堿性磷酸酶的分離純化鑒定

1、堿性磷酸酶的分離純化有機(jī)溶劑分步沉淀法有機(jī)溶劑分步沉淀法分離純化的一般程序分離純化的一般程序選擇材料選擇材料破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞提取提取分離純化分離純化分析及鑒定分析及鑒定 AKP AKP溶于溶于30%30%乙醇、乙醇、33%33%丙酮（丙酮（上清上清中），中）， AKPAKP不溶于不溶于60%60%乙醇、乙醇、50%50%丙酮（丙酮（沉淀沉淀中），中），原理：操操 作作一、取材及勻漿一、取材及勻漿 取兔肝取兔肝2g，剪碎，剪碎， 加入加入6ml 0.01mol/L醋酸鎂和醋酸鈉醋酸鎂和醋酸鈉混合液，充分混合液，充分勻漿。勻漿。 記錄體積記錄體積 （?。ㄈ?.1ml至一新至一新EP管留作管留作A液

2、，測(cè)定時(shí)稀釋液，測(cè)定時(shí)稀釋25倍倍）二、提取二、提取 加入加入2ml正丁醇，攪拌正丁醇，攪拌2min，室溫放置，室溫放置30min。過(guò)。過(guò)濾，濾，留上清留上清。計(jì)體積。計(jì)體積。三、分離純化三、分離純化1、50丙酮沉淀丙酮沉淀AKP 加入加入等體積等體積丙酮，丙酮，3000rpm5min，留沉淀，留沉淀， 加加4ml 0.5mol/L醋酸鎂溶解沉淀，醋酸鎂溶解沉淀，記錄體積記錄體積。 （取（取0.1ml留作留作B液液，稀釋，稀釋10倍倍）2、30乙醇溶解乙醇溶解AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入95乙醇乙醇0.46ml 2000rpm5min，留上清留上清（記錄體積記錄體積）3、60乙醇沉淀乙

3、醇沉淀AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入95乙醇乙醇0.86ml 3000rpm5min，留沉淀，留沉淀， 加加3ml 0.5mol/L醋酸鎂溶解沉淀，醋酸鎂溶解沉淀，記錄體積記錄體積。 （?。ㄈ?.1ml留作留作C液，液，使用時(shí)稀釋使用時(shí)稀釋5倍倍）4、33丙酮溶解丙酮溶解AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入0.33ml丙酮丙酮 2000rpm5min，留上清留上清（記錄體積記錄體積）5、50丙酮沉淀丙酮沉淀AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入0.36ml丙酮丙酮 3000rpm15min，留沉淀，留沉淀， 5ml Ph8.8的的Tris-醋酸鎂醋酸鎂溶解沉淀溶解沉淀 （D液，不稀釋液，不

4、稀釋）四、分析及鑒定四、分析及鑒定1、堿性磷酸酶的活性測(cè)定（磷酸苯二鈉法）、堿性磷酸酶的活性測(cè)定（磷酸苯二鈉法）2、堿性磷酸酶蛋白含量測(cè)定（、堿性磷酸酶蛋白含量測(cè)定（BCA法）法）3、比活性及純化倍數(shù)計(jì)算、比活性及純化倍數(shù)計(jì)算分光光度法分光光度法（Spectrophotometry）根據(jù)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光線具有選擇性吸收根據(jù)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光線具有選擇性吸收（即可產(chǎn)生吸收光譜）的特性而建立起來(lái)的一種（即可產(chǎn)生吸收光譜）的特性而建立起來(lái)的一種定量定量、定性定性分析的技術(shù)。也稱為吸收光譜法分析的技術(shù)。也稱為吸收光譜法（Absorption spectrometry）。）。不需要把欲分析的樣品從混合

5、物中分離開(kāi)來(lái)不需要把欲分析的樣品從混合物中分離開(kāi)來(lái)（一）基本原理（一）基本原理 光具有波粒二相性。光具有波粒二相性。波長(zhǎng)和頻率是光的波動(dòng)性的特征。波長(zhǎng)和頻率是光的波動(dòng)性的特征。1、光的基本知識(shí)、光的基本知識(shí)紫外分光光度計(jì)（紫外分光光度計(jì)（200400nm）可見(jiàn)光分光光度計(jì)可見(jiàn)光分光光度計(jì)（400760nm）紅外分光光度計(jì)紅外分光光度計(jì)（7601000nm）2、 定量分析的理論基礎(chǔ)定量分析的理論基礎(chǔ) LambertBeer定律定律A KLC吸光度吸光度 (Aabsorbance,A )消光度消光度 (degree of extinction,E )光密度光密度 (optical density,

6、D )K- 吸光系數(shù)吸光系數(shù), ,是物質(zhì)的特征性常數(shù)。是物質(zhì)的特征性常數(shù)。o 對(duì)比法進(jìn)行定量分析對(duì)比法進(jìn)行定量分析A樣樣 = K L C樣樣A標(biāo)標(biāo) = K L C標(biāo)標(biāo)A樣樣A標(biāo)標(biāo)K L C樣樣K L C標(biāo)標(biāo)C樣樣C標(biāo)標(biāo)C樣樣 = A樣樣 C標(biāo)標(biāo) / A標(biāo)標(biāo)o 單色光、平行光（單色光、平行光（maxmax）o 溶液均勻、清澈、無(wú)散射溶液均勻、清澈、無(wú)散射o 溶液性質(zhì)穩(wěn)定，比色皿中無(wú)化學(xué)反應(yīng)溶液性質(zhì)穩(wěn)定，比色皿中無(wú)化學(xué)反應(yīng)o 適用于稀溶液（適用于稀溶液（A 0.2-0.7）LambertBeer定律的適用范圍：定律的適用范圍：o 溶劑空白：溶劑空白： 當(dāng)顯色劑及所用其它試劑在測(cè)定波當(dāng)顯色劑及所用其

7、它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)都沒(méi)有吸收峰時(shí)，可用純?nèi)軇╅L(zhǎng)都沒(méi)有吸收峰時(shí)，可用純?nèi)軇? (如蒸餾水如蒸餾水) )作作參比溶液。參比溶液。o 試劑空白試劑空白： 當(dāng)顯色前的樣品在測(cè)定波長(zhǎng)沒(méi)有吸當(dāng)顯色前的樣品在測(cè)定波長(zhǎng)沒(méi)有吸收峰，而顯色劑或其它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收峰，而顯色劑或其它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收時(shí)，可用不加入樣品的收時(shí)，可用不加入樣品的“試劑空白試劑空白”作參比作參比溶液，這種方式最為常用。溶液，這種方式最為常用。參比溶液的選擇參比溶液的選擇 基本組件及常見(jiàn)分光光度計(jì)基本組件及常見(jiàn)分光光度計(jì)分光光度計(jì)的使用分光光度計(jì)的使用1. 打開(kāi)電源預(yù)熱打開(kāi)電源預(yù)熱15分鐘分鐘2. 選擇波長(zhǎng)（選擇波長(zhǎng)（ max ）

8、3. 光標(biāo)指向光標(biāo)指向Trans4. 打開(kāi)光門，調(diào)節(jié)打開(kāi)光門，調(diào)節(jié)0；關(guān)上光門調(diào)節(jié)；關(guān)上光門調(diào)節(jié)1005. 重復(fù)重復(fù)4一次一次6. 將光標(biāo)指向?qū)⒐鈽?biāo)指向ABS7. 讀數(shù)讀數(shù)磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉堿性磷酸酶堿性磷酸酶苯酚苯酚 + + 磷酸鹽磷酸鹽堿性堿性苯酚苯酚 + 4-+ 4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉 + + 鐵氰化鉀鐵氰化鉀紅色醌式化合物紅色醌式化合物AKP活性測(cè)定基本原理磷酸苯二鈉法活性測(cè)定基本原理磷酸苯二鈉法單位（單位（ml）空白管空白管 標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管 A B C D 各階段稀釋液各階段稀釋液酚標(biāo)準(zhǔn)液（酚標(biāo)準(zhǔn)液（0.1mg/ml）Tris-醋酸鎂醋酸鎂復(fù)合底物液復(fù)合底物液 / / 0.1

9、0.1 0.1 0.1 / 0.1 / / / / 0.1 / / / / / 3 3 3 3 3 3酶活性單位酶活性單位 （U/ml）= A樣樣 A標(biāo)標(biāo)0.1 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)37保溫保溫 15分鐘分鐘各管加入鐵氰化鉀液各管加入鐵氰化鉀液2ml，靜置，靜置15min510nm 比色比色酚標(biāo)準(zhǔn)液濃度酚標(biāo)準(zhǔn)液濃度稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) (PH8.8tris醋酸鎂溶液醋酸鎂溶液 ） / / 25 10 5 1蛋白含量測(cè)定基本原理蛋白含量測(cè)定基本原理BCA法法蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)+Cu 2 堿性堿性BCA試劑試劑紫色化合物紫色化合物Cu二喹啉甲酸，BCA單位（單位（ml）空白管空白管 標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管 A B C D 各階段稀釋液各階段稀釋液蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（0.2mg/ml） 蒸餾水蒸餾水BCA試劑試劑 / / 0.1 0.1 0.1 0.1 / 0.1 / / / / 0.1 / / / / / 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5蛋白含量（蛋白含量（mg/ml） = A樣樣 A標(biāo)標(biāo)0.2 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)37保溫保溫 30分鐘分鐘562nm 比色比色蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) (PH8.8tris醋酸鎂溶液醋酸鎂溶液 ） / / 50 20 5 1堿性磷酸酶比活性（