分子雜交原理及探針制備

1、分子雜交原理及探針制備一、分子雜交基本原理 1953年，Watson和Crick提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)學(xué)說。DNA這一線性的高分子化合物靠一些非共價鍵折迭形成三維空間構(gòu)象。這些非共價鍵都是比較弱的鍵，易受外力的作用而斷裂，導(dǎo)致空間構(gòu)象的破壞，使有規(guī)則構(gòu)型的DNA變成不規(guī)則的線團，此過程稱為DNA變性。DNA變性時，維系雙鏈的氫鍵也發(fā)生斷裂而形成兩條互補的單鏈DNA。引起核酸變性的因素有酸、堿、熱、某些變性劑（如尿素、甲酰胺等）和某些有機溶劑都可引起DNA變性。 根據(jù)DNA變性的程度與溫度的關(guān)系，可繪制融解曲線。變性的DNA達到總量1/2時的溫度稱為融解溫度（Tm）。Tm值受溶液中離子的種

2、類、離子強度、DNA中堿基組成的均一性以及G-C堿基對含量等因素的影響。 變性的DNA兩條互補單鏈，在適當重新締合成雙鏈的過程為DNA復(fù)性或退火。復(fù)性后兩條單鏈又重新按照堿基互補的原則結(jié)合起來，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，其理化性質(zhì)和部分生物活性恢復(fù)。 兩條DNA單鏈之間能否復(fù)性，并不取決于這兩條鏈是否同源，而取決于它們的堿基序列是否互補。如果兩條來源不同的DNA單鏈具有互補的堿基序列，也同樣可以復(fù)性形成一個雜交體，這個過程即雜交，或稱分子雜交。 RNA的化學(xué)組成與DNA相似，也有堿基、戊糖和磷酸三種成分，所不同的是戊糖為核糖，堿基中尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶（T），其他三種堿基與DNA分子中的相同。分子雜

3、交不僅可發(fā)生在兩條DNA單鏈之間，而且也可發(fā)生在具有互補堿基的DNA和RNA片段之間，或RNA與RNA片段之間，即有DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。 分子雜交是在一定條件下以變性DNA或RNA單鏈作模板，另一DNA或RNA單股寡核苷酸與其堿基互補而生成雜交復(fù)合體的過程。二、基因探針 探針廣義上是指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測的分子，例如抗原-抗體、生物素-親和素等均可看成是探針與靶分子的相互作用。基因探針是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補雜交，雜交后又能被特殊方法檢測的已知被標記（同位素或非同位素標記）的核苷酸鏈。由于基因探針已與核酸樣

4、品中具有互補序列的核酸片段退火雜交。因此已廣泛用于基因克隆篩選、酶切圖譜制作、基因突變、DNA序列分析以及某些臨床診斷等方面。（一）基因探針種類和選擇基因探針是分子雜交中用于樣品特定的DNA或mRNA序列定位的關(guān)鍵物質(zhì)。根據(jù)來源與性質(zhì)不同已分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、cRNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等5類。選擇探針的原則是要有高度特異性，其次也需考慮制備探針難易性和檢測手段的靈敏性等其他因素。2. 探針的選擇 一般探針越長，雜交作用越強，其專一性也越強。但自動合成儀合成的探針最適長度常有一個上限，約為50bp。三、基因探針標記方法（一）、標記物 探針標記物有放射性同位素

5、和非放射標記物兩大類。1. 放射性同位素 放射性特同位素標記物是目前應(yīng)用最多的，因其靈敏度高，已標測到10-1410-18g物質(zhì)。此外放射性同位素與相應(yīng)的元素具有完全相同的化學(xué)性質(zhì)。因此對各種酶促反應(yīng)無任何影響，且不會影響堿基配對的特異性、穩(wěn)定性及雜交性質(zhì)。由于標記探針具有放射性，故標記反應(yīng)可用閃爍記數(shù)器監(jiān)測；雜交信號用敏感性高的放射自顯影技術(shù)標測，信號的強弱通過計數(shù)銀粒的多少易于進行定量分析。主要缺點是射線對人體有傷害作用，操作時需要有一定 的防護措施，放射性物質(zhì)需要特殊的處理以及常用放射性核素的半衰期短不宜存放使用。2. 非放射性標記物 由于放射性同位素標記探針的局限性，人們一直在尋找非放

6、射性標記物，目前常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）和生物素（biotin）。雖非放射性標記探針的敏感性不如同位素標記，但其穩(wěn)定性和分辨率更高，且標測時間短、操作簡便，不需特殊的防護設(shè)備，更重要的是不存在放射性污染。似有取代放射性同位素標記物的趨勢。三、標記法 探針標記法有酶反應(yīng)法和化學(xué)反應(yīng)法兩大類，但以酶反應(yīng)法較常用。1. 切口平移法 切口平移標記法先由胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機切口，大腸桿菌DNA聚合酶I作用以切口處開始，以另一條DNA鏈為模板，以4種三磷酸脫氧核苷酸為原料，沿切口水解5端核苷酸和3端修復(fù)加入標記核苷酸同時進行，切口平行推移，可均一標記DNA鏈。2. 引物延

7、伸法 本法與切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶來合成與模板互補的新的DNA鏈。由于DNA聚合必須從具有3-OH的末端開始合成，因此與切口平移不同，引物延伸法需要一段與模序列互補的寡聚核苷酸作引物，將它與模板雜交，以提供3-OH端。3. 末端標記法 末端標記法是將標記法導(dǎo)入線型DNA或RNA的5端或3端的一類標記法。（1） 5端標記法 T4多聚合苷酸激酶能（2） 3端標記法 T4DNA聚合酶4. 體外轉(zhuǎn)錄法分子雜交技術(shù)分子雜交大致可分為液相雜交和固相雜交兩類。一、 液相分子雜交 液相分子雜交是最早使用的方法。其原理是將參加液相雜交的兩條核酸鏈都游離在溶液中，在一定條件下（溶液的離子強度、溫度、

8、時間等）進行雜交，然后再將未雜交的探針除去，即得到雜交后的核酸分子。二、 固相分子雜交固相分子雜交是將帶冊的靶核苷酸鏈預(yù)先固定在固體支持物上，而標記的探針則游離在溶液中，進行雜交反應(yīng)后，使雜交分子留在支持物上，故稱固相雜交。其可通過漂洗能將未雜交的游離探針除去，留在膜上的雜交分子容易被檢測，能防止靶DNA的自我復(fù)性，故被廣泛應(yīng)用。1. Southern印跡雜交 膜上檢測DNA的雜交技術(shù)，1975年由Edwin Southern建立。利用這一技術(shù)可進行克隆基因DNA的酶切圖譜分析，基因組中某一基因的定性與定量分析、基因點突變及限制性片段長度多態(tài)性分性等。（1）Southern毛細管印跡法 將適量

9、待測DNA樣品經(jīng)限制性內(nèi)切酶降解，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，堿處理使凝膠中的DNA變成單鏈，然后利用毛細管虹吸原理使凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，因本法轉(zhuǎn)印效率不高，目前，采用快速、簡便、轉(zhuǎn)印效率高的電轉(zhuǎn)印和真空轉(zhuǎn)印等。（2）雜交 轉(zhuǎn)移至固相膜載體上的DNA片段可通過與探針雜交進行檢測分析。2. Northern印跡雜交 是應(yīng)用DNA探針檢測特異mRNA的一種雜交技術(shù)，由Alwine于1977年建立，后經(jīng)Thomas等人改進，主要用于分析mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子大小，其方法類似于Southern印跡雜交。二、原位雜交 將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交并對其實行檢測的方法稱為原位雜交（hybridization in situ)。 根據(jù)所用的探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標記物是否能直接被檢測，原位雜交可分為直接法和間接法兩種。直接法原位雜交，探針與組織細胞內(nèi)靶核酸所形成的雜交體不經(jīng)免疫組織化學(xué)即可直接顯示。反之，間接原位雜交一般都用半抗原標記探針，而探針與組織內(nèi)靶核酸所形成的雜交體則通過免疫組織化學(xué)對半抗原的定位間接地顯示。 原位雜交技術(shù)不需要從組織中提取核酸。僅要求將細胞或石蠟包埋的組織切片、活組織的切片置于載玻片上，固定，加甲酰胺等使核酸變性后，可