表面增強拉曼光譜技術及其在生物分析中的應用

1、食品課程論文表面增強拉曼光譜技術及其生物題目 分析應用研究進展 姓名專業(yè)陳坤 學號 2009309010006 食品科學二九 年 十二 月表面增強拉曼光譜技術及其生物分析應用研究進展Bioanalysis Application of Surface-enhanced Raman Spectroscopic（陳坤 2009309010006 食科院 食品科學）摘要：拉曼光譜誕生距今已整整80年，激光器、CCD檢測器、光纖探針技術的發(fā)展使拉曼光譜分析儀器及其應用進展日新月異。然而傳統(tǒng)拉曼光譜信號微弱，因此表面增強拉曼散射光譜（SERS）憑借其超靈敏且具有化學選擇性而被廣泛應用于生物分子鑒定。它是

2、一種信號強度高，熒光和水的背景干擾小的表面分析技術。本文就SERS在生物應用方面的研究作簡單回顧。關鍵詞：表面增強拉曼光譜（SERS）；生物分析；應用拉曼光譜是用途廣泛的無損檢測和分子識別技術，它能夠提供化學和生物分子結構的指紋信息。但是常規(guī)拉曼散射截面分別只有紅外和熒光過程的10-6和10-14。1這種內(nèi)在低靈敏度的缺陷曾制約了拉曼光譜應用于痕量檢測和表面科學領域。盡管拉曼光譜技術是一種重要的生物化學分析工具，但由于其信號強度低，而生物分子通常在自然環(huán)境下含量較低，這樣得到的拉曼信號很小或者檢測不到，作為信息讀出手段往往缺乏高靈敏性。直到20世紀70年代中期，F(xiàn)leischmann、Van

3、Duyne和Creighton分別領導的3個研究組2-4分別觀測和確認了表面增強拉曼現(xiàn)象，即在粗糙銀電極表面的吡啶分子的拉曼信號比其在溶液中增強了約106倍。人們將這種由于分子等物種吸附或非?？拷哂心撤N納米結構的表面，其拉曼信號強度比其體相分子顯著增強的現(xiàn)象稱作表面增強拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering，SERS)效應。SERS效應的發(fā)現(xiàn)有效地解決了拉曼光譜在表面科學和痕量分析中存在的低靈敏度問題。1. 表面增強拉曼散射機理與SERS實驗和應用所取得的進展相比，SERS理論的研究一直相對滯后，這主要是因為具有SERS效應的體系非常復雜。體系表面形貌和

4、表面電子結構，光和粗糙表面的相互作用，光和分子的相互作用，分子在表面的取向、成鍵作用以及分子和表面的周邊環(huán)境，入射光的強度、頻率、偏振度和偏振方向等因素對SERS譜圖的影響均比較復雜。SERS體系的這些復雜性導致了人們對SERS效應認知的多樣性. 人們從各個角度和具體實驗條件提出了不同的SERS機理5。 目前學術界普遍認同的SERS機理主要有物理增強機理和化學增強機理兩類。SERS譜峰強度ISERS常具有以下正比關系6, 7：式中，E（0）和E（S）分別為頻率為0的表面局域光電場強度和頻率為S的表面局域散射光電場強度；和分別為分子所處位置的激發(fā)光的電場方向和拉曼散射光的電場方向；（）fi是某始

5、態(tài)i經(jīng)中間態(tài)r到終態(tài)f的極化率張量。式（1）ISERS前半部分表明，入射與散射光的局域電場強度越大，拉曼信號強度越大，這來自于物理增強機理的貢獻，通常歸因于電磁場增強（Electromagnetic enhancement, EM）機理8。式，（1）后半部分表明，體系極化率（）fi越大, 則相應拉曼信號的強度也越大，這是SERS化學增強（Chemical Enhancement, CE）機理的貢獻5, 9。它是由于分子和表面之間的化學作用，從而增大了體系的極化率。1.1 化學增強機理化學相互作用對反映在光電場下電子密度形變難易程度的拉曼過程是非常重要的。當分子化學吸附于基底表面時，表面、表面吸

6、附原子（Adatom）和其它共吸附物種等都可能與分子有一定的化學作用，這些因素對分子的電子密度分布有直接的影響?；瘜W增強主要包括以下3類機理：（1）由于吸附物和金屬基底的化學成鍵導致非共振增強（Chemical-Bonding Enhancement, CB）；（2）由于吸附分子和表面吸附原子形成表面絡合物（新分子體系）而導致的共振增強（Surface Complexes Enhancement, SC）；（3）激發(fā)光對分子-金屬（Molecule-Metal, m-M）體系的光誘導電荷轉(zhuǎn)移的類共振增強（Photon-induced Charge-Transfer Enhancement, P

7、ICT）。這3種增強機理都表示體系極化率的變化對拉曼強度的影響，它們的區(qū)別在于CB增強是由于分子與表面化學吸附形成化學鍵，引起分子和金屬間的部分電荷轉(zhuǎn)移；該體系極化率的分子和分母項都沒有顯著變化，但是分子的HOMO和LUMO軌道展寬。SC增強是由于在表面上由部分帶正電的金屬原子組成的原子簇和帶部分負電荷的分子以及電解質(zhì)陰離子形成表面絡合物，這種絡合物作為新的分子體系，具有不同的HOMO和LUMO，在可見光激發(fā)下可以達到共振；該體系極化率的分子和分母項都有較大改變，特別是分母項由于滿足共振條件，其實部趨于零。PICT增強并不強調(diào)表面與分子有很強的化學作用，主要取決于金屬電極的費米能級和分子HOM

8、O或LUMO的能量差；若該值與激發(fā)光能量相匹配，就會發(fā)生分子到金屬或者金屬到分子的電荷轉(zhuǎn)移；該體系極化率的改變主要體現(xiàn)在中間態(tài)r上，即體系的電荷轉(zhuǎn)移態(tài)。1.2 SERS的電磁場增強機理在SERS效應的電磁場增強機理解釋中，表面等離子體共振（Surface plasmaon resonance, SPR）引起的局域電磁場增強被認為是最主要的貢獻9-12。表面等離子體是金屬中的自由電子在光電場下發(fā)生集體性的振蕩效應13, 14，特定粒徑的納米粒子金屬因為各自獨特的等離子體共振吸收而顯現(xiàn)出豐富多彩的顏色效應。這種等離子體的共振吸收早在19 世紀人們就開始了對其內(nèi)在機理進行研究。Lorenz，Mie和

9、Debye各自獨立發(fā)展了相應方法計算介質(zhì)球?qū)﹄姶挪ǖ纳⑸渥饔?，這樣的理論15-17被稱之為Lorenz-Mie-Debye理論，Lorenz-Mie理論或Mie理論。Mie首次解釋了各種粒徑的球形金納米粒子的顏色起源。Gans修正的Mie理論可以處理橢球或者類橢球粒子的光學性質(zhì)，較好地解釋了金納米棒的橫模和縱模等離子體吸收峰，以及縱模吸收峰隨粒子長徑比變化的現(xiàn)象。由于早期Mie理論只是考慮孤立粒子的光學性質(zhì)，并沒有考慮臨近粒子的耦合作用，而納米粒子之間的耦合作用對其自身的光學性質(zhì)和SERS的增強作用都有很大的影響。當粒子之間的距離小于粒子本身的尺度，甚至在發(fā)生團聚時，等離子體共振峰（SPR）發(fā)

10、生紅移，同時在更長波長的位置出現(xiàn)吸收峰，這些譜峰被認為是類似于納米棒中的縱模共振峰。為了克服Mie理論的缺陷。人們發(fā)展了有效介質(zhì)理論，特別是Maxwell-Garnett理論，很好地解釋了多粒子耦合的光學現(xiàn)象。除此之外還發(fā)展了存在解析解的廣義Mie理論，數(shù)值求解的時域有限差分方法（Finite Difference Time-Domain，F(xiàn)DTD）。例如，通過擬合金屬的介電常數(shù)，利用三維時域有限差分（3D-FDTD）方法模擬了不同形狀的純金屬納米粒子的電場分布，模擬了核殼結構的異質(zhì)材料的光電場分布等。模擬結果表明可以利用SERS的電磁場增強的長程效應，采用“借力”的策略，以高SERS活性的A

11、u，Ag和Cu納米粒子為基底或核，分別在其表面沉積或者修飾上極薄層的非SERS活性或者弱SERS活性材料，從而獲得在這些材料上吸附的分子的高質(zhì)量SERS譜，以拓展SERS研究和應用體系。此外，離散偶極近似方法（Discrete Dipole Approximation）也常用來數(shù)值求解特殊形狀的納米粒子的光學性質(zhì)。定量模擬電磁場增強的分布，并與納米粒子的表征技術相結合，可以指導人們合成具備某種光學性質(zhì)可控的納米結構材料，并推動SERS成為廣泛應用于化學傳感和生物醫(yī)學檢測方面的有力工具。2. 新型SERS 活性基底20世紀80 年代SERS 的發(fā)展遇到了不少難題：僅有金、銀、銅3 種金屬和少數(shù)極

12、不常用的堿金屬（如鋰、鈉等）具有強的SERS效應；金、銀、銅金屬尚需表面粗糙化處理之后才具有高SERS活性，故常用的平滑單晶表面皆無法用SERS研究；實驗上所觀察到的很多復雜現(xiàn)象尚無法用現(xiàn)有的SERS理論進行解釋。20世紀90年代以Kneipp和Nie S為代表的一些小組對上述問題進行了理論與實驗研究，取得了突破性的進展：SERS增強因子從最初的104106提高到了10141016，SERS逐漸發(fā)展成為單分子科學研究手段之一18, 19；在系列純過渡金屬元素（第副族元素）以及其它體系中觀察到SERS效應20, 21。目前吸附分子產(chǎn)生表面增強拉曼散射的金屬有Ag、Au、Cu、Li、Na 、K、I

13、n、Al、Pt 、Rh、Ni、Ti、Hg、Cd、Pd等，化合物有TiO2、NiO等22。納米技術的發(fā)展給SERS技術的發(fā)展注入了活力，例如，某些納米粒子體系的SERS信號可以放大至百萬億倍，因此有望成為單分子科學中的重要檢測工具。19, 23近年來，SERS被廣泛地應用于表面吸附24、電化學和催化反應24, 25、化學和生物傳感器23, 26、生物醫(yī)學檢測27-29及痕量檢測與分析30等領域。在發(fā)現(xiàn)SERS效應之后，人們發(fā)現(xiàn)表面增強效應也普遍存在于其它光譜學中，通過對各種表面增強光譜的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，它們都具有強烈依賴于特定的金屬納米結構的共性。為了達到增強效果，應選擇直徑10-100nm接近待

14、分析分子的金屬粒子。增強途徑很多，常用技術及使用的納米粒子均列于表1中。金銀溶膠，薄層和電極是最常用的增強基底。金納米粒子易控制大小分布，穩(wěn)定性好，與抗體、抗原蛋白質(zhì)，DNA及RNA有良好的生物相容性，它已經(jīng)成功的應用于標記技術，合適大小和粗糙度的金溶膠粒子很適合做SERS基底。因此，標記免疫納米粒子通過各種生物反應識別待測部分，可以很好的達到檢測要求。3. 生物分析應用拉曼光譜具有靈敏度高、需樣量濃度低（10-310-5 mol·L-1）、反映信息量大以及不受水溶劑的干擾等優(yōu)點，此外還可以針對復雜分子的不同生色團進行選擇性共振激發(fā)（生物分子在250750 nm范圍內(nèi)有較強的吸收譜帶

15、），因此激光拉曼光譜被廣泛用于研究DNA、膽色素、卟啉等生物分子的結構表征及其與藥物分子的相互作用31-33。采用表面增強拉曼光譜手段對幾種季銨鹽化合物與DNA之間的相互作用，結果表面拉曼光譜作為一種抗癌藥物篩選和藥物作用研究手段具有十分廣闊的應用前景33。3.1 生物分子檢測3.1.1 氨基酸溶液SERS實時SERS觀測在生物分子研究領域有著卓越的應用前景，如核酸和氨基酸識別。這項工作致力于對氨基酸的光診斷應用研究。氨基酸是構成蛋白質(zhì)和酶的基礎物質(zhì)。要組成不同的蛋白質(zhì)需要多種氨基酸來組合。一個氨基酸通常大于100nm，所以這個氨基酸只有部分能連到Ag+基底上34，35。據(jù)此來推測Glu和As

16、p在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用36。3.1.2 肽鏈SERS肽鏈大多是通過羧基端與Ag+相連。一般會在930和1410cm-1處出峰。但是對于不同的氨基酸這些峰的位置和強度都會發(fā)生變化，揭示了可能是由于羧基端和銀表面相互作用的結果37。3.1.3 蛋白質(zhì)SERS蛋白質(zhì)SERS分析幾乎與氨基酸SERS同時展開。這些研究囊括對神經(jīng)傳遞38、血紅蛋白39、四黃素40、視網(wǎng)膜41、膽液42、視覺交叉神經(jīng)43等的研究。3.1.4 雙螺旋DNA SERS當核酸吸附到金屬納米結構上時就可被檢測到，與普通的基因診斷不同，這是一種直接測定技術。還有其它SERS報道用于DNA雜交1,3,7,9-6氯-6-羧基二氫熒

17、光素和羅丹明6G44，45。3.2 免疫測定SERS標記免疫學創(chuàng)立于年代初期，開始以放射免疫分析為代表，以后相繼派生出許多其它的標記免疫分析方法。在方法學的研究、開發(fā)和發(fā)展過程中，人們關注的焦點始終圍繞著如何提高靈敏度和特異性這兩大精髓問題。隨著基礎醫(yī)學和相關技術的發(fā)展，特別是近十余年來，新理論、新方法、新材料、新工藝、新產(chǎn)品不斷開發(fā)，使標記免疫分析技術向縱深發(fā)展，目前已形成由多種標記、多種反應模式的綜合性標記免疫分析體系。標記免疫學是一門邊緣學科，其基本技術標記免疫分析，是將多種標記示蹤技術的高度靈敏性和醫(yī)學免疫學抗原抗體反應的高度特異性相結合的產(chǎn)物，因此具有及其良好的微量分析效果，是生物活

18、性物質(zhì)分析方法上的新領域。這一分析方法不僅靈敏度高，特異性強，重復性好，準確性高，而且操作簡單，易于商品化。傳統(tǒng)的拉曼散射光譜信號較弱，作為信息讀出手段往往缺乏高靈敏性。70年代中后期Au、Ag、Cu上表面增強拉曼散射（SERS）效應的發(fā)現(xiàn)與證實，給拉曼光譜的研究應用注入了新的活力。SERS標記免疫檢測是一種將SERS免疫反應中加入標記示蹤物，與標記免疫學相結合，利用SERS的高靈敏度和光譜選擇性，結合抗體抗原的特異反應作用而進行的納米標記免疫分析技術。這種新發(fā)展起來的標記免疫分析技術將生物分析技術、納米技術與SERS三者很好的結合。事實上，在一些納米銀“熱粒子”上，某些分子，如染料分子、血紅

19、蛋白等的信號靈敏度可與熒光光譜媲美，甚至超過熒光光譜，且拉曼譜峰寬度通常比熒光譜峰要窄一倍，對生物分子光損傷性很小，尤為適合水溶液物質(zhì)結構研究。SERS的高選擇性、高靈敏度，使其在生物分子的結構和構象、分子的界面行為和性質(zhì)、標記分子與金屬納米粒子表面的相互作用等方面有良好的研究前景。SERS標記免疫技術是在生物免疫應答的基礎上發(fā)展起來的，主要基于類似三明治結構的構建，基底上的固相抗體與標記抗體通過與抗原的結合形成“固相抗體-待測抗原-標記抗體”夾心復合物，通過對標記分子SERS信號的識別進行免疫分析。這項技術最早是由Rohr等人46于1989年創(chuàng)立，他們首先利用表面增強共振拉曼光譜(SERRS

20、)來研究生物分子之間的相互親和性，將二甲基偶氮苯胺以共價鍵與抗甲狀腺促進激素(TSH)抗體相連，形成標記抗體，以銀表面固定的anti-TSH抗體作為固相抗體，二者與待測液中TSH抗原形成夾心復合物，利用夾心復合物中標記物的SERRS信號來進行免疫分析，但這種固相抗體的均一性較難控制，重現(xiàn)性較差。隨著生物技術的發(fā)展，SERS在酶聯(lián)免疫47和基因工程48領域也有了較大的研究進展。Dou49和Mirkin50等人分別將SERS標記免疫技術用于酶聯(lián)免疫分析與DNA序列識別。這些研究為以后SERS標記免疫檢測打下了堅實的理論與實驗基礎，引起了世界各研究小組的廣泛關注。Mirkin小組將SERS標記免疫與

21、醫(yī)學上的銀染色技術相結合進行免疫識別，利用銀的強SERS效應，在標記免疫金納米粒子與固相抗體所捕獲的抗原發(fā)生免疫識別后進行銀染色以獲得較好的活性。將標記免疫分析的選擇性與表面增強拉曼散射技術的靈敏度進行有機結合，對拉曼光譜在生物體系中的應用有重要意義。免疫檢測建立在抗原與其對應抗體的特異性反應上，它是生化分析，醫(yī)學診斷和環(huán)境監(jiān)測中非常有用的分析手段。而最具代表性的研究當屬Porter小組51于1999年首次將SERs標記分子和羊抗小鼠IgG直接與金溶膠相作用形成標記免疫溶膠，通過相應小鼠抗原與固定在基底上的羊抗小鼠IgG相連，進行SERs免疫檢測。采用雙官能團標記分子代替單官能團標記分子是提高

22、檢測靈敏度的方法之一。雙官能團標記分子一端通過巰基與金納米粒子相連，另一端與抗體相連，這種方法大大增加了金納米粒子表面吸附標記分子的數(shù)量，提高了檢測的靈敏度，其待測抗原的檢出限達到了1 pg/mL。采用這種標記免疫溶膠方法，金納米粒子表面產(chǎn)生的電磁場將直接影響相連的標記分子，可產(chǎn)生較強的SERS信號，且不存在距離影響SERS信號的問題。因此無需選用特定的吸收光譜與入射光波長相匹配產(chǎn)生共振效應的分子，拓寬了標記分子的選擇范圍，這種方法與Rohr、Dou等人采用的直接標記法、酶標法相比更體現(xiàn)了SERS其獨特的優(yōu)點。3.3 生物組織或細胞SERS分析近幾年，拉曼標記與生化、免疫手段相結合定位檢測亞細

23、胞結構甚至某種特定生物大分子的研究，正成為激光拉曼光譜拓展到生物醫(yī)學領域的新切入點。不會導致生物變性的近紅外激光和高靈敏度的CCD檢測器的使用以及顯微拉曼光譜儀器的12m空間分辨率使單細胞的拉曼光譜檢測成為可能，自從Puppels等報道采用自行研制的激光共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測單個細胞及染色體之后，單個細胞原位、無損檢測的報道層出不窮。鼠肝星狀細胞體內(nèi)外激活的拉曼光譜研究表明其活化過程中分子組成和結構會發(fā)生變化，基于模糊C均值和人工神經(jīng)網(wǎng)絡等聚類分析法，構建了自動判別肝損傷程度的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和探索了早期預警肝纖維化的快速診斷方法52。采用化學方法將納米金與從病毒中提取的核定位肽連接，制成細胞核

24、靶向拉曼光譜檢測，成功地獲取了核內(nèi)生物大分子的大量結構53信息。拉曼光譜因具有較高選擇性以及尤為適合水溶液物質(zhì)結構研究等特點，近年來己在生物醫(yī)學研究領域中顯示出獨特的潛在應用前景，而被大量應?；诮M織在病變過程中分子組成和分子結構的變化，拉曼光譜法另辟蹊徑試圖從分子層面區(qū)別病變和正常組織的差異，從而實現(xiàn)疾病的早期診斷。自從Alfano等首次證實了拉曼光譜可用于區(qū)分正常組織與癌癥組織后，各類器官的正常與癌變組織的拉曼檢測工作陸續(xù)開展起來，這些組織包括皮膚、腦、眼、口腔、食道、胃、肝、膀胱、子宮頸、結腸、骨等。目前，除乳腺、皮膚等體表組織以及胃腸道中的結腸、食道組織和婦科腫瘤中的子宮頸組織可以實現(xiàn)

25、體內(nèi)檢測外54，其他器官組織還停留在離體檢測階段。對正常與病變組織的拉曼光譜比對，并采用小波分析等化學計量學手段對所獲得的拉曼光譜譜圖進行信號處理和特征信息的提取55。例如，對參與阿爾茨海默病變的海馬組織進行拉曼光譜研究，發(fā)現(xiàn)在腦內(nèi)與-淀粉樣蛋白共存的分子伴侶-膽固醇的堆積以及tau蛋白異常磷酸化等新的拉曼光譜信息。以此作為一種新的多組分拉曼光譜判據(jù)，為了解阿爾茨海默癥的致病機理和藥物治療提供了新的視角。人眼翼狀胬肉拉曼光譜研究表明：拉曼光譜可作為一種簡便直觀和信息豐富的新型病理學診斷手段，它所提供的關于翼狀胬肉的病理變化信息涵蓋了免疫學、超微結構病理學和脂類過氧化反應三種病理學手段的檢測結果

26、。過氧化氫是醫(yī)用牙齒漂白劑的主要活性成分，其漂白機理及安全性一直存在爭論。采用激光拉曼光譜、激光誘導熒光光譜和紅外光譜對漂白前后的牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)進行了系統(tǒng)的研究，從多個視角了解了漂白劑在牙漂白過程中對牙釉質(zhì)/牙本質(zhì)的力學強度、礦物和有機成分的組成與結構的影響56, 57，為漂白機理的探討和評估漂白劑使用的安全性提供了堅實的科學依據(jù)。單個培養(yǎng)的胃癌細胞SGC7901和胃黏膜組織中的正常與胃癌細胞的拉曼光譜比較顯示出維生素A和類胡蘿卜素在癌變過程中呈現(xiàn)此消彼長的關系，這一發(fā)現(xiàn)為探討癌變機理提供了新的思路?；谇€擬合的重疊峰解析和小波分析等多種化學計量學手段對單個培養(yǎng)的胃癌細胞SGC7901和胃黏

27、膜組織中的胃癌細胞的拉曼光譜數(shù)據(jù)進行了處理，大大提高了光譜數(shù)據(jù)的信噪比并得到了精確甄別出胃黏膜組織上胃癌細胞的拉曼光譜判據(jù)，為胃癌的早期診斷和胃癌手術中癌組織的準確甄別與手術切除提供了一種可行的依據(jù)53。脊髓損傷（SCI）的發(fā)病率隨著交通與建筑業(yè)的發(fā)展而逐年增加，脊髓損傷引發(fā)的繼發(fā)性骨質(zhì)酥松機理尚未明晰。而采用激光共聚焦拉曼光譜從分子層面對脊髓損傷引發(fā)的骨質(zhì)變化進行了初步的研究，證實了荷爾蒙的變化是引起骨質(zhì)流失的重要因素之一。表面增強拉曼光譜（SERS）拓寬了生物分析這個領域中的應用，可使生物樣品的拉曼信號增強若干個數(shù)量級。SERS還被應用到昆蟲病毒，抗濾過性病原體的藥物，泌尿系統(tǒng)細菌等方面的

28、研究。3.4 生物組織或細胞SERS成像將表面增強拉曼光譜與共聚焦拉曼顯微鏡結合，可以得到這種高光譜表面增強拉曼成像技術（HSERI）。這是一種采用激光共焦拉曼散射顯微三維掃描技術，在無擾、原位、實時情況下，對活細胞的分子結構與分布狀態(tài)進行測定并三維成像的技術與方法。表面增強拉曼成像技術結合了SERS的靈敏度和共聚焦顯微拉曼的高空間分辨率，使得發(fā)展一種用于活細胞內(nèi)分子實時動態(tài)監(jiān)測的成像手段成為可能。HSERI具有提高高通量分析和直接成像的能力，能為化學分析提供更多有用的信息58。激光拉曼光譜技術是一種非侵入性的光散射技術，能夠無損、無須任何標記物標記情況下提供豐富的分子結構和物質(zhì)成分的信息。特

29、別是激光共焦拉曼散射顯微三維掃描技術，可以100nm的橫向分辨率實現(xiàn)對活細胞內(nèi)有關分子的結構組成，濃度與分布的二維以至三維分布的測定與成像，還可實現(xiàn)對這些參數(shù)隨細胞內(nèi)外有關條件改變的動態(tài)變化作監(jiān)測。采用這種技術，對各種狀態(tài)的活態(tài)人紅細胞內(nèi)，其血紅蛋白的分布狀態(tài)，從脫氧到含氧狀態(tài)的動態(tài)過渡；淋巴細胞在有關因子（如射頻電磁波、UV 射線等）作用下，其 DNA、蛋白、多肽等分子的結構變化及其分布狀態(tài)的變化成像的有關技術與方法。包括對活態(tài)細胞分子結構與分布成像的掃描技術、掃描參數(shù)的優(yōu)化，以及為保證所得樣品拉曼譜線的真實、可靠性進行的系統(tǒng)性能快速測試、校正方法研究。將顯微激光共焦拉曼光譜技術用于活態(tài)細胞

30、檢測時的優(yōu)化實驗參數(shù)。在這些研究基礎上，結合小曝光積分時間對剔出譜線外來干擾，并以歸一化結合基線校正法對譜線作后處理的方法，建立一種將強度匹配技術和模型匹配技術相結合的二維拉曼成像技術。并發(fā)展出簡易的活態(tài)紅細胞由T態(tài)到R態(tài)的躍遷速率測定技術，測量分析出血紅蛋白結構隨有關條件變化而動態(tài)變化的情況，由此證明不同胞齡紅細胞具有不同的攜氧能力；揭示了不規(guī)則細胞內(nèi)分子會在畸形位置處聚集的現(xiàn)象。表面增強拉曼光譜技術與拉曼顯微成像相結合的表面增強拉曼顯微成像將為生物芯片的原位檢測提供有效手段54, 59, 60。結語在其他技術的配合下，SERS標記免疫檢測將不斷地得到更新與進步，從而作為一門獨特的新技術在生

31、物醫(yī)學及其他領域的研究中發(fā)揮越來越大的作用。表面增強拉曼光譜作為一種分子結構表征手段，在生物醫(yī)學領域中的應用方興未艾。從近十年的研究進展來看，不論是體表的乳腺和皮膚組織還是體內(nèi)的胃腸道等器官，都已經(jīng)實現(xiàn)或者正在努力實現(xiàn)體內(nèi)檢測；不論是單個細胞的激光拉曼捕集檢測還是組織切片的二維拉曼掃描，都可以清晰地獲得與組織形態(tài)學相關的偽彩色拉曼圖像。因此可以預料，隨著表面增強拉曼光譜技術在生物醫(yī)學領域中的廣泛應用，將會迎來它歷史上發(fā)展的第三個春天。參考文獻：1. Pettinger B. Adsorption at Electrode Surface M, New York: VCH, 1992: 2852

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