正電荷， 堿性溶液帶負電荷。5 .印跡：將生物大分子凝膠轉移到物像載體上。二知識點：1 .影響電泳分離的主要因素內因：分子量大小，分子形狀，分子性質，帶電荷量，分子直徑。外因：電場強度，溶液 PH,溶液黏度，離子濃度，緩沖液性質。2 .瓊脂糖凝膠聚合原理： 依靠瓊脂糖上的羥基，在聚合過程中，羥基與羥基上的氫鍵的 聚合

5、。3 .PAGE的組成，聚合原理及聚合方式1組成：丙烯酰胺（單體）和甲撐雙丙烯酰胺（雙體交換劑）組成。2原理：丙烯酰胺（單體）和甲撐雙丙烯酰胺（雙體交換劑）為材料，在催化劑作用下，聚合為含酰胺基側鏈的脂肪族長鏈，在相鄰長鏈之間通過甲撐橋連接而形成的三 維網(wǎng)狀結構物質。3聚合方式：（1）化學聚合法：加入過硫酸鏤，當丙烯酰胺，交聯(lián)劑，四甲基乙二 胺的水溶液中加入過硫酸鏤，立即產(chǎn)生自由基，丙烯酰胺與自由基作用，隨之活化。（2）光催化法：B2作為催化劑，光聚合過程在光激發(fā)下催化完成，核黃素在氧及紫外線作用下，生成含自由基的產(chǎn)物，與上述AP作用相同。4 .PAGE分離樣品時的三種效應：濃縮效應，分離效應

6、，電荷效應。5 .SDS-PAGE電泳（變性凝膠電泳）主要成分的作用：（1）甘油或蔗糖：密度大，與樣品結合，不發(fā)生漂樣。（2） SDS:與蛋白質結合，破壞高級結構，破壞氫鍵，去除蛋白質帶電荷差異。（3）琉基乙醇：破壞二硫鍵，使完整結構變松散。（4）澳酚藍：電泳指示劑。6 .等電聚焦電泳基本原理： 小分子進入凝膠內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被阻排在外部，下來的路程短。7 .等電聚焦電泳的基本原理：蛋白質等電點不同，在同一PH下帶電荷量不同從而進行分離。8 .2D PAGE勺操作順序：先等電聚焦電泳，再 SDS-PAGE.9.Western blotting 的操作步驟：（1）對蛋白質樣品

7、電泳分離（2）轉膜（3）封閉（4） 加入一抗與目的蛋白結合（5）加二抗（6）洗膜（7）膜的光分析。第四章沉淀法一相關概念：1.沉淀：溶液中的物質由液相變成固相析出的過程。二知識點：1.制備蛋白質常用的沉淀方法（1）.鹽析法：中性鹽的親水性大于蛋白質和酶分子的親水性；加入中性鹽后，破壞了 水膜暴露出疏水區(qū)域；同時又中和了電荷，破壞了親水膠體。（2）有機溶劑沉淀法：破壞蛋白質分子表面水化膜；降低水溶液的介電常數(shù)，增加蛋 白質分子間的相互作用而使溶解度降低。（3）蛋白質沉淀法（4）聚乙二醇沉淀法：有機物與生物大分子發(fā)生共沉淀；使生物大分子脫水而發(fā)生沉 淀；空間位置排斥將生物大分子擠在一起（5）選擇性

8、沉淀法：根據(jù)各種蛋白質在不同物理、化學因子作用下穩(wěn)定性不同的特點, 用選擇性沉淀法即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中，從而達 到純化有效成分的目的。（6）結晶沉淀法（7）等電點沉淀法：等電點易形成沉淀析出，常與鹽析法、有機溶劑沉淀法等配合使 用。第五章層析技術一相關概念：1 .層析：以基質為固定相（呈柱狀或薄層狀），以液體或氣體為流動相，使有效成分和 和雜質在這兩個相中連續(xù)不斷，反復多次地進行分配或交換，吸附作用，最終達到分離混合物的目的。2 .固定相：位置相對不動，對樣品產(chǎn)生保留的一項。它可以是固體物質，也可以是固定于載體上的液體物質；能與待分離的化合物發(fā)生可逆的吸附，脫

9、吸附的過程。3 .流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體，氣體等。柱層析中稱為洗脫劑，薄層層析中稱為展層劑。4 .分配系數(shù)：是指一組分在固定相與流動相中含量的比值，常用k表示。5 .正相色譜：固定相的極性高于流動相的極性，非極性分子或極性大分子先從柱中流出 來，分離純化極性大的分子。6 .反相色譜：固定相的極性低于流動相的極性，極性分子或極性小的分子先從柱中流出 來，分離純化極性小的分子。7 .操作容量：在特定條件下，某種成分與基質反應達到平衡時，存在于基質上的飽和容量。二知識點：1 .層析方法分類：(1)根據(jù)流動相形式不同：液相層析，氣相層析(2)根據(jù)固定相形式

10、不同：柱層析，紙層析薄層層析(3)根據(jù)原理不同：吸附層析，分配層析，離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析。第六章離子交換層析一相關概念：1.離子交換層析：以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進行的層析方法二知識點：1 .分離原理：離子交換劑與溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行， 或者借助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。2 . 1離子交換劑的組成：基質(載體)，電荷基團(或功能基團)，反離子。2離子交換劑的種類：(1)陽離子交換劑：活化處理方式 CM千維素。(2)陰離子交換劑：活化處理方式 DEA弗維素。3 .層析操作步驟層析柱的選擇？平衡緩沖液

11、的選擇？裝柱？加樣？洗脫？收集？樣品的脫鹽和濃縮4 .洗脫方式單一洗脫法(適用于組分簡單)，階段洗脫法，連續(xù)洗脫法(最常用)第七章吸附層析法一相關概念：1.吸附層析法：以多孔凝膠填料為固定相， 利用分子篩功能將分子大小不同的樣品組分 加以分離的方法。二知識點:1 .分離原理：在吸附劑表面存在著許多隨機分布的吸附位點， 這些位點通過范德華力和 靜電引力與蛋白質核酸等生物分子結合， 混合物在層析柱不斷吸附， 解吸再吸附即在固 定相和流動相中連續(xù)分配，從而達到分離效果。2 .常見的吸附劑有：羥基磷灰石，硅膠，活化氧化鋁-硅膠，活性炭，大孔吸附樹脂。3 .依據(jù)層析方式不同，吸附層析法的種類：柱層析，薄

12、層層析。4 .薄層層析的操作步驟：1、薄層板的制備2、點樣3、展層4、顯色5、檢測第八章凝膠層析法一相關概念：1 .凝膠層析法：以多孔凝膠填料為固定相，利用分子篩功能將分子大小的樣品組分加以 分離的方法。2 .外水體積：指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，即流動相的體積。3 .內水體積：凝膠顆粒中孔穴的體積。4 .柱床體積：凝膠柱中所能容納的體積。5 .排阻極限：指不能進入凝膠顆?？籽▋炔康淖钚》肿拥姆肿恿俊? .吸水率：1g干凝膠吸收水的體積或重量，但不包括顆粒間的吸附水分。二知識點：1 .分離原理：凝膠具有網(wǎng)狀結構，小分子物質能進入其內部， 而大分子物質卻被排阻在 外部，當一混合溶液通過，凝

13、膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子質量篩分開 了。2 .常見的凝膠有：葡聚糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，交聯(lián)葡聚糖與雙丙烯酰膠共聚凝膠， 瓊脂糖凝膠，交聯(lián)瓊脂糖凝膠。第九章免疫層析一.相關概念：1 .抗原：指進入異種機體后，能致敏淋巴細胞、能與抗體發(fā)生特異結合的物質。抗原與 抗體結合的特異性稱為抗原性。2 .抗體：機體受抗原刺激后，由淋巴細胞特別是漿細胞合成的一類能與相應抗原發(fā)生特 異性結合的球蛋白，又稱免疫球蛋白。3 .免疫佐劑：先于抗體或與抗原一起注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答 或改變免疫應答類型的物質。4 .半抗原：有些小分子物質只有抗原特異性而無免疫原性故稱半抗原。二知識

14、點：1 .抗原性包括：免疫原性和抗原特異性。2 .一個良好的抗原應具備的條件：分子足夠大，外源性強，結構盡量復雜，可降解性好3 .人類抗體的種類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。4 .佐劑的種類：無機佐劑、有機佐劑、合成佐劑。5 .單克隆抗體產(chǎn)生的機制：1骨髓瘤細胞的特征：骨髓瘤細胞是一種惡變細胞。它在體外有無限的增殖力，并 能分泌很多化學結構均一的免疫球蛋白，但特異性較差。當它與不同性質的動物脾細胞 融合時，可形成雜交瘤細胞株。該細胞株在HAT培養(yǎng)基中生長良好，而骨髓瘤細胞則在HAT培養(yǎng)基中不能生長。2脾細胞的特點：經(jīng)免疫的動物細胞，不能在體外增殖， 但是能產(chǎn)生相應的特異抗體，能與骨

15、髓瘤細胞融合，并形成可分泌單克隆抗體的細胞 株。3單克隆抗體的產(chǎn)生：把骨髓瘤細胞和經(jīng)免疫的鼠脾細胞置于聚乙二醇中融合， 然后在HAT培養(yǎng)液中選擇培養(yǎng)。骨髓瘤細胞和動物脾細胞在聚乙二醇的作用下發(fā)生融合，在HAT培養(yǎng)基中骨髓瘤細胞，沒有融合的脾細胞均不能進行增長繁殖，只有骨髓瘤細胞-脾細胞融合體才能發(fā)生增 殖，增殖過程中產(chǎn)生單個細胞株，單個的細胞株在培養(yǎng)的過程中，脾細胞分泌一些免疫 性物質。第十章親和層析法一相關概念：1.親和層析：利用生物分子間所具有的專一而可逆的親和力，使生物分子分離純化的方 法。二知識點：1 .分離原理：以親和吸附劑為固定相， 以特異性溶液為流動相， 欲分離物質通過在固定 相

16、所裝的層析柱時，借助靜電引力，范德華力，結構互補效應等作用，使待分離的物質 吸附在固定相上，不吸附的被平衡緩液洗滌出來形成第一個層析峰。然后，改變緩沖溶 液PH或增加離子強度等方式將有效成分從固定相上解離下來形成第二個層析峰。2 .親和吸附劑的結構：基質-間隔臂分子-配體第十一章氣相色譜法一相關概念：1 .氣相色譜法：以氣體為流動相的色譜分離技術。2 .載氣：是指沿著固定相移動的惰性氣體。3 .固定液：在擔體或毛細管表面均勻涂漬的有機化合物液膜稱為固定液。4 .保留值：試樣各組分在色譜柱中滯留的時間或將組分帶出色譜柱所需載氣的體積。5 .色譜峰：由檢測器輸出的電信號對時間作圖，所得的曲線稱色譜流出曲線，在曲線上 隆起部分稱色譜峰。6 .峰面積：色譜峰與基線之間構成的面積。二知識點:1 .分離原理：多種組分的混合樣品進入色譜儀的氣化室氣化后呈氣態(tài)，由于樣品中各組分性質不同，在色譜柱中兩項間的分配系數(shù)和吸附系數(shù)不同，在載氣帶動下各組分在柱 子中運行速度也不同，根據(jù)出峰位置，確定組分的名稱，根據(jù)峰面積確