病原菌與環(huán)境中重要微生物的功能基因分析

1、12. 病原菌與環(huán)境中重要微生物的功能基因組分析Dorothea K Thompson Jizhong Zhou魏華譯；劉妍初校；朱晨光復(fù)校12.1 介紹 病原菌的致病機(jī)理，特別是動(dòng)物宿主與引起它們患病的病原菌之間相互作用的分子基礎(chǔ)與分子調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的，并且涉及多個(gè)毒力因子的共同控制。生理特性與毒力特性的廣譜性是多種基因功能表達(dá)緊密協(xié)調(diào)的一種反映。通常，病原菌的感染循環(huán)始于黏附并定植于宿主，然后（有時(shí)）細(xì)菌侵襲宿主組織或細(xì)胞，存在于宿主細(xì)胞中并在宿主細(xì)胞中繁殖，最后釋放出來再感染新的宿主（參見Finlay與 Falkow1997年發(fā)表的一篇綜述）。微生物感染被復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控，包括種特異

2、性的細(xì)胞與細(xì)胞之間的交流。20世紀(jì)90年代中期, 流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)全基因組序列的發(fā)表（Fleischmann 等人發(fā)表于1995年）標(biāo)志著基因組時(shí)代的來臨，研究全基因組范圍內(nèi)細(xì)菌毒力特征的分子特性的方案使科學(xué)家對(duì)細(xì)菌致病機(jī)理的研究方式發(fā)生改變。目前，已經(jīng)有至少25個(gè)親源關(guān)系很遠(yuǎn)的病原菌全基因組序列得到解析，并且，其它一些病原微生物的全基因組序列的測(cè)定工作也正在進(jìn)行中（見第二章）。我們已經(jīng)知道了一些病原菌如幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）(Tomb等人，1997；Alm等人，1999)，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tu

3、berculosis）(Cole等人，1998)，生殖道支原體(Mycoplasmagenitalium)(Fraser等人， 1995)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) (Stover等人，2000)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(Hoskin等人，2001)，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)(Heidelberg等人，2000)，單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes) (Glaser等人，2001)的全基因組序列信息，最近炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)(Read等

4、人，2003)的全基因組序列也被測(cè)出。大量的環(huán)境中重要的真菌與古菌，包括金屬離子還原菌Shewanella oneidensis（Heidekberg, 2002），耐放射異常球菌Deinococcus radiodurans (White等人，1996b)，耐高溫多型古菌 Pyroccus furiosus(Robb等人，2001)的全基因組序列也已經(jīng)被測(cè)定（見第二章）。一個(gè)微生物全基因組的生物信息學(xué)分析可用來尋找與感染相關(guān)的基因，以及潛在的抗生素藥物作用的新靶點(diǎn)。比較分析多個(gè)種系相差很大的病原微生物和種系相近的病原微生物，可以揭示天然群落中細(xì)菌基因的易變性，種屬多樣性的分子機(jī)制，以及細(xì)菌致

5、病機(jī)理的進(jìn)化與引起不同發(fā)病情況的菌株特異性的基礎(chǔ)。由于大量的古菌已被測(cè)序，比較基因組可以揭示古菌（特別是crenarchaeal和euryarchaeal分支）、細(xì)菌、真菌之間的差異。另外，象DNA微陣列這類功能基因組工具對(duì)我們理解微生物感染后導(dǎo)致宿主臨床病變的一些宿主的基因表達(dá)起了非常重要的作用。最早應(yīng)用微陣列技術(shù)對(duì)環(huán)境中重要微生物功能基因的研究主要針對(duì)少量的幾個(gè)使微生物能在惡劣環(huán)境中生存的特定基因，如這些基因的功能、調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、基本的表型以及特異的酶系統(tǒng)等。最終，蛋白組學(xué)將加深我們對(duì)基因功能的了解，為預(yù)測(cè)毒力因子和未知基因以及了解病原微生物的轉(zhuǎn)錄后與翻譯后調(diào)節(jié)作用提供新的視角。本章將討論基因

6、組序列與生物信息學(xué)分析在鑒定毒力因子中的作用、比較基因組在病原微生物的基因多樣性與進(jìn)化中的作用、基于遺傳和微陣列的技術(shù)在闡述基因功能、宿主與病原菌相互作用及細(xì)菌發(fā)病機(jī)理的蛋白組學(xué)。大量的病原菌序列已被測(cè)序，還有一些序列目前正在測(cè)定，每一個(gè)病原微生物序列的復(fù)雜信息就不在這章討論了。我們將在本章通過介紹我們選擇的研究文獻(xiàn)，討論功能基因組與比較基因組對(duì)微生物致病性的理解。最后，我們將討論基因組數(shù)據(jù)怎樣有利于我們對(duì)微生物與環(huán)境相關(guān)表型（如金屬還原細(xì)菌的生物修復(fù)）的理解，并為研究極端環(huán)境（高溫、高pH、高鹽）中微生物生存的分子機(jī)制與特征提供便利。12.2通過基因組序列與功能注釋研究細(xì)菌的致病機(jī)理 病原菌

7、可以感染動(dòng)物與植物細(xì)胞，逃避宿主免疫防御與抵御抗生素制劑，在不同的細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中存活。由于細(xì)菌有如此多樣的致病機(jī)制，就需要一個(gè)可根據(jù)細(xì)菌的數(shù)目與種類而變化的緊密調(diào)節(jié)的毒力因子庫。盡管很多毒力因子是宿主特異性的，但還是有少量機(jī)制是多種細(xì)菌共同表達(dá)一些廣譜的毒力表型（參見Finlay與 Falkow1997年發(fā)表的一篇綜述）。這些共同機(jī)制表明至少一些病原菌的基本毒力機(jī)制是擁有不同微生物種類中存在保守性的古代進(jìn)化起源（Rahme等人，2000）。 傳統(tǒng)方法對(duì)病原菌的研究是耗時(shí)的，線性的，且只針對(duì)一個(gè)基因或一個(gè)蛋白的研究?；蛐蛄蟹治雠c高通量的工具如DNA微陣列的應(yīng)用（見第6章）使得對(duì)微生物感染

8、相關(guān)的多個(gè)基因和蛋白可同時(shí)平行鑒定并進(jìn)行功能分析。病原菌的全基因組序列可被用于很多領(lǐng)域，從鑒定新的毒力相關(guān)基因與致病島，到設(shè)計(jì)新的抗微生物制劑（見13章）。在本章，將討論用生物信息學(xué)技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)尋找多種毒力基因的侯選基因、可重復(fù)的DNA元件以及水平獲得的如致病島之類DNA序列。12.2.1 從序列同源性預(yù)測(cè)毒力基因 對(duì)一個(gè)微生物全基因組序列的認(rèn)識(shí)，使我們可以在公共數(shù)據(jù)庫中基于已知的毒力因子來預(yù)測(cè)毒力基因。但要注意，并不是在所有情況中序列相似的基因都具有相似的功能。在鑒定一個(gè)假定的毒力基因的時(shí)候，對(duì)假定的毒力基因是否具有與已知的同源毒力基因相同的功能，經(jīng)驗(yàn)性的決定是必不可少的。用大量的基

9、因組數(shù)據(jù)來鑒定假定的毒力基因存在著限制，因?yàn)樯镄畔⒓夹g(shù)只能識(shí)別功能已被闡述清楚的候選基因。對(duì)細(xì)菌基因組序列的比較分析提示很大部分（通常30-40%）預(yù)測(cè)的基因?yàn)槲粗δ芑蛑荒芗俣ㄆ涔δ艿幕??；谛蛄行畔⒈旧?，很難簡(jiǎn)單預(yù)測(cè)毒力基因的新功能或未鑒定的基序(Weinstock，2000)。為了鑒定可能的毒力相關(guān)基因，有必要在數(shù)據(jù)庫中尋找更具普遍特征的蛋白序列如與跨膜或分泌蛋白相關(guān)的那些序列，因?yàn)榕c宿主致病相關(guān)的毒力因子常定位于細(xì)胞表面或用于胞外運(yùn)輸（Weinstock，2000）。如腦膜炎奈瑟氏菌（N. meingitidis）的一個(gè)毒力血清B株（MC58）的全基因組序列被用于尋找潛在的可開發(fā)成

10、基因疫苗的新毒力基因（Pizza等人，2000）。腦膜炎奈瑟氏菌基因組的開放閱讀框（ORF）已被用于序列分析、結(jié)構(gòu)基序分析和其他典型的與表面或輸出相關(guān)的蛋白特征分析，這些蛋白包括跨膜結(jié)構(gòu)域、導(dǎo)肽、已知的表面蛋白同源體、脂蛋白信號(hào)、外膜蛋白錨定基序與宿主細(xì)胞結(jié)合域。最終，基于基因組序列的全基因表達(dá)譜可用于尋找與已知的毒力基因共同調(diào)節(jié)表達(dá)的新毒力基因。 目前可以用快速且容易理解的方式，從一個(gè)生物體的全基因組序列中獲得新的生物信息(Hood等人，1996a，b ；Pizza等人，2000)。如流感嗜血桿菌Rd基因組的1.8Mb序列已很好的用于尋找負(fù)責(zé)生物合成脂多糖（LPS）的假定毒力基因與結(jié)構(gòu)成分（

11、Hood等人，1996b）。除了是主要的毒力決定因子外，LPS在維持革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜完整性和其功能上也具有重要作用（Strauss Falkow 1997）。通過在流感嗜血桿菌的基因序列數(shù)據(jù)庫中搜尋與已知的其它細(xì)菌生物合成LPS的基因相似的DNA與氨基酸序列，得到25個(gè)LPS基因的候選基因。序列信息保證了可以進(jìn)行設(shè)計(jì)合并構(gòu)建這25個(gè)基因上產(chǎn)生靶向中斷所必需的克隆。免疫化學(xué)技術(shù)、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離技術(shù)和質(zhì)譜分析（MS）為在大量的候選基因中確定潛在的LPS生物合成基因和估計(jì)幼鼠的血管內(nèi)散播所必須的LPS最小結(jié)構(gòu)提供了可能（Hood等人，1996b）。這樣的研究具體說明了計(jì)算機(jī)技

12、術(shù)可以怎樣應(yīng)用于尋找編碼假定的毒力基因序列以及如何應(yīng)用這樣的數(shù)據(jù)來加快鑒定實(shí)驗(yàn)假設(shè)的任務(wù)。12.2.2 重復(fù)的DNA元件提示潛在的毒力因子根據(jù)序列的同源性，重復(fù)的DNA序列提示可能為毒力基因。在許多致病菌中，如流感嗜血桿菌、奈瑟氏菌的某些種、金黃色葡萄球菌（見表12.1）的重復(fù)DNA序列都與毒力因子的表型或相變相關(guān)。許多編碼細(xì)胞表面毒力因子基因的一個(gè)特征是在翻譯讀碼框的5末端存在單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)或三核苷酸重復(fù)。一些假說比如滑動(dòng)鏈的錯(cuò)配學(xué)說（Levinson 與Gutman等人，1987）或基因重組機(jī)制(Van Belkum等人，1998)可解釋重復(fù)核苷酸序列的改變，而重復(fù)核苷酸序列的

13、改變又通過改變讀碼框基因從而調(diào)節(jié)表面暴露蛋白的表型?；瑒?dòng)鏈的錯(cuò)配學(xué)說認(rèn)為通常高重復(fù)DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致重復(fù)序列附近DNA序列的錯(cuò)配。根據(jù)鏈的方向與DNA聚合酶介導(dǎo)的DNA合成，DNA 重復(fù)可被插入或缺失，引起開放閱讀框的移框現(xiàn)象（Coggins O Prey，1989；Van Belkum等人，1998）。毒力相關(guān)因子的表型變化是病原微生物逃避宿主免疫應(yīng)答，適應(yīng)宿主中不同微環(huán)境的一個(gè)策略（參見Finlay與 Falkow1997年發(fā)表的一篇綜述）。例如流感嗜血桿菌的菌毛一種細(xì)菌黏附到呼吸道上皮細(xì)胞的所必須的黏附蛋白，這種蛋白的相變與二核苷酸TA的重復(fù)相關(guān)（Van A lphen等人，1991）

14、。與之類似，脂多糖生物合成基因讀碼框的5末端包含多個(gè)串聯(lián)CAAT或GCAA重復(fù)序列，與翻譯的轉(zhuǎn)換相關(guān)（Jarosik 與Hansen，1994；Weiser等人，1989）。 由于重復(fù)DNA序列在細(xì)菌致病性中的重要作用，可以通過搜尋基因組中串聯(lián)寡核苷酸重復(fù)序列來鑒定可能的新毒力因子。Hood與coworkers采用這樣的方法在流感嗜血桿菌的Rd株的假定ORF中找到9個(gè)新的包含多個(gè)（6-36）串聯(lián)的四核苷酸重復(fù)（Hood等人，1996a）。這些基因編碼瑟氏菌的血色素受體蛋白或糖基轉(zhuǎn)移酶（lgtC基因產(chǎn)物）的同源體，或編碼耶爾森氏菌的一個(gè)黏附蛋白（yadA）。另外，三個(gè)目前已鑒定與LPS生物合成相

15、關(guān)的基因也包含多個(gè)重復(fù)的CAAT，證明可用全基因組序列來尋找毒力因子。進(jìn)一步研究其中的一個(gè)新位點(diǎn)lgtC，表明表12.1 病原菌中的短DNA重復(fù)序列與其相關(guān)功能種重復(fù)序列基因基因的功能參考文獻(xiàn)流感嗜血桿菌CAATLic1-lic3LPS生物合成Hood 等人(1996a)GCAAYadA黏附素Hood 等人(1996a)GACALgtC糖基轉(zhuǎn)移酶Hood 等人(1996a)TTGGNda離子結(jié)合蛋白Hood 等人(1996a)AGTCND限制性修飾 甲基轉(zhuǎn)移酶Hood 等人(1996a)TTTAND未知的桿菌類似物Hood 等人(1996a)TAHifA/B菌毛合成Van Ham等人(1993

16、,1994)腦膜炎奈瑟球菌GIsi2LPS生物合成Burch等人(1997)CTCTTOpa不透明表面蛋白Meyer等人(1990)AOpa不透明表面蛋白Meyer等人(1990)GPorA外膜蛋白Van der Ende 等人(1995)金黃色葡萄球菌93bpFnb*結(jié)合蛋白Patti等人 (1994)561bpCan膠原質(zhì)黏附素Patti等人 (1994)81bpCoa凝固酵素Goh 等人(1992)GAAGAX4AAXAAXCCTXGXAAASpa蛋白AClewell(1993)GAXTCXGAXTCXGAXAGXClf凝集因子，纖維蛋白受體McDevitt與 Foster(1995)a

17、ND，無詳細(xì)說明這個(gè)基因與脂多糖表位的表型轉(zhuǎn)換有關(guān)，并且其在新生鼠模型中與流感嗜血桿菌的全毒力相關(guān)。這個(gè)研究清楚說明了如何用全基因組序列信息獲得生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并用于病原菌生物學(xué)研究（Hood等人，1996a）。12.2.3病原菌的進(jìn)化：基因的獲得與丟失全基因組序列的獲得與它們的序列比較為研究基因轉(zhuǎn)移在病原菌進(jìn)化中的作用提供方法（Ochman與 Moran，2001）?；虻乃睫D(zhuǎn)移通過從染色體上引入或刪除DNA重構(gòu)基因來改變基因指令?；颢@得與缺失的機(jī)制（如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合）在第四章有詳細(xì)的介紹。點(diǎn)突變的積累可以通過調(diào)節(jié)毒力表型與改變已有基因的表達(dá)來增加微生物的多樣性，然而逐步的突變則很

18、少形成新的功能或使細(xì)菌適應(yīng)新的環(huán)境(Lawrence，1997; Lawrence 與Ochman，1998)。相反，基因橫向轉(zhuǎn)移，也就是可移動(dòng)的遺傳因子在細(xì)菌中傳遞，將導(dǎo)致遺傳信息的獲得或丟失，這對(duì)尤其是在新的病原體出現(xiàn)的緊急情況下的基因組進(jìn)化與細(xì)菌物種形成起著重要作用(Ochman等人，2000；Ochman 與Moran，2001)。 基因水平或橫向轉(zhuǎn)移的發(fā)生率可以用DNA序列分析的方法研究。根據(jù)堿基比對(duì)，大部分細(xì)菌的種的基因序列（G+C含量），密碼子使用的偏好，二核苷酸與三核苷酸的頻率是相對(duì)同源的(Muto與 Osawa，1987；Karlin等人，1998)。新的序列，象通過基因的橫

19、向轉(zhuǎn)移獲得的外源基因致病島（下面討論），保持其供體基因的序列特征，因此可以從G+C含量與密碼子使用的模式上把它們和親代的垂直傳播區(qū)分開來(Ochman等人， 2000)?；驒M向轉(zhuǎn)移范圍的確定目前通過全基因組序列比對(duì)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。在已測(cè)序的細(xì)菌基因組中，橫向獲得的外源DNA的積累量各有差異：如12.8%的大腸桿菌K12基因組，3.3% 結(jié)核分枝桿菌基因組，4.5%流感嗜血桿菌基因組，6.2%幽門螺桿菌26695的基因組來自橫向獲得的外源DNA(Ochman等人，2000)?；蚪MDNA的水平轉(zhuǎn)移（流動(dòng)性）、基因多樣性的意義以及病原菌的進(jìn)化將在下面討論。致病島 編碼毒素、黏附因子（介導(dǎo)黏附到宿主細(xì)胞

20、表面的蛋白）、分泌系統(tǒng)的成分、干擾血清抗性的蛋白與其它因子的基因和毒力基因一起決定發(fā)病的條件。這種疾病的決定基因可以存在于可轉(zhuǎn)移的基因元件上（轉(zhuǎn)座子，質(zhì)粒，細(xì)菌噬菌體），或者存在于細(xì)菌染色體中的一些不連續(xù)的稱為致病島（PAIs）的片段中(Hacker等人1997年的一篇綜述；Hacker 與Kaper，2000；Grousman與 Ochman，1996)。測(cè)序分析PAIs表明，這些致病島大部分源于基因的水平轉(zhuǎn)移，因此可能在形成新的致病突變種或致病表型中起重要作用（Hacker與 Kaper，2000）。然而這種可以改變細(xì)菌天然種的橫向基因轉(zhuǎn)移并不是不加選擇的。換句話說，那些特定的細(xì)菌在獲得致

21、病島之前已經(jīng)具有形成病原菌的一些條件：因?yàn)樗鼈円呀?jīng)擁有在宿主細(xì)胞中生存的能力，如抵御宿主防御的能力與營(yíng)養(yǎng)缺陷的代謝補(bǔ)償能力(Ochman 與Moran，2001)。PAIs區(qū)別于其他基因組序列的特征，微生物的PAIs以及PAIs的調(diào)節(jié)將在本節(jié)討論。從全基因組序列中區(qū)分出PAIs 在基因組測(cè)序中最常見的主題是G+C含量與密碼子的使用是否同源（Hacker 與Kaper，2000，Karlin，2001）。如果一個(gè)基因的密碼子使用與基因組中其它序列基因的密碼子使用有明顯差異，這個(gè)基因可能來自水平轉(zhuǎn)移（Finlay與 Falkow，1997；Hacker與Kaper，2000；Ochman等人，20

22、00），將其歸為假定的外源基因（pA）（Karlin，2000）。細(xì)菌中假定的外源基因與反常的基因簇（有時(shí)指基因島）和致病島相關(guān)。在測(cè)序中可以通過5個(gè)分析MNA序列的準(zhǔn)則來發(fā)現(xiàn)已測(cè)序基因組中反常的基因區(qū)（Karlin，2000）。(i) G+C含量的差異 標(biāo)準(zhǔn)的辨別象致病島這樣的異?；騾^(qū)的評(píng)估方法是在變化窗口W（W在長(zhǎng)度上相當(dāng)于10，20，或者直到50kb）中與平均基因組的G+C含量進(jìn)行比較。比較發(fā)現(xiàn)G+C含量與基因組剩余序列中G+C含量有很大差異的窗口可能是潛在的基因島。(ii) 基因組標(biāo)簽的比較 每一個(gè)基因組都有一個(gè)區(qū)分于其它細(xì)菌基因組的標(biāo)簽（signature）（Campbell 等人

23、，1999 ；Karlin，1998； Karlin等人，1997）。一個(gè)基因組標(biāo)簽是一套二核苷酸的相對(duì)豐度值，二核苷酸的相對(duì)豐度值是所觀察的二核苷酸頻率與隨機(jī)選擇的相鄰序列中預(yù)期二核苷酸頻率的比值（Campbell 等人，1999）。與基因組平均標(biāo)簽的差異或二核苷酸的偏好都提示DNA的外源性。(iii) 密碼子的偏好 統(tǒng)計(jì)所有基因的密碼子偏好并與基因組中平均基因進(jìn)行比較，與經(jīng)典密碼子的應(yīng)用存在明顯差異的一個(gè)基因或一組基因可能代表一個(gè)PAI。(iv) 氨基酸應(yīng)用的分歧 比較組成蛋白的氨基酸偏好性與決定蛋白組的平均氨基酸頻率。在翻譯閱讀框中，氨基酸的使用與平均蛋白氨基酸的使用存在明顯差異的區(qū)域可

24、能組成基因島或PAI。密碼子的偏好與氨基酸的偏好都是基因組組成的測(cè)定方法。(v) 假定外源基因簇 如果一些基因與平均基因、核糖體蛋白基因、翻譯與轉(zhuǎn)錄過程中加工因子的基因和伴侶基因的密碼子利用率差異很大，那么這些基因都被標(biāo)記為假定的外源基因。這些假定的外源基因可能代表包含致病島的毒力相關(guān)基因。PAIs已經(jīng)在尿路與腸道分離出的大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，幽門螺桿菌，和特定的革蘭氏陽性細(xì)菌中（見表12.2，Hacker等人，1997）被鑒定出來，另外多個(gè)致病島也可以在同一株細(xì)菌中存在(Mecsas 與Strauss，1996)。因?yàn)镻AIs不斷的在多組病原菌中發(fā)現(xiàn)，特別是作為微生物基因組序列的一部分，

25、它們的共有特征已被發(fā)現(xiàn)，這使得PAIs可以根據(jù)一系列標(biāo)準(zhǔn)被定義（Hacker 與Kaper，2000；Hacker等人，1997）。(1) PAIs 毒力相關(guān)基因，象黏附因子，毒素，III型分泌系統(tǒng)等。（2）PAIs廣泛分布于病原微生物的基因組中，而在無侵襲能力的相同菌株或密切相關(guān)的共生菌株的基因組中不存在。（3）PAIs在微生物基因組中占有相對(duì)較大的區(qū)域，在長(zhǎng)度上>10-200kb，它們的G+C含量與密碼子的利用明顯區(qū)別于核心基因組。（4）PAIs常被短的重復(fù)序列（9-135bp）與插入元件包圍。這種特異的邊界序列與整合酶編碼序列以及其它移動(dòng)位點(diǎn)的存在，提示PAIs是由重組介入到染色體

26、中的（Hacker與Kaper，2000；Mecsas與 Strauss， 1996）。直接重復(fù)與IS可能是重組酶的靶點(diǎn)，導(dǎo)致一些PAIs的遺傳不穩(wěn)定（Hacker等人，1997）。(5) PAIs經(jīng)常與轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）基因相關(guān)，tRNA可能是整合外源DNA的“基因組路標(biāo)”（Hacker等人，1997）PAIs對(duì)毒力表型的貢獻(xiàn) 這部分是通過著眼于具有重要致病性的革蘭氏陰性桿菌，來闡述PAI相關(guān)毒力決定因子的多樣性。腸桿菌家族的成員是腸道與尿路感染的病原菌。腸道與尿路大腸桿菌的染色體PAIs是第一個(gè)被闡述與深入研究的毒力決定區(qū)域（Hacker等人，1983，1997；Blum等人，1994

27、；Swenson等人，1996）。舉個(gè)例子，尿路大腸桿菌536（UPEC）包含兩個(gè)致病島，PAI I 與PAI II，它們?cè)诖笮∩戏謩e有70和190kb，并且被直接重復(fù)序列包圍（Blum等人，1994；Ritter等人，1995）。PAI I 編碼一種毒素 溶血素(hly)，通過插入細(xì)胞膜裂解紅細(xì)胞與其它真核細(xì)胞。PAI II攜帶與prf決定因子相關(guān)的hly毒力基因，prf決定因子編碼P相關(guān)菌毛，P相關(guān)菌毛是尿路大腸桿菌重要的黏附因子（Hacker與Kaper，2000）。PAI II編碼P菌毛，使尿路表12.2 致病島例子細(xì)菌PAI 名稱大?。╧b）G+C含量a相關(guān)t RNA功能Uropat

28、hogenic E.coli(536)PAI PAI 70 19051/4151/41selCleuX溶血素產(chǎn)物及P相關(guān)菌毛溶血素產(chǎn)物及P相關(guān)菌毛Uropathogenic E.coli(J96)PAI PAI 17011051/4151/41pheVpheR溶血素產(chǎn)物溶血素產(chǎn)物Enteropathogenic E.coli (E2348/69)LEEb3551/39selC黏附、抹殺、侵入（翻譯 型分泌系統(tǒng)）Salmonella typhimuriumSPISPI-2SPI-3SPI-44040172552/40-4752/40-47-valVselCputative tRNA侵入非噬菌細(xì)胞

29、 （翻譯 型分泌系統(tǒng)）宿主內(nèi)細(xì)菌存活（翻譯 型分泌系統(tǒng)）侵入并在單細(xì)胞內(nèi)存活侵入并在單細(xì)胞內(nèi)存活Helicobacter pylorCag PAI4038-45/35glrc 編碼完全毒力必需的CagAd和VacA調(diào)節(jié)因子Vibrio choleraeVPI39.547-49/35ssrA含TCP-ACFe因子和toxFf基因，調(diào)節(jié)霍亂毒素Yersinia pestisHPI(pgm locus)10246-50/46-50asnT鐵的獲取，氯化高鐵血紅素吸收、Yersiniabactin合成Clostridium difficile19.6毒素A和BListeria monocytogene

30、sprf vir Gene cluster10prf vir Gene cluster a細(xì)菌的宿主的G+C(%)含量/ PAI的G+C(%)含量bLEE腸細(xì)胞抹除的基因位點(diǎn)cglr谷氨酸消旋酶dCagA細(xì)胞毒素相關(guān)的抗原eTCP毒素相關(guān)的菌毛，ACF附加定殖因子toxT=轉(zhuǎn)錄激活體基因大腸桿菌通過半乳糖-半乳糖1，4特異性受體分子黏附到尿道上皮。兩個(gè)UPEC-特異性PAI都與tRNA基因有關(guān)，PAI I定位在selC tRNA基因上，PAI II整合到一個(gè)小的亮氨酸leuX的tRNA上。與之相似，腸道致病大腸桿菌（EPEC）在染色體selC位置有35kb的致病島（McDaniel等人，199

31、5），但是與UPEC-特異性的PAI不同，EPEC 特異性致病島編碼高特異性的型分泌系統(tǒng)，輸出可黏附腸上皮并可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞損傷（Jarvis等人，1995）的重要蛋白，因此導(dǎo)致不同的疾病條件。與鞭毛進(jìn)化相關(guān)，革蘭氏陰性桿菌的型分泌系統(tǒng)是高保守性的，并且是唯一的適應(yīng)性的毒力機(jī)制。型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)成分是保守的，但是運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞功能的效應(yīng)蛋白對(duì)于每一個(gè)細(xì)菌菌株是唯一的。組成型分泌機(jī)制的蛋白也在耶爾森氏菌，志賀氏菌，沙門氏菌與許多植物病原菌的PAIs中編碼（Hacker與Kaper，2000 ，綜述）。另一個(gè)符合先前描述的PAIs的定義的致病島，最近在霍亂弧菌中被發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌是引起

32、被稱為霍亂的一種腹瀉的條件致病菌。然而有害的水生霍亂弧菌與毒力霍亂弧菌的染色體致病島只在流行病學(xué)中被鑒定?；魜y弧菌致病島（VPI），其標(biāo)志為與平均基因組G+C含量（47-49%）比，含低G+C含量（35%），在染色體上基因比較穩(wěn)定，占39.5kb區(qū)域。序列分析表明，VPI 包含TCP-ACF簇與toxT基因，toxT具有調(diào)節(jié)霍亂毒素功能（Karaolis等人，1998）。由tcpA-tcpF基因編碼的TCP或毒素共調(diào)節(jié)菌毛，是典型的型菌毛，在定植腸道上皮細(xì)胞中起重要作用（Cotte與DiRita，2000；Herrington等人，1998）并且通過ToxR調(diào)節(jié)系統(tǒng)，與絲狀噬菌體（CTX）編碼

33、的霍亂毒素共同被調(diào)節(jié)（DiRita，1992；DiRita等人，1991；Taylor等人，1987）?；魜y弧菌致病島編碼的一個(gè)二級(jí)基因簇ACF是附加定植因子。TnphoeA在acf基因的插入產(chǎn)生霍亂弧菌的突變，在鼠模型中顯示出定植能力降低(Peterson 與Mekalanos，1988)。除了對(duì)霍亂發(fā)病機(jī)理有直接作用的基因外，VPI還帶有假定的整合酶與轉(zhuǎn)座酶基因，它們?cè)赩PI的轉(zhuǎn)移與遷徙中起著重要作用（Karaolis等人，1998）。因此可以用致病島來發(fā)現(xiàn)新的流行霍亂菌株。幽門螺桿菌，微耗氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，是人類急慢性胃炎與胃潰瘍的條件致病菌。根據(jù)引起嚴(yán)重的疾?。ㄐ停┗蛳魅醯亩玖Γㄐ停?/p>

34、、存在或缺失cagA (細(xì)胞毒素相關(guān)基因A)， 幽門螺桿菌已被廣泛分類（Censini等人，1996；Xiang等人，1995）。與型菌株比較，只有與嚴(yán)重的胃與十二指腸疾病相關(guān)的幽門螺桿菌（型）表達(dá)cagA編碼的免疫優(yōu)勢(shì)抗原（Xiang等人，1995）。型幽門螺桿菌與人的胃上皮的相互作用是很復(fù)雜的，會(huì)導(dǎo)致黏附位點(diǎn)的微絨毛丟失、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞漿間白細(xì)胞介素Il-8的產(chǎn)生(Segal等人，1996，1997)。毒力增加的幽門螺桿菌菌株含有一個(gè)40kb的外源DNA區(qū)，在這段區(qū)域內(nèi)含有cagA基因與編碼其它疾病相關(guān)毒力因子的基因。分析包含cagA基因的基因位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這是一個(gè)被31bp直接重復(fù)序列包

35、圍的致病島，但不是插入到tRNA基因（Censini等人，1996；Hacker等人，1997，綜述）而是插入到谷氨酸消旋酶（glr）基因中。應(yīng)用上述檢測(cè)PAIs的方法，cag PAI顯示出與基因組其它區(qū)域（38-45%）比，低G+C含量（35%）與高密碼子偏好性(Karlin，2001) 等特征。cag PAI編碼的蛋白顯示出與特異分泌系統(tǒng)相似的成分，如輸出毒力因子的型分泌系統(tǒng)（Censini等人，1996）。幽門螺桿菌的cag區(qū)域解釋了類型特異性毒力因子如何通過致病島的染色體插入而獲得，并且導(dǎo)致一個(gè)種內(nèi)細(xì)菌含有多種毒力類型的不同菌株（Censini等人，1996）?？股乜剐缘墨@得 現(xiàn)在開

36、發(fā)新的疫苗與感染性疾病的干擾治療比從前變得更為重要，因?yàn)榫哂锌股乜剐缘闹匾祟愔虏【木暝谠龆?，這些菌株包括肺炎球菌，腸球菌，葡萄球菌，結(jié)核桿菌(Fuci，2001；Fraser等人，2000 )?；蜣D(zhuǎn)移的一個(gè)共識(shí)是抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移到原本敏感的細(xì)菌中，因此，擴(kuò)展了微生物的生態(tài)環(huán)境并給微生物提供了一個(gè)生存優(yōu)勢(shì)。由于抗微生物的抗性選擇優(yōu)勢(shì)，基因轉(zhuǎn)移通常與高度移動(dòng)的基因元件相關(guān)，通常是質(zhì)粒，質(zhì)?？梢栽诜N間轉(zhuǎn)移并且能保持其外源性而不會(huì)被打斷。微生物基因組間的抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)移也可通過轉(zhuǎn)座（例如象抗性決定因子的周圍序列之類的可移動(dòng)的元件）而被調(diào)節(jié)。有時(shí)，抗生素抗性基因由整合子傳遞，整合子是驅(qū)動(dòng)

37、無啟動(dòng)子的組合基因轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)元件。整合子有三個(gè)序列元件：（1）平行獲得的序列整合所需的附著位點(diǎn)（2）編碼位點(diǎn)特異性重組酶的基因（3）控制組合基因表達(dá)的啟動(dòng)子（Hall，1997；Rose-Magnus與Mazel，1999）。整合子的移動(dòng)需要插入序列，轉(zhuǎn)座子或接合質(zhì)粒。最近，基因組微陣列技術(shù)（第六章討論），為抗二甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌的發(fā)病機(jī)理及進(jìn)化提供視角。金黃色葡萄球菌可引起敗血癥，心內(nèi)膜炎，人類毒素休克綜合癥（Fitzgerald等人，2001）。一個(gè)包含大于90%金黃色葡萄球菌株COL基因的DNA微陣列可用于調(diào)查基因多樣性與基因進(jìn)化。36個(gè)金黃色葡萄球菌臨床菌株，包含11個(gè)從

38、不同人類疾病類型和其他哺乳動(dòng)物感染中分離來的二甲氧苯青霉素抗性株，被用于該研究。研究結(jié)果提示幾個(gè)克隆的廣譜的基因變化可以代表大部分金黃色葡萄球菌感染（Fitzgerald等人，2001）。不同金黃色葡萄球菌基因組進(jìn)行比較，不同株之間差異大約有22%，因此組成株特異性序列，有些編碼特異的宿主定植因子以及使得菌株在特定環(huán)境中生存的其它因子。DNA微陣列也被用于揭示基因轉(zhuǎn)移在致病金黃色葡萄球菌進(jìn)化中的重要作用（Fitzgerald等人，2001）。比如在抗二甲氧苯青霉素的抗性中，mec基因水平轉(zhuǎn)移到金黃色葡萄球菌中至少五次，這提示二甲氧苯青霉素抗性是進(jìn)化多樣性的，不依賴次數(shù)和單個(gè)的祖先系。病原體進(jìn)化

39、過程中的遺傳信息丟失 比較致病菌與相關(guān)的非致病菌基因組后，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的毒力多數(shù)是獲得非致病菌沒有的基因后表現(xiàn)出來的（Ochman 與Moran，2001）。比如通過被轉(zhuǎn)入單個(gè)的致病島，非致病性大腸桿菌可以轉(zhuǎn)變成毒力菌株 (Groisman與Ochman，1996；Hacker等人，1997)。然而比較基因序列分析表明，致病菌株的致病機(jī)理不單由獲得毒力基因造成，而且在某些情況下是缺失了使毒力基因不表達(dá)的基因。比如，編碼OmpT蛋白的基因是一個(gè)表面蛋白酶，也是一個(gè)毒力抑制因子，在志賀氏菌中不存在，而在和它有緊密聯(lián)系的非致病大腸桿菌中卻含有。把OmpT基因轉(zhuǎn)入志賀氏菌后，通過阻止細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)傳播的能力

40、，使細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白毒力下降 (Nakata等人，1993) 。與之類似，比較弗氏志賀氏菌與大腸桿菌K-12的基因組提示在志賀氏菌的cadA基因中存在很大區(qū)域的缺失，被稱為黑洞(Maurelli等人，1998)。功能性的cadA基因編碼賴氨酸脫羧酶，在志賀氏菌的某些種中起抑制腸毒素，減弱毒性的作用?；蛉笔嵌拘曰蛩睫D(zhuǎn)移的補(bǔ)充，使得細(xì)菌發(fā)展成病原菌（Maurelli等人，1998）。12.3 比較基因組學(xué)：研究細(xì)菌致病性的線索基于生理、病理、細(xì)菌物種的進(jìn)化的差別，比較分析微生物基因序列為開發(fā)大量的基因突變與基因可塑性提供前所未有的機(jī)會(huì)。本節(jié)闡述微生物總基因組，從細(xì)菌到古細(xì)菌到真核生物，全面評(píng)

41、估基因水平轉(zhuǎn)移對(duì)細(xì)菌物種形成的影響。1995年流感嗜血桿菌Rd基因組測(cè)序的完成首次闡述了一個(gè)可自主生存的微生物的基因組(Fleischmann等人，1995)，并且開啟了微生物基因組學(xué)的時(shí)代。研究重點(diǎn)已經(jīng)從研究單個(gè)基因轉(zhuǎn)移到基因組研究以及多個(gè)單基因是怎樣在一起相互作用產(chǎn)生復(fù)雜表型。在流感嗜血桿菌基因組序列公布之后很短時(shí)間內(nèi)公布了完整基因組的序列報(bào)告之后，比較基因組的道路被鋪平（Fraser等人，1995；Razin等人，1998）。幽門螺桿菌的基因組（Alm等人，1999）測(cè)序代表了比較基因組的里程碑。因?yàn)樗故玖艘粋€(gè)致病菌不同菌株之間的差異。（Field等人，1999）由于越來越多的基因信息

42、已經(jīng)從分類多樣性與相互關(guān)聯(lián)都很大的物種中獲得，比較基因組學(xué)在研究基因內(nèi)容、基因組的組織和基因的獲得（細(xì)菌物種進(jìn)化）方面的影響是確實(shí)存在的，揭示了單個(gè)細(xì)菌的基本原理和唯一特征。比如，比較不同細(xì)菌的完整基因組為病原菌與共生菌的基本區(qū)別提供視角（Strauss與 Falkow，1997）。多個(gè)菌株的比較揭示疾病發(fā)生與疾病嚴(yán)重程度的遺傳基礎(chǔ)(Whittam與Bumbaugh，2002)。在本節(jié)我們將討論比較基因組對(duì)微生物致病性的分子基礎(chǔ)，包括鑒定影響感染的菌株特異性基因以及怎樣獲得這個(gè)基因。12.3.1 結(jié)核分枝桿菌的基因組：毒力基因的鑒定和基因組可塑性結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病一種不斷的在世界范圍內(nèi)嚴(yán)

43、重影響人類健康的慢性感染性疾病的病原菌。盡管對(duì)于革蘭氏陽性桿菌的研究已很深入，但我們對(duì)于致病性的分子基礎(chǔ)還知道的很少，特別是當(dāng)毒力并不是毒素蛋白產(chǎn)生的時(shí)候。大量宿主對(duì)分枝桿菌抗原反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和炎性反應(yīng)在很大程度上是由于感染所致（Brosch等人，2000）。近年來，抗藥的結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)迫切需要新的預(yù)防與治療策略。結(jié)核分枝桿菌的全基因組測(cè)序可用于比較并功能性研究這種人類重要的病原菌，加速對(duì)分枝桿菌的致病機(jī)理、進(jìn)化與表型差異的認(rèn)識(shí)。應(yīng)用微陣列技術(shù)與蛋白組學(xué)研究（將在下章討論）將為這種空氣傳播疾病提供新的可能更有效的預(yù)防與治療方法。特征清楚的結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的全基因組測(cè)序已

44、經(jīng)通過選擇性的大片段的插入與鳥槍法制備的全基因組小插入克隆庫（粘粒與細(xì)菌人工染色體文庫）的系統(tǒng)序列分析方法而獲得（Cole等人，1998）。結(jié)核分枝桿菌H37Rv 4.4Mb的環(huán)形染色體大約包含4000個(gè)蛋白編碼基因，展示出高G+C含量。有趣的是，高G+C含量存在于整個(gè)連續(xù)的H37Rv完整基因，提示基因組中沒有由多種堿基組成的通過水平轉(zhuǎn)移獲得的致病島（Cole等人，1998）?；蛐蛄械慕庾x提示預(yù)測(cè)蛋白的40%為功能蛋白，同時(shí)44%的蛋白編碼基因具相似的功能。功能描述不能解釋剩余16%的蛋白的功能，可能為編碼特異功能的基因。序列分析還提示結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中富含重復(fù)DNA序列，特別是

45、插入元件（IS）與持家基因。IS元件是小的DNA片段（<2.5kb），在IS編碼的轉(zhuǎn)座酶作用下通過轉(zhuǎn)座反應(yīng)將其插入到基因的多個(gè)位置(Mahillon與Chandler，1998)。H37Rv基因組包含56個(gè)與IS元件同源的位點(diǎn)，這些IS至少屬于9個(gè)不同的家族，其中有6個(gè)IS形成一個(gè)命名為IS1535的新家族(Gordon等人，1999)。這些IS大多數(shù)插入到基因間或基因組的非編碼區(qū)，在tRNA基因附近轉(zhuǎn)座的發(fā)生頻率很高。IS元件在毒力基因與耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移中具重要作用，此外IS介導(dǎo)的染色體的缺失與結(jié)核分枝桿菌基因組的可塑性有關(guān)(Brosch等人，1999；Gordon等人，1999)。

46、 將結(jié)核分枝桿菌與其它細(xì)菌區(qū)分開來的明顯標(biāo)志之一是其存在二個(gè)具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的氨基乙酸蛋白新家族(Cole等人，1998)。分析結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組序列發(fā)現(xiàn)了二個(gè)大的非相關(guān)的酸性氨基乙酸富集蛋白，它們的基因在基因組中成簇排列并且占總編碼序列的7% (Cole等人，1998；Cole等人，1999)。這些多基因家族因在其高度保守的N末端都存在Pro-Glu(PE)與Pro-Pro-Glu(PPE)基序故被命名為PE和PPE。PE和PPE蛋白的C末端在大小、序列與重復(fù)拷貝的數(shù)目上都有很大變化。PE蛋白的一個(gè)大的亞家族是一個(gè)多形態(tài)的重復(fù)序列家族（PGRS），這個(gè)家族以其在C末端有多個(gè)串聯(lián)重復(fù)的

47、Gly-Gly-Ala或Gly-Gly-Asn來定性。許多PPE蛋白中主要的多形串聯(lián)重復(fù)（MPRT）的C末端富含Asn-X-Gly-Asn-X-Gly序列。在結(jié)核分枝桿菌的基因組序列被弄清之前，這些蛋白家族并不為人們所知道。所以，PE與PPE蛋白的生物學(xué)功能也不清楚。然而，這些蛋白的重復(fù)與變化提示它們可能是分枝桿菌細(xì)胞抗原突變的原因并且可能是一種免疫相關(guān)抗原(Cole等人，199；Cole等人，1999)。在全基因組序列被完成之前，只有很少的結(jié)核分枝桿菌毒力因子在實(shí)驗(yàn)中被鑒定。這些毒力因子包括巨細(xì)胞集落因子(mce)，一個(gè)Sigma轉(zhuǎn)錄因子(sigA)，與辣根過氧化物酶(Arruda等人，19

48、93；Collins，1996；Collins等人，1995)。然而使結(jié)核桿菌在巨嗜細(xì)胞中存活并引起臨床癥狀的毒力因子還不知道。通過計(jì)算機(jī)（生物信息學(xué)的方法）或基因?qū)W方法如特征標(biāo)記的突變(Brosch等人，2000) 可以從基因組角度預(yù)測(cè)感染相關(guān)因子。數(shù)據(jù)庫的同源搜索已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與鼠傷寒沙門菌基因smpB同源的基因，這個(gè)基因與細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)存活有關(guān)(Baumler等人，1994)。與單核細(xì)胞增生性李斯特菌分泌因子p60的同源基因，以及與磷酸酶與酯酶形成有關(guān)的毒力侯選基因可能與降解細(xì)胞膜相關(guān)(Brosch等人，2000；Cole等人，1998)。結(jié)核分枝桿菌的基因組序列還提示基因組中存在與氧化保護(hù)相

49、關(guān)或可能抵抗硝化的黃血色素蛋白(hmp) (Hu等人，1999)。為了研究天然細(xì)菌群落中基因的可變性，基因微陣列技術(shù)已用于結(jié)核分枝桿菌的基因組比較。一個(gè)包含結(jié)核分枝桿菌H37Rv的3924個(gè)ORFs與738個(gè)基因間區(qū)域的Affymetrix聚核苷酸基因微陣列已用于檢測(cè)19個(gè)臨床分離鑒定的結(jié)核分枝桿菌(Kato-Maeda等人，2001)。與其它病原微生物相比，結(jié)核分枝桿菌存在相對(duì)低的基因改變，并且序列分析結(jié)核分枝桿菌的高保守區(qū)提示單核苷酸多態(tài)性與基因的水平改變和基因的可塑性關(guān)系很小。2001年Kato-Maeda及其同事研究表明，經(jīng)基因微陣列比較基因組方法檢測(cè)的16個(gè)結(jié)核分枝桿菌中，以參考菌H

50、37Rv的38個(gè)ORFs為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)參考菌與16個(gè)結(jié)核分枝桿菌基因序列無區(qū)別。與H37Rv比較，占平均基因組0.3%的的基因序列（13248bp）發(fā)生丟失，并檢測(cè)到25個(gè)不同的丟失序列（全長(zhǎng)76839 bp）（Kato-Maeda等人，2001）。提示基因缺失是分枝桿菌病原菌進(jìn)化中遺傳改變的主要原因。另外，Kato-Maeda和其合作者（2001）的工作提示，當(dāng)基因缺失時(shí)（或突變時(shí)），結(jié)核分枝桿菌的毒力下降。分析減毒結(jié)核分枝桿菌與全毒結(jié)核分枝桿菌的基因組，發(fā)現(xiàn)變化的位點(diǎn)是IS介導(dǎo)的基因缺失的結(jié)果。這樣的比較基因組分析為研究分枝桿菌的進(jìn)化與毒理提供獨(dú)特的遠(yuǎn)景，并與基因微陣列一起，為結(jié)核分枝桿

51、菌感染的分類研究提供合適的基因型分類方法(Brosch等人，2001；Kato-Maeda等人，2001)。12.3.2 基因微陣列技術(shù)分析幽門螺桿菌的比較基因組幽門螺桿菌是革蘭氏陰性的有鞭毛的細(xì)菌，可引起從慢性活動(dòng)性胃炎到嚴(yán)重的胃腸道疾病比如消化器官與胃潰瘍，胃癌，黏膜相關(guān)的淋巴組織（MALT）淋巴瘤(Cover與Blaser，1996)等疾病。幽門螺桿菌與其它病原微生物的區(qū)別是它能定植在胃黏膜這種酸度很高的環(huán)境中?；颊叩陌Y狀差別至少部分與感染的幽門螺桿菌的菌株特異性基因的多樣性有關(guān)(Atherton等人，1997；Blaser，1997)。兩個(gè)獨(dú)立的幽門螺桿菌26695與J99的全基因組序

52、列已通過全基因組隨機(jī)測(cè)序法（鳥槍法）獲得(Alm等人，1999；Tomb等人，1997)。26695與J99的基因組包含一個(gè)小的單個(gè)的環(huán)狀染色體，分別為1.67Mb和1.64Mb，G+C含量為39%。這兩株細(xì)菌基因組中還包含40kb的致病島，編碼型的分泌系統(tǒng)與向宿主細(xì)胞分泌和轉(zhuǎn)移CagA蛋白有關(guān)。另外，基因序列分析提示在幽門螺桿菌的蛋白中，相對(duì)于流感嗜血桿菌與大腸桿菌(Tomb等人，1997)，精氨酸與賴氨酸的出現(xiàn)頻率很高。Tomb和其同事認(rèn)為氨基酸的出現(xiàn)頻率可能影響幽門螺桿菌在酸性的胃中的存在。用生物信息學(xué)與基因微陣列技術(shù)可比較二個(gè)分離出來的幽門螺桿菌的基因組序列。盡管幽門螺桿菌26695與

53、J99的基因序列及預(yù)測(cè)的編碼蛋白是非常接近的，但計(jì)算機(jī)比較基因組方法還是提示出兩者存在種內(nèi)的差異(Alm等人，1999)。比較基因組分析還提示不同菌株大概有6-7%的總基因組差異(Alm等人，1999)。DNA限制性修飾系統(tǒng)的基因占幽門螺桿菌26695與J99特異基因的15-20%，然而預(yù)測(cè)的編碼外膜合成、DNA轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、DNA復(fù)制系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)、磷脂代謝系統(tǒng)等功能基因在菌株中變化很小(Alm等人，1999)。比較幽門螺桿菌26695與J99的序列提示它們都含有不經(jīng)常出現(xiàn)的蛋白，預(yù)測(cè)這類蛋白功能為型限制性修飾系統(tǒng)。在菌株26695中，基于基因順序以及與已知的核酸內(nèi)切酶，甲基轉(zhuǎn)移酶，特殊的亞

54、單位等序列相似特性發(fā)現(xiàn)了11個(gè)限制修飾系統(tǒng)(Tomb等人，1997)。最近，從6個(gè)幽門螺桿菌不同的菌株中鑒定出不同功能特征的22個(gè)型限制性核酸內(nèi)切酶，其中三個(gè)是全新的內(nèi)切酶（Xu等人，2000）。型限制性修飾系統(tǒng)被兩種分離的酶限定：限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異DNA序列并且在特異位點(diǎn)清除未修飾的外源DNA。然而，甲基轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)切酶識(shí)別的相同位置修飾DNA，保護(hù)DNA本身免受內(nèi)切酶的消化(Wilson與Murray，1991)。幽門螺桿菌的不同菌株擁有非常多樣的限制性修飾酶，這個(gè)特征是幽門螺桿菌的獨(dú)特特征(Lin等人，2001；Xu等人，2000)。盡管限制性內(nèi)切酶在不同的菌株中是不同的，生化分析提示所

55、有的酶都能特異性切除識(shí)別的4-5個(gè)堿基識(shí)別序列(Xu等人，2000)。這種不常見的限制性酶切系統(tǒng)的高互補(bǔ)性的生物學(xué)意義還不太清楚。然而，幽門螺桿菌的這種天然能力(Suerbaum等人，1998)提示大量的限制性修飾系統(tǒng)阻止了外源DNA插入到宿主基因組中(Xu等人，2000)?？梢杂肈NA基因微陣列技術(shù)調(diào)查不同細(xì)菌的種內(nèi)多樣性。在另一個(gè)比較基因組研究中，高密度的基因微陣列用于檢測(cè)15個(gè)從臨床分離出的毒性不同的幽門螺桿菌(Salama等人，2000)。假設(shè)26695與J99包含相同的ORF，26695株作為標(biāo)準(zhǔn)菌株被用于制備基因微陣列。91個(gè)只存在于J99的ORFs也在微陣列中展示。在分析的164

56、3個(gè)基因中，1281個(gè)最小的功能核心被鑒定出來 (Salama等人，2000)。這些基因在所有的菌株中均普遍存在，編碼基礎(chǔ)代謝，生物合成與調(diào)節(jié)功能。最值得注意的是在每個(gè)菌株中存在12-18%的菌株特異基因，其中大部分為未知功能基因(表12.1)。兩個(gè)最大的已知功能的特異基因是限制性修飾系統(tǒng)與轉(zhuǎn)座酶基因，在調(diào)節(jié)DNA的改變與促進(jìn)幽門螺桿菌的多樣性上起重要作用(Salama等人，2000)。其它菌株特異性基因編碼各種各樣的外膜蛋白，脂多糖合成蛋白，三個(gè)virB4類似蛋白與一個(gè)traG類似蛋白。它們是與型分泌結(jié)構(gòu)的組裝相關(guān)的ATP酶。Hierarchical分類方法（第七章）用菌株特異的基因鑒定一組

57、可能的新的毒力因子。這些新的毒力因子與幽門螺桿菌的發(fā)病機(jī)理相關(guān)，可以調(diào)節(jié)PAI功能或與PAI共同作用使宿主發(fā)病(Salama等人，2000)。菌株特異性DNA限制性修飾基因與其它的菌株特異性基因和26695與J99中其余基因比較，具有相對(duì)低的G+C含量，提示這些基因可能是來自于其它微生物近期基因水平轉(zhuǎn)移的結(jié)果 (Alm等人，1999)。比較基因組研究幽門螺桿菌的限制性修飾系統(tǒng)說明，所有的菌株特異的限制性修飾基因都是有活性的，然而這些在菌株中保守的基因都是功能水平上非活化的，這個(gè)結(jié)論支持一個(gè)觀點(diǎn)：菌株特異的限制性修飾基因通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得(Lin等人，2001)。對(duì)幽門螺桿菌的比較基因組研究將

58、繼續(xù)鑒定分離出的不同菌株的菌株特異性基因成分，用菌株特異基因的差別解釋菌株進(jìn)化的差別，適應(yīng)不同宿主的差別以及疾病產(chǎn)生的差別。應(yīng)用幽門螺桿菌26695與J99的全基因組信息，以序列分析為基礎(chǔ)，尋找編碼外膜蛋白的基因家族(Alm等人，2000)。這樣的外膜蛋白與幽門螺桿菌適應(yīng)胃的酸性環(huán)境有關(guān)，并且這樣的外膜蛋白代表某個(gè)細(xì)菌最重要的抗原決定蔟?；诒容^基因組，組成菌株編碼蛋白4%的五個(gè)共生同源基因家族在幽門螺桿菌26695與J99的基因組中被鑒定出來。共生同源基因是在基因組中與復(fù)制相關(guān)的基因，編碼的蛋白似乎具有相似的生化功能卻具有不同的生物學(xué)作用。這些家族編碼包括被認(rèn)為是黏附素的Hop外膜蛋白（Oden