全反射螢光顯微術(shù)於生物物理的應(yīng)用

1、全反射螢光顯微術(shù)於生物物理的應(yīng)用邱宗凱 錢正浩 國立臺(tái)灣大學(xué)物理系連偉男 林奇宏 國立陽明大學(xué)微免所E-mail: .tw摘要全反射式顯微鏡可以在縱向上達(dá)到奈米等級(jí)的解析度，加上高訊號(hào)/背景比及其他許多優(yōu)點(diǎn)，使的他在細(xì)胞表面及單分子偵測(cè)上有的許多便利之處，本文中介紹了全反射式顯微術(shù)的原理，各種光路架設(shè)跟比較，及一些生物上的應(yīng)用。前言全反射現(xiàn)象發(fā)生在光從高折射率的介質(zhì)入射到低折射率介質(zhì)時(shí)，入射角大於臨界角的時(shí)候。而在全反射發(fā)生的介面會(huì)產(chǎn)生一種漸逝波，他的強(qiáng)度是成指數(shù)衰減的1。利用這種性質(zhì)，全反射式的顯微鏡可以僅僅激發(fā)介面上數(shù)十奈米的螢光分子，而達(dá)到奈米級(jí)

2、的解析度1。另外，由於僅僅激發(fā)表面的螢光分子，他的訊號(hào)/背景比比起其他的顯微技術(shù)都要高的很多2。另外，由於全反射式顯微鏡是由CCD接收，接收訊號(hào)的頻率可以達(dá)到200HZ，而一般掃描式的顯微鏡如共軛焦或雙光子顯微鏡大約只到達(dá)0.15HZ3。所以全反射式顯微鏡可以很容易的做到快速的顯影。雖然全反射式顯微鏡沒辦法像共軛焦或雙光子顯微鏡做到3D的斷面顯影，但是全反射式顯微鏡很容易可以跟其他光學(xué)技術(shù)配合，截長補(bǔ)短，得到具有不同性質(zhì)的影像 3。以下我們會(huì)簡(jiǎn)介全反射式顯微術(shù)的原理，光路的搭設(shè)及一些應(yīng)用。原理:漸逝波的強(qiáng)度當(dāng)一道光束從折射率高的介質(zhì)傳播到折射率較低的介質(zhì)時(shí)，如果入射角大於臨界角時(shí)，就會(huì)有全反射

3、現(xiàn)象的發(fā)生。根據(jù) Snell Law，我們可以得到臨界角c 為 (1) 在上列的公式中，n1 及n2分別為入射面及折射面的折射率。根據(jù)幾何光學(xué)來看，若發(fā)生全反射，光完全不會(huì)傳遞到折射面內(nèi)。但是若是以電磁波的觀點(diǎn)來看，在發(fā)生全反射的介面，電磁場(chǎng)會(huì)透入一小段距離，我們叫這個(gè)波為漸逝波(evanescent wave)。漸逝波是一個(gè)不會(huì)傳播的波，他的強(qiáng)度是成指數(shù)衰減的，但是如果在非常靠近介面的地方，有會(huì)吸收光的物質(zhì)，例如螢光分子，漸逝波仍然是有能力去激發(fā)這個(gè)螢光分子，因而產(chǎn)生螢光。這個(gè)漸逝波的電場(chǎng)強(qiáng)度為 (2) (3)在上列公式內(nèi)為入射光強(qiáng)度、z為縱軸距離、為波長。由上式我們可以發(fā)現(xiàn)大於臨界角時(shí)越接

4、近臨界角，d越大，入射的強(qiáng)度衰減的就越慢。除了入射角等於臨界角時(shí)，d約小於或等於入射波長，如此一來，藉由調(diào)整光的強(qiáng)度及入射的角度，我們就可以只激發(fā)介面上數(shù)十到兩三百奈米的螢光分子，獲得介面上縱方向上奈米等級(jí)的解析度。圖(一)I0/Iz versus z (nm)入射角:70度 由折射率1.515到折射率1.33的介面中圖(二)d verse 角度 由折射率1.515到折射率1.33的介面漸逝波的電場(chǎng)從Maxwell Equations中，我們可以推導(dǎo)出漸逝波的各方向電場(chǎng)與強(qiáng)度 (s 和 p波) 跟其角度和振幅的關(guān)係，如下式1 (3) (4) (5) (6)其中 (7) (8)值得注意的是，p-

5、偏振方向沿著表面呈現(xiàn)一種以/(n1sin)為空間週期的橢圓偏振，如圖所示圖(三)p-polarization 在全反射介面上的情形這種特別的偏振現(xiàn)象，可以利用來測(cè)定表面螢光分子的方向性及轉(zhuǎn)動(dòng)14。全反射式顯微鏡的結(jié)構(gòu)全反射式顯微鏡主要可以分成兩種，一種是利用光透過稜鏡進(jìn)行全反射，另外一種是利用特別的高NA值物鏡進(jìn)行全反射(一般稱為prism less式的設(shè)計(jì))178，不論在哪一種設(shè)計(jì)，入射面及折射面的折射率都是很重要的，一般最常見的例子是透過蓋玻片觀察細(xì)胞表面，接下來會(huì)分別討論這兩種全反射式顯微鏡。為了方便起見，我們先假設(shè)我們是為了觀察黏附在載蓋玻片上的細(xì)胞表面。蓋玻片的折射率為1.515，細(xì)

6、胞表面的折射率為1.38，如此一來，臨界角為65度，若是細(xì)胞沒有接觸到蓋玻片表面，則要考慮的是水溶液，折射率是1.33，則臨界角為61度5。透過高NA值物鏡式之全反射顯微鏡設(shè)計(jì) sample obj. Laser beam expander NA>1.4samplelaserfluorescence圖(四),圖(五)為物鏡式全反射顯微鏡基本的光路設(shè)計(jì)光源經(jīng)過擴(kuò)束後打到物鏡的外圍，經(jīng)過物鏡的偏折在蓋玻片和樣品的介面產(chǎn)生全反射。如果我們使用的是一般高NA值的物鏡，例如NA=1.4的油鏡，細(xì)胞表面折射率為1.38，透過Snells Law，我們可以知道臨界角等於80度，如此一來光束只能打在物鏡

7、的邊緣(可用範(fàn)圍約為2.8%)，而且產(chǎn)生的全反射相當(dāng)接近臨界角，漸逝波的強(qiáng)度就會(huì)變得很強(qiáng)，以致激發(fā)的深度加深許多，另外由於表面本身性質(zhì)的不均勻，會(huì)造成一些入射的光不是以全反射而變成了折射。所以透過物鏡的全反射式顯微鏡要透過特製的高NA值物鏡來建造1。目前有兩種選擇，一個(gè)為Olympus NA=1.65的物鏡，如此一來臨界角變?yōu)?7度，可以調(diào)整的角度範(fàn)圍就大幅提昇了(約為25%)。使用這顆物鏡的缺點(diǎn)在於需要另外定製高折射率的蓋玻片跟物鏡油。另外一種物鏡的選擇是Olympus or Zeiss NA=1.45的物鏡，用這顆物鏡，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的蓋玻片及物鏡油，且可以使用足夠的物鏡範(fàn)圍(約為10%)，

8、這個(gè)是目前一般認(rèn)為比較好的選擇13。透過高NA值物鏡的全反射式顯微鏡的好處是光路的搭設(shè)簡(jiǎn)單，顯微鏡的臺(tái)子會(huì)有更多的空間可以用來操作。且透過高NA值的物鏡，可以有較好的解析度跟亮度。而他的缺點(diǎn)是會(huì)收到不是由全反射所激發(fā)出的螢光，主要的原因是由於細(xì)胞表面的不平整會(huì)造成的散射，還有物鏡本身發(fā)出的冷光13。稜鏡式的全反射式顯微鏡稜鏡式的全反射式顯微鏡一般都搭在倒立式顯微鏡之上，因?yàn)檫@樣會(huì)有比較多的空間去加裝一些光學(xué)物件，但正立式顯微鏡仍然有相當(dāng)?shù)谋憷浴?基本的光路設(shè)計(jì)都是將光打入稜鏡，在蓋玻片的表面進(jìn)行全反射，稜鏡的所則有很多種，可以適用在不同目的的實(shí)驗(yàn)上。下圖是一些常見的光路設(shè)計(jì)OBjOBjOBj

9、OBj圖(六)圖(七) 圖(六) 圖(七) 圖(八) 圖(九)圖(六)的設(shè)計(jì)相當(dāng)?shù)暮?jiǎn)單便利，光從三角形稜鏡的側(cè)面打入，在下方進(jìn)行全反射。圖(七)這種設(shè)計(jì)是利用一個(gè)60度的稜鏡加工，光可以垂直射入，好處是再替換樣品以後，光很容易可以打到原來的位置。圖(八)這個(gè)設(shè)計(jì)中的鏡子是拋物面鏡，焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)半圓形稜鏡的圓心，如此一來，變換角度時(shí)也可以打到同一點(diǎn)，只要垂直的變化光入射的位置，就可以變化入射的角度了。圖(九)這個(gè)設(shè)計(jì)和前面的設(shè)計(jì)比較不一樣，稜鏡是放置在下方的，光從稜鏡進(jìn)入後，在蓋玻片內(nèi)做多次全反射，如同波導(dǎo)一般。這個(gè)設(shè)計(jì)的好處是他上方有很大的空間可以利用，而且更換樣品也很容易，只需要換上層的蓋玻片就

10、可以了。但是這個(gè)設(shè)計(jì)就不能使用油鏡，只能使用水鏡或空氣鏡1。上面這些透過稜鏡式的全反射式顯微鏡跟物鏡式的比較起來，(1)造價(jià)便宜很多(2)角度變化的範(fàn)圍很大，也且也很容易變換。但可利用的空間較少。而且由於高NA值的油鏡工作距離相當(dāng)短，樣品的兩片蓋玻片之間距離很近，很難去作微流和其他的操作工作。如果是採用(九)圖的設(shè)計(jì)又不能使用油鏡。另外，解析度也不如物鏡式的全反射顯微鏡。綜觀兩種全反射式顯微鏡，都可以搭建在一般標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡上，照價(jià)和共軛焦顯微鏡比較起來也便宜很多，而且可以提供更好的縱向解析度，另外全反射式顯微鏡也很容易和很多的顯微方法結(jié)合，例如FCS，F(xiàn)RAP，F(xiàn)RET, FLIM，光鑷子，共

11、軛焦顯微鏡，雙光子顯微鏡，原子力顯微鏡等等134。全反射式顯微鏡的應(yīng)用許多生化上的反應(yīng)都是發(fā)生在細(xì)胞膜和周圍環(huán)境的介面，例如膜蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)，生物巨分子的傳輸與交互作用等等8910，全反射式顯微鏡可以說是一種非常好的觀察工具，另外，由於全反射式顯微鏡的高訊號(hào)/背景比例，近年來也開始以全反射式顯微鏡配合其他光學(xué)技術(shù)，做單分子的觀測(cè)1112。下面會(huì)概略的介紹一些應(yīng)用全反射式顯微鏡的例子。蛋白質(zhì)-細(xì)胞膜的結(jié)合平衡與動(dòng)態(tài)在很多情況之下，表面螢光的強(qiáng)度正比於膜蛋白的密度，藉由量測(cè)表面的螢光強(qiáng)度，我們可以得知和表面結(jié)合的膜蛋白的密度變化，如此一來就可以得到膜蛋白和細(xì)胞膜表面的結(jié)合速率，平衡常數(shù)的訊息1314

12、。分子的方向性和旋轉(zhuǎn)速率如同式(3),(4)所示，我們可以使用偏振化的漸逝波來測(cè)量表面的螢光分子吸收/發(fā)散偶極矩的方向性，可以用來測(cè)量細(xì)胞膜表面方向性的變化1516。另外，配合螢光分子專一位置結(jié)合和FRET的技術(shù)，也可以用來測(cè)量單分子的旋轉(zhuǎn)，結(jié)構(gòu)的改變等等17。受器的叢生(Receptor Clustering)在很多的情況中，受器的叢生代表細(xì)胞膜表面調(diào)整訊號(hào)的轉(zhuǎn)換，利用全反射式顯微鏡配合FCS，可以測(cè)量到受器叢生的發(fā)生1819。使用全反射式顯微鏡的好處除了低背景和高縱向解析度以外，由於全反射式顯微鏡是固定區(qū)域已CCD接收影像，跟以PMT接收，一點(diǎn)一點(diǎn)掃描的顯微鏡比起來，全反射式顯微鏡是Aut

13、ocorrelation的，這在資料分析上會(huì)有很大的方便性20。高時(shí)間解析度的測(cè)量所以利用全反射式顯微鏡可以作為在介面上高時(shí)間解析度的螢光測(cè)量，配合快速傅立葉轉(zhuǎn)換，將時(shí)域轉(zhuǎn)為頻域，可以達(dá)到奈米秒等級(jí)的時(shí)間解析度21，如果利用一種相位解析漸逝波的方法，可以達(dá)到皮秒的時(shí)間解析度。這種方法是利用一個(gè)高頻的正弦光波做全反射2223。單分子的偵測(cè)單分子的偵測(cè)再近年來造成一股生物物理界的熱潮，但是由於單分子的顯影最大問題在於訊號(hào)/背景比太低了，F(xiàn)unatsu et al.試著非常小心的設(shè)計(jì)出一套背景最低的光學(xué)系統(tǒng)，大約可以將背景降低到數(shù)千到140個(gè)光子每秒每繞射極限面積(0.25 *0.25)4，而利用同

14、一套系統(tǒng)配合全反射式顯微鏡，可以將背景降至3個(gè)光子每秒每繞射極限面積，這在單分子的偵測(cè)上面有著非常大的便利4。而且全反射式顯微術(shù)很容易跟別的光學(xué)技術(shù)搭配,例如Yanagida等人利用光鑷子配合全反射式顯微術(shù),觀察到了RNA聚合脢單分子在-DNA上的運(yùn)動(dòng)24，還有Chu也利用全反射式顯微術(shù)觀察單ribozyme分子的結(jié)構(gòu)變化28。結(jié)論與展望我們?cè)谶@篇文章中簡(jiǎn)介了全反射式顯微鏡的原理，光路上的設(shè)計(jì)和一些應(yīng)用。其間還有很大的發(fā)展空間。在技術(shù)的改進(jìn)方面，一個(gè)方向是將全反射式顯微鏡和各種光學(xué)技術(shù)結(jié)合，例如我們提到過的FCS，AFM，F(xiàn)RET等等，另一方面是做多色的全反射式顯微鏡，如此一來就可以同時(shí)觀察細(xì)

15、胞表面不同分子的交互作用29，另外配合一些特別的螢光分子，例如啶黃素核甘酸(flavin nucleotide)的類似物和量子點(diǎn)(quantum dots)，因?yàn)槠涮厥獾墓鈱W(xué)性質(zhì)和生物相容性，可以在單分子偵測(cè)上有相當(dāng)?shù)谋憷Ｔ谘芯康念}目方面，除了表面分子的性質(zhì)外，全反射式顯微鏡在細(xì)胞骨架(cytoskeleton)和基質(zhì)之間的作用(例如微小(microtubules)和肌動(dòng)蛋白(actin)的研究)也是相當(dāng)重要252627。另外，最近相當(dāng)熱門的研究就是利用綠色螢光蛋白(GFP)做為蛋白質(zhì)的螢光標(biāo)記來研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表現(xiàn)，而全反射式顯微鏡就是其中一個(gè)分析的最佳工具之一 。 縱上所述，全反射式

16、顯微鏡有著很多特別的優(yōu)點(diǎn)，包括奈米等級(jí)的縱向解析度，高訊號(hào)/背景比，架設(shè)容易便宜，和其他的光學(xué)方法容易結(jié)合等等，毫無疑問的，不論在細(xì)胞和單分子的顯影，偵測(cè)上，全反射式顯微鏡都占有相當(dāng)重要的地位。參考文獻(xiàn)1Daniel Axelrod, Nancy L.Thompson, Thomas P.Burghardt, Methods in cellular imaging, p.362-380, Oxford University Press2W. Patrick Ambrose, Peter M. Goodwin, and John P. Nolan Cytometry 36:224231 (199

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