DNA RNA 蛋白質(zhì)等各種生物物質(zhì)的保存

1、各種生物活性物質(zhì)的保存Experience 2009-08-16 16:34:36 閱讀336 評論0  字號：大中小 訂閱DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗體和探針的保存方法：（網(wǎng)上搜索，僅供參考_）1.DNA      短期保存，兩年之內(nèi)吧，無菌水和TE緩沖液是ok的。如果是長期保存，比如10年20年的話，我推薦你剛提取好的DNA直接保存到乙醇里，放20°，放10年沒問題。需要用的時候，再離心后，棄去乙醇，加水或TE溶解即可。    

2、60; 長期保存用TE，DNA本來就是酸性，所以需要弱堿性環(huán)境保存，如果用中性或者酸性環(huán)境保存容易降解。保存兩年應(yīng)該會降解的！還是不要超過兩年，再一年內(nèi)都有降解的可能，所以還是要盡快的利用了。做成干粉不太可能，哪里有那么多的量！還是在80度以下保存吧，也要避免反復(fù)凍融。       如果DNA很純的話，應(yīng)該影響不是很大啊，有文獻(xiàn)報道高純DNA的最佳保存條件是4度，你也可以應(yīng)證一下你的DNA有沒有降解啊，跑個電泳看看啊，如果出現(xiàn)smear，就不要用了?。?#160;      

3、  提純的DNA放在4度一段時間（數(shù)周-數(shù)月）都沒問題。但是長期保存建議-20度，并且濃度不要稀釋的太低，否則容易降解。   2.RNA      RNA若要長期保存,需沉淀下來后置于無水乙醇凍在-70度,用的時候再離心下來除去無水乙醇,用DEPC水溶解。      保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA

4、，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鐘。      RNA即使是放在-80度下也會降解，所以最好的保存方法是將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA后保存。

5、60;     提取的RNA保存在DEPC處理的水中，加入RNAse抑止劑，在-80度保存2個月，應(yīng)該是可以保證不降解的。最好是反轉(zhuǎn)錄后保存。      一旦生物樣品被收集采摘，離體組織的RNA會立刻變得非常不穩(wěn)定，極易被降解。由于特異及非特異的RNA降解，或者由于樣品采集過程中的應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生新的RNA都會引起RNA狀態(tài)的改變。對于生物芯片、基因表達(dá)矩陣分析（Array Analysis）、定量RT-PCR等實(shí)驗(yàn)來說，采樣后立即穩(wěn)定樣品里的RNA以保存當(dāng)時RNA的表達(dá)狀態(tài)，是精確/定量研究基因表達(dá)分析的重

6、要前提。記得以前學(xué)植物遺傳的同學(xué)常常要帶著液氮罐，騎著單車到田里采樣那個液氮罐的蓋子有點(diǎn)問題，一顛就冒白煙，嚇得一路上行人、車輛紛紛躲避，很是招搖，據(jù)說有一次覺得液氮不夠了，趕著坐出租回來，那可是連哄帶騙才上了的士，到學(xué)校時司機(jī)已經(jīng)緊張得面無人色了這真令貪玩的我們非常羨慕，只恨這等趣事怎么就落不到我們頭上。對當(dāng)事人來說，每周一次帶著液氮罐到處跑實(shí)在不算一種有趣的經(jīng)歷。沒有辦法，為了保持樣品的RNA完整真實(shí)，要么當(dāng)場提RNA，要么液氮保存，一直如此。不過自從有了RNAlater，這種有趣的場面就會越來越少了。      RNAlater是特殊的樣

7、品儲存液，只要在采樣后立即將新鮮樣品浸入這種液體試劑，RNlater可以迅速滲透到組織或其他生物樣本中，穩(wěn)定并保護(hù)RNA完整而不被降解，確保下游分析得到的數(shù)據(jù)真實(shí)反應(yīng)樣品的表達(dá)信息。樣品儲存液中保存的新鮮樣品可以在不超過37度的高溫天氣下保存一天，或者在25度室溫下保存一周；或者4度冰箱存放一個月；或者負(fù)20度長期保存而使RNA保持完整免受降解。這種技術(shù)為在不同溫度和不同地點(diǎn)下的采樣、運(yùn)輸和保存樣品提供了極大的方便，同樣適合手術(shù)/解剖過程中部分樣品的保存。    RNAlater的用法非常簡單，只要在采樣后立即將樣品完全浸入適量（10ul/1mg組織或者5倍體積）

8、的RNAlater中即可。取樣的動作要盡量快速利索，組織樣品的大小以厚度不超過0.5公分為宜。對于一些小的組織如小鼠的脾、腎等器官則可以整個取出浸入溶液中，較大的則應(yīng)切開為厚度小于0.5公分的小塊，以確保RNAlater 能迅速擴(kuò)散滲透入組織塊中的所有細(xì)胞中。采樣的容器應(yīng)該足夠大以容納10倍于組織重量的溶液，避免組織塊擠在一起，同時建議將溶液加滿容器以避免在運(yùn)輸過程中組織塊露出液面。    保存在RNAlater中的樣品RNA可以:· 37下穩(wěn)定保存1天· 18-25保存7天· 2-8穩(wěn)定4周· -20永久保存3.蛋白質(zhì)&#

9、160;     辛辛苦苦純化得到的那么一點(diǎn)蛋白，可千萬不能因?yàn)椴欢迷趺幢４娑装桌速M(fèi)了！選擇什么樣的貯存方法取決于該蛋白的穩(wěn)定性和你打算保存多長時間以及下一步你打算如何利用。一般來說，蛋白溶液應(yīng)避免極端的pH（強(qiáng)酸or強(qiáng)堿），同時也不能接近其等電點(diǎn)的pH。另外，還應(yīng)該避免其他物質(zhì)的摻入。      如果保存時間在24h以內(nèi)，大多數(shù)蛋白可以放置到4。如果保存時間在24h以上，應(yīng)該考慮避免蛋白溶液長菌，可以事先過濾一下（through a 0.22 m filter）或者加入抑菌的物質(zhì)（如疊氮化鈉）。&#

10、160;      如果保存時間超過一周，則應(yīng)該將蛋白溶液冷凍起來。通過液氮或干冰冷凍的方法使蛋白溶液迅速冷凍，可以有效避免蛋白的變性。為避免多次凍溶致使蛋白活性降低或變性，應(yīng)該將蛋白溶液分裝保存，一次用多少就取多少。除此之外，還可以加入一些甘油(5-50% (w/v)或者血清(10 mg/ml)幫助目的蛋白保持穩(wěn)定。      如果打算保存數(shù)月之久，則需要將其放置于20，此時要加入一定量甘油，避免“凍傷”。       另外，還可以用

11、硫酸銨將蛋白沉淀置于4保存（損失較多，不建議采用）；也可以將蛋白以干粉狀態(tài)保存（保存時間最久）。-      新提取的蛋白可以分裝存在-80度冰箱 ，保存（保險系數(shù)）1年，如果加入buffer煮過的蛋白在-20保存。最好提取的蛋白，一部分保存，一部分立刻加Buffer煮，做實(shí)驗(yàn)。-蛋白的穩(wěn)定性及保存方法PIERCE公司技術(shù)資料Proteins comprise an extremely heterogeneous class of biological macromolecules. They are often unstable when n

12、ot in their native environments, which can vary considerably among cell compartments and extracellular fluids. If certain buffer conditions are not maintained, extracted proteins may not function properly or remain soluble.Proteins can lose activity as a result of proteolysis, aggregation and subopt

13、imal buffer conditions. Purified proteins often need to be stored for an extended period of time while retaining their original structural integrity and/or activity. The extent of storage shelf life can vary from a few days to more than a year and is dependent on the natu of the protein and the stor

14、age conditions used. Optimal conditions for storage are distinctive to each protein; nevertheless, it is possible to suggest some general guidelines for protein storage and stability. Common conditions for protein storage are summarized and compared below.Generally, there are tradeoffs associated wi

15、th each method. For example, proteins stored in solution at 4 can be dispensed conveniently as needed but require morediligence to prevent microbial or proteolytic degradation; such proteins may not be stable for more than a few days or weeks. By contrast, lyophilization allows for long-term storage

16、 of protein with very little threat of degradation, but the protein must be reconstituted before use and may be damaged by the lyophilization process.       -問：純化后的蛋白質(zhì)4度保存約15天，怎么分子量發(fā)生了變化？答：蛋白質(zhì)樣品如果是溶液狀態(tài)的，在4度下頂多保存一個禮拜。15天太長了。估計分降解成很多小蛋白。電泳時出現(xiàn)很多條帶。在-20度也就是保存一個月。最好的保存辦

17、法還是將蛋白樣品凍干成粉末。保存，這樣保存的時間會很長。如果條件不具備，-70度也可以。蛋白樣品最忌諱反復(fù)凍融。答：蛋白保存應(yīng)根據(jù)對活性的要求及蛋白的種類而定：抗體:除非一些公司特別要求-20凍存，一般4可穩(wěn)定一年（無菌，如加疊氮鈉），因?yàn)榭贵w是一種具有非常穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的蛋白；要求具有活性的蛋白,最好根據(jù)需要小量保存4(一周）、-20(一個月)、-80(六個月)、液氮（基本無限期），反復(fù)凍融會導(dǎo)致諸多不良后果，如聚集、修飾、降解、污染等（取決于蛋白濃度、緩沖液成分及蛋白本身的特點(diǎn)）；凍干是一種很好的長期保存法（如條件具備），在大多數(shù)情況下可以很好地保存蛋白的活性，但不適于某些蛋白（因有些蛋白對凍干

18、重溶時必然產(chǎn)生的鹽離子濃度的急劇變化反應(yīng)不佳，其活性會永久喪失（應(yīng)具體對待，尚無規(guī)律可循）。另：蛋白聚集與二硫鍵形成是兩個概念，巰基乙醇只負(fù)責(zé)維持-SH的游離狀態(tài)，形成二硫鍵是一化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生純凈物，聚集一般只通過一些離子鍵、范德華力、疏水力形成，可以用物理方法分開。答：較長時間的保存最好用DTT。在加入緩沖液中24小時內(nèi)，巰基乙醇被氧化，其后可加速蛋白的失活，而DTT不危及蛋白質(zhì)的巰基。因此，最好是在制備蛋白質(zhì)樣品的時候用大約12mmol/L巰基乙醇，而長期儲存則使用1-5mmol/L的DTT。（見蛋白質(zhì)技術(shù)手冊）另外，我有印象看產(chǎn)品目錄的時候，看到有一種用于western的試劑盒，提供的試

19、劑可以在還原二硫鍵之后在巰基上烷基化，這樣就防止了二硫鍵的再次生成。4.抗體     抗體儲存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低（10-100Mg/L），就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。       絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4-8條件下，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)。抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，

20、應(yīng)絕對避免用高溫快速解凍。       被細(xì)菌污染的抗體常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20以下可保存3-5年。       保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當(dāng)，可在4下保存數(shù)月。 -      其他注意事項： 

21、60;    分裝可以最大程度的降低反復(fù)凍融對抗體活性的損害，同時也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用完為好，最少不能少于10ul每份。因?yàn)榉盅b體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。       復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4oC，避免再凍起來！ 抗體工作液應(yīng)該當(dāng)天配制當(dāng)天用完，在4oC 盡量不要超過1天。絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。盡量將抗體保存在冰箱里層，而不是門上。     無論

22、是保存還是運(yùn)輸，絕對避免反復(fù)凍融！反復(fù)凍融會導(dǎo)致抗體變性，導(dǎo)致多聚體形成，從而降低抗體的結(jié)合能力！-      蛋白在高濃度時更不容易降解（1 mg/ml 或者更高），這就是為什么在抗體中加入BSA之類作為穩(wěn)定劑的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以減少抗體由于管壁吸附所造成的損失。但是如果抗體要用來標(biāo)記的話，則不能加入蛋白穩(wěn)定劑，因?yàn)檫@些穩(wěn)定劑會和抗體一起競爭結(jié)合標(biāo)記物。-      為了防止微生物污染，疊氮化鈉經(jīng)常被加入到抗體中（終濃度0.02% (w/v)）。 疊氮化鈉會干擾任何含有氨基基團(tuán)

23、的偶聯(lián)，因此在進(jìn)行偶聯(lián)之前，應(yīng)將疊氮化鈉去除。偶聯(lián)后的抗體可以加入疊氮化鈉保存，但是濃度只能是0.01。對于需要偶聯(lián)的抗體，thimerosal (merthiolate)可以替代疊氮化鈉作為保護(hù)劑！注：疊氮化鈉的去除方式：       可以通過凝膠電泳或過濾的方式去除！IgG的分子量是150kDa (IgM 是 600kDa); 疊氮化鈉的分子量只有65Da。使用cut off 14kDa的濾膜即可將疊氮化鈉從抗體中去除。      純化IgG: 不要保存稀釋的抗體,高濃度有利于保存

24、。IgG會粘附于玻璃或塑料，低于0.1mg/ml的蛋白會很快被吸收并變性失去活性。-      下面是我的讀書筆記，內(nèi)容全部摘錄自Using Antibodies這本書。該書中專門有Handling Antibodies這樣一個章節(jié)，對于像我這樣的入門級還是很有啟發(fā)的。      首先要樹立的一個觀念是“抗體可一點(diǎn)兒都不脆弱，很強(qiáng)悍的”。 “Antibodies have a compact three-domain structure that has evolved to reta

25、in activity in most biological settings. One practical advantage of such compact and stable protein domain is that they are resistant to a broad range of mildly denaturing conditions, making long-term storage of antibodies relatively easy. Storage buffers seldom need to be supplemented with glycerol

26、 or other stabilizing compounds that are commonly added to help maintain the activity of proteins purified in the lab.”經(jīng)常使用的抗體可以4保存；長期保存可以置于-20。“Working solutions of antibodies are conveniently stored at 4. At this temperature they are stable for months to years without loss of activity. For long-te

27、rm storage, antibodies can be kept conveniently at -20 in the serum, tissue culture supernatant, or ascitic fluid in which they are collected. Lower temperatures will not hurt the antibody activities, but there is no significant advantage in lower-temperature storage.”也有例外，不是所有抗體在4都穩(wěn)定，有些得在常溫保存。“The

28、only group of antibodies that should not be stored at 4 are the so-called cryoproteins, which are sensitive to low-temperature storage, where they precipitate. Some mouse antibodies of the IgG3 subclass may fit these characteristics. If antibodies precipitate at 4 over time, they should be kept at r

29、oom temperature with addition of sodium azide.”盡管抗體很穩(wěn)定，還是要避免反復(fù)凍融，因?yàn)樗赡茉斐煽贵w活力的喪失。原因是.“Antibody solutions should not be frozen and thawed repeatedly, because this can lead to denaturation of antibodies that may lead to unwanted protein-protein aggregation. Aggregation of antibodies can cause the loss

30、of activity due to steric interference of the antigen combining site or by generating insoluble material that is lost during centrifugation or filtration.”抗體到底可以保存多長時間？什么？十年？“Antibodies are remarkably stable. If tightly sealed to avoid evaporation, they can be stored at 4 for months with no loss of

31、activity. Antibodies stored at -20 have been shown to keep their activity for decades.”這么強(qiáng)悍！那，抗體到底怕什么？“The only problem commonly encountered in storing antibodies is contamination of these solutions with bacteria or fungi. This can be prevented by addition of antimicrobial agents; for example, by ad

32、ding sodium azide to 0.02% or, as an alternative, Merthiolate to 0.01%.”何時需要添加疊氮化納？什么時候又不能添加？“Although useful and effective for most settings, sodium azide is not appropriate in some assays, because it blocks the cytochrome electron transport system and therefore is toxic to most organisms. In addit

33、ion, the primary amine on the azide would attack the stability of the antibody's interaction with conjugate or matrix in coupling methods. If sodium azide is already present in a solution, it can be removed by dialysis or gel filtration.”自己純化的抗體，保存的時候要注意什么？Purified preparations of antibodies are stable in most commonly used buffers.