食品生物技術導論結(jié)課論文

1、食品生物技術導論結(jié)課論文題作者姓名：田童童專業(yè)：班級：學號：2009113248【摘要】建立在DNA 雜交基礎上的基因探針技術是現(xiàn)分子生物學中的一種常規(guī)技術。用基西探針技術檢測食品中的有害鏇生物具有特異性強、靈敏度高和操作簡便、省時等優(yōu)點。近年來，有關非放射性基園探針、DNA生物侍感器探針及分子信標探針等技術研究取褥的重要進展，必將加速基因探針技術在食品擻生物檢測中的應用。奉文對多種基哥探針的技術原理與研究應鬲概況及最新進展進行了綜述討論?！娟P鍵詞】基因探針技術應用發(fā)展近幾十年來，隨著分子遺傳學的不斷發(fā)展和基因工程技術的廣泛應用，人們清楚地認識到，核苷酸序列含有生命有機體構(gòu)成、維持生命必須的遺

2、傳信息。不同種生物含有不同的DNA 序列，同種生物含有相同的DNA 序列，并且這種核苷酸順序是相對穩(wěn)定的，可以用來檢測遺傳病和鑒定樣本中的微生物。所謂基因探針，是能識別特異堿基序列(基因的有標記的一段單鏈DNA(或RNA分子，也可以說一段與被測定的核苷酸序列(靶序列互補的帶標記的單股核苷酸?；蛱结樇夹g的發(fā)展和應用為傳染病診斷、流行病學調(diào)查、食品衛(wèi)生檢驗、腫瘤和人類遺傳病早期檢測等工作打開了一個新的局面，達到了特異性強、敏感度高、簡便和快速的目的。一、DNA探針技術研究進展自1975年Southe1"11首次提出DNA 探針雜交技術以來，DNA探針技術在許多方面都已獲得了改進和發(fā)展，

3、并已成為現(xiàn)代分子生物學中一種基本技術。目前所使用的DNA 探針雜交方法總體上可以分為2類：一是異相雜交(heterogeneousassay即固相雜交技術；二是同相雜交(homogeneousassay即液相雜交技術。另外根據(jù)DNA 探針的標記方法可分為放射性標記探針和非放射性標記探針。異相雜交技術1. Southern 印跡法Southern 印跡法(Southernblotting是最早的DNA 探針雜交技術，由英國分子生物學家Southern 所發(fā)明。Southern印跡法的全過程見圖1。首先將從待檢測樣品中提取的DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切酶降解后，用瓊脂糖凝膠電泳進行分離。將帶有DNA 片段

4、的瓊脂糖凝膠浸泡在堿中使DNA 變性然后將變性的DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在80下烘烤46h，使DNA 牢固地 吸附在膜上，然后與放射性標記的DNA 探針進行雜交數(shù)小時后，通過洗滌除去未雜交的DNA 撩針。將硝酸纖維素膜烘干后進行放射白顯影，雜交結(jié)果即可在x 光片上顯示出來。圖1Southern 印跡法原理示意圖2.非放射性DNA 探針最早使用的DNA 探針都是用同位素標記的。目前，放射性標記探針仍然是許多實驗中常用的DNA 探針，其中使用最多的是放射性標記元素P。用來標記的同位素的放射性強度越高。信噪比也就越高，結(jié)果越好。但是P 有一些其自身難以克服的缺點，一是壽命短，其半衰期只有13d

5、；二是操作起來比較危險；三是要求有特殊的實驗操作設備；四是放射性廢棄物的處理十分繁瑣。為此人們研究開發(fā)了非放射性DNA 探針檢測方法。目前比較常見的非放射性DNA 探針檢測系統(tǒng)是通過酶促反應將特定的底物轉(zhuǎn)變?yōu)樯镔|(zhì)或化學發(fā)光物質(zhì)而達到放大信號的目的。具體操作時大多采用將生物素(bjotin標記的核苷酸摻入到DNA 的方法制備探針操作過程(見圖2大致如下：(1將生物素標記的探針雜交到目標DNA 上去；(2加入抗生物素蛋白(avidin或鏈霉抗生物素蛋白(streptavldin；(3加入一種經(jīng)生物素標記的酶，如過氧化物酶或堿性磷酸酶；(4根據(jù)不同的酶，加入不同的生色或化學發(fā)光的底物，根據(jù)顏色變

6、化或化學發(fā)光來檢測雜交結(jié)果。圖2非放射性DNA 探針檢測原理示意圖3.DNA 生物傳感器探針DNA 生物傳感器探針技術是近年來發(fā)展起來的一項新技術。目前研究使用的大部分DNA 生物傳感器探針的技術原理是將DNA 探針固定在支持體的表面，通過檢測DNA 探針與特定的目標DNA 的專一性雜交而產(chǎn)生的光、電等信號的變化考查DNA 探針的雜交情況。與一般的異相雜交技術相比DNA生物傳感器探針技術中省去了對DNA 探針進行放射性同位素標記或酶標記的處理。而且很多DNA 生物傳感器裝置可以實現(xiàn)對DNA 探針雜交過程的實時監(jiān)測。目前，人們已用石英晶體微天平、表面等離子體子共振等技術構(gòu)造DNA 生物傳感器lj

7、J，獲得了較好的結(jié)果。下面以金欽漢等最近報道的干擾素表面等離子體子共振(surfaceplasmon resolance，SPRDNA 生物傳感器為例說明其工作原理及大致過程ljJ。該裝置以碘鎢燈作光源，同時檢測400800m波長范圍內(nèi)反射光強度與入射波長的關系。利用生物素親和素系統(tǒng)的相互作用將DNA 探針固定于金膜表面(見圖3，通過測定雜交過程中體系的共振波長的變化值，考查DNA 探針的雜交情況。 圖3利用生物素一親和素系統(tǒng)固定DNA 探針的原理示意圖同相雜交1.雙探針常規(guī)技術固相雜交中探針非特異結(jié)合于支持物表面，降低了靈敏度。同相雜交技術最早由HeHer 和Mirrison 提出，該項技術

8、的特點是不髂要支持物減少了固定DNA 以及去除未雜交DNA 等操作。常規(guī)的同相雜交技術中使用了2個探針，這2個探針分別與目標DNA 的2個相鄰區(qū)域互補。第1個探針在3末端標記第2個探針在5末端標記，利用標記物的光譜特性。使第一標記物為第二標記物的能量供體。當探針與目標DNA 雜交時，2個探針彼此靠近，通過光吸收或化學反應激發(fā)供體標記物并通過能量轉(zhuǎn)移I 起受體標記物的激發(fā)，因此通過測定第一標記物發(fā)射光的減少或第二標記物發(fā)射光的增加即可定量考查DNA 探針的雜交情況。另外一種雙探針同相雜交技術所采用的2個探針的堿基互補，且與目標DNA 上的同序列相對應。將一個探針的5末端標記熒光素，另一互補探針的

9、3未端標記熒光素淬滅劑。當無目標DNA 時，兩探針結(jié)合，熒光素的能量轉(zhuǎn)移至淬滅劑，不產(chǎn)生熒光。存在目標DNA 時，探針與目標DNA 之間競爭雜交，并在494496D_lll光照下產(chǎn)生熒光。熒光信號的強度與目標DNA 的濃度成正比。2.分子信標探針同相雜交一般同時采用2個標記探針最近Tyagi 等首次建立了分子信標探針(molecularheaconprobe，即在同一探針的5末端標記熒光紊，3末端標記熒光紊淬滅劑。分子信標探針的工作原理如下：當無目標 DNA 時，DNA 探針由于兩端堿基的互補配對而形成發(fā)夾 結(jié)構(gòu)，使熒光紊靠近淬滅劑，熒光紊接受的能量通過共振轉(zhuǎn)移至淬滅劑，淬滅劑吸收能量后以 熱

10、量形式散失，結(jié)果不產(chǎn)生熒光。當有目標 DNA 存在時，由于分子標探針的嚕撲環(huán)與目標 DNA 的堿基互補，因此通過與目標 DNA 的分子雜交，形成了比發(fā)夾結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的雜交雙鏈 DNA 分 子，探針的構(gòu)型同時發(fā)生改變，使兩臂分開，熒光紊和淬滅劑也隨之分開，此時在紫外光下， 熒光紊產(chǎn)生熒光。Sanjay 用與嚕撲環(huán)完全互補且等長的 DNA 與分子信標探針雜交，發(fā)現(xiàn)當目 標 DNA 中有一個堿基錯配或缺失時，均不產(chǎn)生熒光，因此認為只有完全互補的 DNA 才能與分子 信標探針雜交，可見分子懵標探針具有高度特異性。 二、基因探針的基礎理論 DNA 探針是一個含有特異核苷酸序列的帶標記的單鏈 DNARNA

11、 片段。利用這個片段可以 檢測在臨床標本中存在的與其互補的序列。DNA 雜交技術因能夠檢查與探針互補的特異序列而 具有高度的特異性。微生物種屬的鑒定，完全取決于事先能夠獲得一個與被鑒定微生物特異序 列互補的 DNA 或 RNA 片段。通常 DNA 是雙鏈，然而在適當?shù)臈l件下(離子強度、DH 和溫度， 雙鏈能夠變性(分離，當條件改變，這兩條分離的鏈又可發(fā)生復性，即互補序列重新結(jié)合，因 此，可采用標記的特異 DNA 序列(DNA 探針，與臨床標本培養(yǎng)物或臨床標本中的 DNA 互補序列 (靶序列直接進行雜交(形成雙鏈。在合適的條件下，RNA 也能與互補 DNA 鏈雜交。 1.基因探針技術原理 基因探

12、針或 DNA 探針技術檢測微生物的依據(jù)是核酸雜交，其工作原理是 2 條堿基互補的 DNA 鏈在適當條件下可以按堿基配對原則，形成雜交 DNA 分子。已知每個生物體的各種性質(zhì)和 特征都是由其所含的遺傳基因所決定的，倒如一種微生物的病原性就是由于這種微生物含有并 表達了某個或某些有害的基因而產(chǎn)生的。從理論上講，任何一個決定生物體特定生物學特性的 DNA 序列都應該是獨特的。如果將某一種微生物的特征基因 DNA 雙鏈中的一條進行標記，例如 用 P 同位紊標記，即可制成 DNA 探針。由于 DNA 分子雜交時嚴格遵守堿基配對的原則，通過 考查待測樣品與標記性 DNA 探針能否形成雜交分子，即可判斷樣品

13、中是否含有此種微生物并 且還可以通過測定放射性強度考查樣品中微生物數(shù)量。 2. 基因探針的特性 構(gòu)建一個 DNA 探針的設想是非常重要的，這包括要選擇一個適當?shù)陌泻吞结樂肿?，使能獲 得最理想的結(jié)果，達到診斷的目的。敏感性高。敏感性是指探針能精確檢出 DNA 或 RNA 的最 小量，從臨床觀點講，是指探針能精確檢出微生物的最小數(shù)量。這可通過探針對不同濃度的微 生物的最小數(shù)量檢測出來確定。DNA 探針具有非常高的敏感性，如檢測一個單基因僅需要 104 拷貝，而且單克隆測定至少需要 1d 抗原分子；應用腸毒素 LT(不耐熱毒素和 sT(耐熱毒 素DNA 探針，檢測腸毒素源性大腸桿菌引起的腹瀉，其敏感

14、性比 Y 一 1 腎上腺細胞和乳鼠實 驗高 1 萬倍；特異性強。在臨床上，特異性是指探針能夠從混合標本中正確鑒定目的微生物 的能力。鑒定結(jié)果可直接由臨床標本中獲得，或可對通過培養(yǎng)或選擇性培養(yǎng)已初步鑒定的微生 物做出確診。DNA 探針的檢測技術是建立在探針與待檢驗核苷酸堿基序列同源性的基礎上，其 本身就決定了探針的特異性是很強的； 簡便快速。為了對嚴重疾病的及時診斷和治療，在 大量臨床待檢驗標本集中的實驗室，使用一種簡便快速的檢驗方法非常重要。近年不斷發(fā)展起 來的 DNA 探針診斷技術，可以很好地解決這個問題，他如同在茅草堆里找一根針樣，可以幫助 人們迅速地查明目標，故稱之為“神奇”的 DNA

15、探針。 三、展望 雖然目前傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法仍然是檢測食品微生物時常用的方法，但存在檢測成本高 費時等缺點，對大部分微生物來說，用傳統(tǒng)方法檢測至少需要45 d時間。有些致病微生物甚 至無法進行人工培養(yǎng)。利用微生物生理生化特性鑒別微生物的傳統(tǒng)方法在實際應用時也遇到越 來越多的同題。例如利用葡糖苷酸酶活性鑒別檢測大腸桿菌是目前美國和日本等國采用的標準 方法，但已發(fā)現(xiàn)幾種大腸桿菌菌株因uidA基因突變而產(chǎn)生假陰性檢測結(jié)果 ，而樣品中存在的 其它一些微生物則因含有該酶活性，而使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性?？梢娧芯扛涌焖?、準確的微 生物檢測方法具有十分重要的意義。DNA探針雜交與PCR聯(lián)合使用檢測食品微生物具

16、有特異性 強、靈敏度高及操作簡便快速等特點將是今后食品微生物檢測技術的一個重要研究方向。目前 利用DNA探針技術檢測食品中的微生物巳取得了不少重要成果。美國的Gene-Trak 公司(Gene Trak IncFraminham，Massachusetts，USA巳開發(fā)出檢測大腸桿菌的商品化DNA探針系 統(tǒng)。以PCR擴增大腸桿菌的目標DNA，在用DNA探針雜交檢測，不需要進行微生物分離培養(yǎng)，最 快可以在1h內(nèi)完成檢測操作，檢測靈敏度為100個大腸桿菌細胞每g或每mL食品樣品。如與免疫 等其它技術聯(lián)用，還可以使檢測靈敏度大大提高。美國環(huán)保署早在1990年就已正式使用DNA探 針雜交技術檢測飲用水

17、中大腸桿菌總數(shù)。近年來隨著DNA生物傳感器探針等新技術的研究不斷 取得進展，可望在不遠的將來開發(fā)出一種DNA探針檢測儀，用于食品微生物的快速檢測，最終 實現(xiàn)對食品產(chǎn)品的現(xiàn)場及在線檢測。雖然我國目前利用DNA探針技術檢測食品中微生物的研究 報道尚不多見，但是隨著現(xiàn)代分子生物學技術的快速發(fā)展，特別是基因測序技術的發(fā)展，各種 新的DNA探針檢測技術的出現(xiàn)，將會使該項技術在食品微生物檢測中得到更加廣泛的應用，也 將吸收國內(nèi)更多的研究者加入到這一領域中來。 【參考文獻】 1王翔，錢微，楊澤田. 維甲酸對喉癌細胞株 Hep2 的生長及癌基因的抑制作用J. 癌癥, 1995,(03 . 2錢止維,李玉英,楊

18、新科,毛淑娟,邵幸曙,周園,史連永,段淑敏,侯云德. 子宮頸糜爛病毒病 因的探討J. 病毒學報, 1987,(01 . 3胡裕文,宇文鎬,楊新科,侯云德,胡鋼,段淑敏. 我國痘苗病毒天壇株基因組左端限制酶位點 的變異J. 病毒學報, 1987,(01 . 4吳淑華,侯云德,金奇,張鵬,張麗蘭,張智清. 人干擾素 N 端序列的變異與其抗病毒活性的 關系J. 病毒學報, 1988,(02 . 5金奇,陳悅,劉絳光,黎志良,金冬雁,侯云德. 我國痘苗病毒疫苗株(天壇25kb 核苷酸序列 及其與非疫苗株(WR差異的比較J. 病毒學報, 1988,(04 . 6黎志良,金奇,宇文鎬,金冬雁,侯云德. 我國痘苗病毒天壇株血凝素基因全序列