Westernblot試驗?zāi)康膚estern技術(shù)是用來檢測蛋白表達(dá)的特定的

1、Westernblot 實驗?zāi)康?western 技術(shù)是用來檢測蛋白表達(dá)的特定的靈敏的方法。 原理 與 Southern 或 Northern 雜交方法類似， 但 WesternBlot 采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，探針”是抗體，顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過 PAGE 分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛

2、應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。 三、操作步驟（一）樣品處理 1 培養(yǎng)的細(xì)胞： 去培養(yǎng)液后用溫的 PBS 沖洗 23 遍（冷的 PBS 有可能使細(xì)胞脫落）。 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上 1020min。 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在 EP 管后超聲（100200w）3s,2 次。 （4）12000g 離心，4C,2min。 取少量上清進(jìn)行定量。 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加 loadingbuffer 后直接上樣最好， 剩余溶液（溶于 1Xoadingbuffer）可以低溫儲存，-70C 一個月，-20C 一周，4c1-2天,每次上樣前 98C,3min。 或收取細(xì)胞于 EP 管中

3、加入適量的 1XSDS,吹勻，100 度 5min,重復(fù)一次。 1200rpm,10min.取上清定量。 3.組織： 勻漿對于心肝脾腎等組織可每 50100mg 力口 1ml 裂解液，肺 100200mg 加 1ml 裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 12000g 離心，4C,2min。 取少量上清進(jìn)行定量。 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度， 充分混合沉淀加 loadingbuffer 后直接上樣最好， 剩余溶液 （溶于 1Moadingbuffer）可以低溫儲存，-70C 一個月，-20C 一周，4c12 天，每次上樣前98C,3min。 由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新

4、鮮蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加 Na3VO40.1mM 及 NaF25mM）。 1loadingbuffer 配方：10%甘油，50mMTrisCl（pH6.8）,2%&琉基乙醇，0.20.5%澳酚藍(lán)，2%或 5%的 SDS。Buffer 可配成 2 墳 5%注意 SDS 終濃度勿超過 10%。 對于心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用 5%的 SDS,肝腎等組織 2%即可。） （二）配膠1 .注意一定要將玻璃板洗凈，最后用 ddH2O 沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。 分離膠及濃縮膠均可事先配好（除 AP 及 TEMED 外），過濾后

5、作為儲存液避光存放于 4C,可至少存放 1 個月，臨用前取出室溫平衡加入 10%AP 及 TEMED. 2 .封膠： 灌入 2/3 的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度10%時可用 0.1%的 SDS 封，濃度10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用 0.1%的 SDS。封膠后切記，勿動。本實 驗室一般用水或異丙醇封膠。 待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及 ddH2O 沖洗干凈，然后加少量 0.1%的SDS,目的是通過降低張力消除殘留水滴。片刻后倒掉 SDS,將玻璃板倒立放置片刻控凈。 3.封好濃縮膠后 1h 拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。 撥出梳

6、子后用 ddH2O 沖洗膠孔兩遍以去除殘膠即可上樣， 長時間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內(nèi)部分子的排列尚未完成。 （10%的 AP 最好現(xiàn)配現(xiàn)用， 如在 4c 存放勿超過兩周。 30%的丙烯酰胺如有沉淀， 最好棄掉.） 各種分離膠 M種組價名林 各種凝膠體松所 對購的各種紈份的取樣錄 5nil lOttil 151111 2011U fioGrl HP 26 VA 一Q in5 iJ?AcivlaiticL? 1 !: 4 L5MliHel(pH8.B) U 2.5 丸g 5.0 10%9DS 0E5 0IC C.15 0.20 10%AP 0.05 010 115 0.2D TH

7、MFD 0CK14 nn-is 0017 0.016 的nCfl H2O T- 4,6 6S 9J 30?oAciylamcle 13 2-7 4 5;- I5MTi-Hcl(pH53) 13 2.5 3S 50 i Lf0 010 L c、. 10?oAP 0.05 010 0.15 020 IEMED O.OOJ o.oos 0009 0.012 10oGel H2Q 15 41 5.S) 75 3Q?uAciylannde 17 33 5 6.7 15MTriHclCpHS31 15 2弋 3.3 50 !。%$口， 0.05 0.10 0.15 O.2D 109AP 0.05 0.10

8、 0.15 O.2D ILMED 0.002 Q.(E 0.006 o.cos 1Z*oGI H2O 1.6 5J 4.9 66 S。oAciyiamide 7 4 6 8 L5MTtii-Hd：pH3.8- 13 J 3.3 5.0 IOHSDS 。3 o.ii) Q; O.2D lOuAP 005 口10 015 0.20 TEMED 0.002 。 由。4 O.OOS o.ocs 15%GM H2O 1.1 2.3 3.4 4.6 PrtAciyl.nrnde 25 S(1 了.5 U1) 1.5MIm-HclCpHS.K 1.J 工x 3.3 5(J 10?SDS 0.05 0.10

9、0.15 O.2D 10KAP 0.05 O.LO 0.15 0.20 TEVED 0002 0004 OOOfi 0CiOS 5%濃緬腹 一種組份弘稱各刊舉上收休日班對應(yīng)的的取樣吊 lull 2nd Sull hid 5LLI1 MtJ Sui lOuil 0.68 1.40 210 250 340 4.10 5,50 8月 imide 033 050 0.6 0S3 1.00 130 1.7 1.5MTris-Hcl(pHSS) 0.13 。一” OSS 050 063 I00 1.25 0.01 0.02 003 038 005 0.06 0,08 0.10 10%AP 0.01 0.0

10、2 0心 。的 005 0.06 008 0。 TFNfED 0.001 0W2 0003 0005 0006 n.fms I-UHO (三)電泳 1 .上樣前將膠板下的氣泡趕走。 2 .在需要的地方加入 marker(Fermentas)3ul 所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣或上等 量的蛋白，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的 1loadingbuffer 上樣，Marker 也用 1loadingbuffer 調(diào)整至與樣品等體積。 3 .以初始電壓為 100V 強(qiáng)度進(jìn)行電泳， 當(dāng) marker 分開后換用 150V 至距膠下緣 1cm 以上結(jié)束。 （四）轉(zhuǎn)膜 毗轉(zhuǎn)印槽的鎖歷程股支架轉(zhuǎn)印央系蛇口轉(zhuǎn)印央（

11、1）支撐麟膠（2）印跡膜（3兩側(cè)有纖維村墊和油紙H）確保海膠三明治內(nèi)的完全接觸口掇膠夾垂直插入緩沖液槽中Q 1 .電泳結(jié)束前 10min 戴上手套開始準(zhǔn)備： 浸泡 NC 膜：將 NC 膜平鋪于去離子水面，靠毛細(xì)作用自然吸水后再完全浸入水中 10min 以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF 膜則在 M-OH 中浸泡 20min 以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。 2 .取膠： 將膠卸下，保留 30-100KD 或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)一張（干轉(zhuǎn)每側(cè)三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾

12、紙與膜的過多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路） 3 .轉(zhuǎn)股： 濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入轉(zhuǎn)膜液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。100 伏 80min 左右，注意不同蛋白的要求不同。 干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以 1.5mA/cm2 凝膠面積轉(zhuǎn)移 1-2h。負(fù)載電壓不宜超過 1V/cm2 膠面積。 （五）封閉 5%脫脂奶，室溫 1h。 （六）免疫反應(yīng) 1 用 TBST 洗膜刈/5min. 2 加入一抗，4c 放置 12hr 以上。 3 棄一抗，用 TBST 洗膜 M 4

13、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗平穩(wěn)搖動,室溫 1h。 棄二抗，用 TBST 洗膜 X3/5min. （七）顯色 現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光 ECL 和底物 DAB 呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光 ECLo 只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操 作也比較簡單，原理如下（二抗用 HRP 標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到 HRP,即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。 本實驗室用 FUJI 儀器進(jìn)行掃描膜（具體見儀器使用說明）四、主要試劑 1、烯酰胺和 N,N-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)內(nèi)稀酰胺和 1%(w/

14、v)N,N-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺 29g,N,N-亞甲叉雙丙稀酰胺 1g,加 H2O 至 100ml。)儲于棕色瓶，4c 避光保存。嚴(yán)格核實 PH 不得超過 7.0,因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。 2、十二烷基硫酸鈉 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O 去離子水配制，室溫保存。 3、分離膠緩沖液：1.5mol/LTris-HCL(pH8.8):18.17gTris、水 75ml 再加 HCL 至 pH8.8,加水稀釋到 100ml 終體積。 4、 濃縮膠緩沖液：1mol/LTris-HCL(

15、pH6.8):12.11gTris 溶于 75mlH2O 中， 用 HCL 調(diào)至 pH6.8加水稀釋到 100ml 終體積。這兩種緩沖液必須使用 Tris 堿制備，再用 HCL 調(diào)節(jié) PH 值，而不用 Tris.CLo 5、TEMED 原溶液：實驗室有商品化的可直接用。 6、2SDS 加樣緩沖液:pH6.80.5mol/LTris 緩沖液 8ml,甘油 6.4ml,10%SDS12.8ml,琉基乙醇3.2ml,0.05%澳酚藍(lán) 1.6ml,H2O32ml 混勻備用。按 1:1 或 1:2 比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮 3min 混勻后再上樣，一般為 20-25ul,總蛋白量 100 小田

16、7、Tris-甘氨酸電泳緩沖液：30.3gTris,188g 甘氨酸，10gSDS,用蒸儲水溶解至 1000ml,得0.25mol/LTris-1.92mol/L 甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋 10 倍。 8、轉(zhuǎn)移緩沖液：配制 1L 轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取 2.9g 甘氨酸、5.8gTris 堿、0.37gSDS 并加入200ml 甲醇，加水至總量 1L。 或 10 洋專膜液：Tris 堿 30.28,甘氨酸 150.14 至 800ml. 9、麗春紅染液儲存液：麗春紅 S2g 三氯乙酸 30g 磺基水楊酸 30g 加水至 100ml 用時上述儲存液稀釋 10 倍即成麗春紅 S 使用液。使用后應(yīng)予

17、以廢棄。 10、脫脂奶粉 5%(w/v)0 11、BST20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/NACL.Tween 按 1：1000 加入。 12、過化物酶標(biāo)記的二抗。 五.常見問題 1 .如何選擇最合適的蛋白雜交膜？ 解答：蛋白質(zhì)印跡雜交是分子生物學(xué)實驗中極為常用的一門技術(shù)。選擇質(zhì)量上層、 合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項實驗成敗的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方案、 被轉(zhuǎn)移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。 硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實驗的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電

18、荷的蛋白質(zhì)會與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，雖然這其中的機(jī)制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的這個特性，而且易于封閉非特異性結(jié)合，從而得到了廣泛的應(yīng)用。在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小， 膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。 但是膜孔徑如果小于 0.1mm,蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行了。因止匕，我們通常用 0.45 小和 0.2 小兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于 20kD 的蛋白就可以用 0.45 的膜，小于 20kD 的蛋白就要用 0.2 的膜了，如果用 0.45 小的 膜就會發(fā)生

19、“Blowthro 仙布現(xiàn)象。 從膜的質(zhì)地上來看， 最重要的指標(biāo)就是單位面積上能夠結(jié)合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結(jié)合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，市場上有些硝酸纖維素膜通常會還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結(jié)合量。S&S 公司采用的是 100%純度的硝酸纖維素，保證了最大的蛋白結(jié)合量，可達(dá) 80-150 仙 g/cm2 由于 100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結(jié)合，降低雜交背景，無需高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗脫步驟。其次，膜的強(qiáng)度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反復(fù)使用。PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF 是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來制

20、造水管的。PVDF 膜可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可以分離小片段的蛋白質(zhì)，最初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測定，因為硝酸纖維素膜在 Edman 試劑中會降解，所以就尋找了 PDVF 作為替代品，雖然 PDVF 膜結(jié)合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品，一直沿用至今。PVDF 膜與硝酸纖維 素膜一樣，可以進(jìn)行各種染色和化學(xué)發(fā)光檢測，也有很廣的適用范圍。這種 PVDF 膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細(xì)工藝下比常規(guī)的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇進(jìn)行浸泡飽和 1-5 秒鐘。 離子交換型轉(zhuǎn)移膜：硝酸纖維素和 PVDF 膜是靠疏水作用結(jié)合蛋白的，還有一類膜是根據(jù)離子交換的方式結(jié)合生物大分子的。由 DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的 DEAE陰離子交換膜同樣可以作為蛋白質(zhì)印跡的固相支持物。 DEAE 可以有效的結(jié)合陰離子基團(tuán)，包括那些高于其等電點的蛋白質(zhì)。在 pH10 以下，DEAE 基團(tuán)都能帶電荷，在低離子強(qiáng)度的轉(zhuǎn)移液中結(jié)合蛋白分子。其最適的 pH 環(huán)境為 5-7。DEAE 膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種 0.45N 磯徑的 DEAE 膜，除了可以做 WesternBlot