可吸收性材料CPP生物安全性評價

1、    可吸收性材料CPP生物安全性評價            作者：時間：2007-11-22 11:30:00                            

2、    作者：楊團民，張慶華，薛金山，賀增良，李毅，焦寧，張文【關(guān)鍵詞】  聚磷酸鈣纖維；可吸收性植入物；毒理學(xué)；安全性Biological security evaluation of an absorbable CPP material【Abstract】 AIM: To evaluate the biological security of a new kind of absorbable CPP material used for internal fixation of fracture. METHODS: Maximal tolerant d

3、ose of CPP was determined by intraperitoneal (ip) injection of its extractives to mice, and micronucleus test of bone marrow cells, spermatic aberration test, chromosomal aberration test, and teratogenic test were done by ip injection of maximal tolerant dose of CPP to evaluate its biological securi

4、ty. CPP intramuscular implantation was performed to observe its surrounding tissue reaction and evaluate its biological compatibility. RESULTS: Maximal tolerant dose of CPP extractives was above 40 mL/kg, and this dose did not have any obvious effects on micronucleus rate of bone marrow cells (1.36&

5、#177;0.27), chromosomal aberration rate (1.94±0.46)%, spermatic aberration rate (1.51±0.37)% and teratogenic rate (1.84±0.55)% when compared with controls. CPP intramuscular implantation also did not cause obvious surrounding tissue inflammatory reaction. CONCLUSION: CPP is a new safe

6、 medical material with good tissue compatibility.【Keywords】 calcium polyphosphate fibers; absorbable implants; toxicology; security【摘要】 目的: 評價CPP材料的生物安全性. 方法: 采用聚磷酸鈣（CPP）材料萃出液腹腔注射（IP）最大允許劑量，進行了該材料最大耐受量測定，并用IP最大耐受量進行了小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸變試驗、小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗、致畸試驗等毒理學(xué)試驗，評價其安全性；同時采用體內(nèi)肌肉包埋法，觀測其對對周圍組織的反應(yīng)，對CPP材料生

7、物相容性進行評價. 結(jié)果: CPP材料萃出液的最大耐受量大于40 mL/kg，最大耐受量的CPP對小鼠骨髓細(xì)胞微核率(1.36±0.27)，小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率（1.94±0.46)%和小鼠精子畸變率（1.51±0.37）%，致畸試驗畸發(fā)率(1.84±0.55)%和對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，CPP材料肌肉包埋后組織反應(yīng)不明顯. 結(jié)論: CPP材料是一種安全而理想的可吸收性生物醫(yī)用材料.【關(guān)鍵詞】 聚磷酸鈣纖維；可吸收性植入物；毒理學(xué)；安全性0引言為研制可吸收性高強度骨折內(nèi)固定復(fù)合材料，我們選用在化學(xué)和晶體學(xué)特征上與人體骨礦物質(zhì)相

8、近的聚磷酸鈣（calcium polyphosphate, CPP）,經(jīng)熔融抽絲工藝制得可吸收性高強度復(fù)合材料增強物CPP纖維，為判定其是否滿足醫(yī)用要求，我們參照國內(nèi)外相關(guān)文獻，采用CPP材料萃出液腹腔注射最大允許劑量，進行了該材料毒理學(xué)試驗；同時采用體內(nèi)肌肉包埋，觀測其對組織學(xué)的反應(yīng)，對CPP材料安全性進行評價.1材料和方法1.1材料1.1.1聚磷酸鈣纖維制備1-2采用化學(xué)成分與人體骨礦物質(zhì)成分相近的化學(xué)純磷酸二氫鈣(或偏磷酸鈣)為主要原料，通過添加適量的穩(wěn)定劑S和阻降劑M，置于坩堝中，一并放入自制的拉絲爐中，緩慢升溫至1000. 原料先變?yōu)榘咨勰?繼而成為液態(tài),然后使其緩慢冷卻,在冷卻過

9、程中以自制拉絲機拉絲，用熔融拉絲的方法，制備出聚磷酸鈣纖維. 以19JA型萬能工具顯微鏡測得單絲直徑在5250 m范圍內(nèi)，密度為2.3 g/cm3.1.1.2動物昆明種健康小鼠（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），體質(zhì)量1822 g；健康新西蘭兔(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，體質(zhì)量2.02.5 kg.1.2方法1.2.1CPP材料萃出液的制備參照文獻3，取直徑50 m CPP纖維30 cm，經(jīng)滅菌處理后，放入100 mL無菌生理鹽水中，37下密閉溫育72 h，制備萃出液備用.1.2.2CPP材料萃出液最大耐受量測定按國標(biāo)（GB1519394）4方法進行. 昆明種小鼠20只，雌雄各半

10、，體質(zhì)量1822 g, 禁食而不禁水12 h后腹腔注射CPP復(fù)合材料萃出液每1 kg質(zhì)量40 mL，觀察7 d內(nèi)動物反應(yīng)及死亡情況.1.2.3小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗按國標(biāo)（GB1519394）4方法進行. 昆明種小鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量1822 g, 隨機分為CPP試驗組（IP最大耐受量的CPP萃出液）、陰性對照組（生理鹽水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg）共三個試驗組. 每日IP給藥1次，共7次，于末次給藥后6 h脫臼處死，取胸骨制成骨髓涂片，Gimsa染色，每只小鼠計數(shù)嗜多染紅細(xì)胞1000只，計算微核發(fā)生的千分率.1.2.4小鼠精子畸變試驗按國標(biāo)（GB1519394）4方法進行.

11、 體質(zhì)量2535 g雄性小鼠30只，分組給藥同1.4微核試驗. 陽性對照用乙酰水楊酸，于末次給藥后6 h用頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側(cè)副睪，放入盛有適量生理鹽水（1 mL）的平皿中. 用眼科剪將副睪縱向剪12刀，靜置35 min，輕輕搖動. 用四層擦鏡紙過濾，吸濾液涂片. 于空氣中干燥后，甲醇固定. 用1020  g/L伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥. 在低倍鏡下找到背景清晰、精子重疊較少的部位，用高倍鏡順序檢查精子形態(tài)，計數(shù)結(jié)構(gòu)完整的精子. 每只小鼠至少檢查1000個精子. 以便統(tǒng)計精子畸形率.1.2.5小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗按國標(biāo)（GB1519394）4方法進行. 分組給藥同

12、1.4微核試驗. 陽性對照組小鼠處死前24 h，按4 mg/kg體質(zhì)量腹腔注入秋水仙素. 小鼠頸椎脫臼處死，取股骨，去除附著的肌肉，剪去兩端骨骺，用帶針頭的注射器吸取24 mL 22 g/L檸檬酸鈉溶液，將骨髓洗入10 mL離心管中，反復(fù)沖洗數(shù)次直至股骨斷面由紅色變粉色，然后以10001500 r/min離心10 min，棄去上清液. 離心后的細(xì)胞沉淀物加入4 mL 75 mmol/L氯化鉀溶液低滲處理，用新配制甲醇冰乙酸固定液固定，細(xì)胞懸液制片，Giemsa染色，空氣中自然干燥后鏡檢. 每只動物分析100個中期相細(xì)胞，每組不少于1000個中期相細(xì)胞. 觀察染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)改變.1.2.6致畸

13、試驗按國標(biāo)（GB1519394）4方法進行. 健康性成熟昆明種小鼠，雌性60只，雄性30只，按二雌一雄合籠交配，將每天檢出的受孕雌鼠，按微核試驗平均隨機分配，每劑量組受孕鼠為20只. 每劑量組的孕鼠檢出精子的當(dāng)天作為受孕0 d，于小鼠孕期615 d給藥，陽性對照為乙酰水楊酸. 于孕期第20日將孕鼠頸椎脫臼處死，剖檢子宮及胎仔，檢查胎仔有無畸形.1.2.7肌肉包埋試驗將自制CPP制成直徑為2 mm，長10 mm的柱狀體，環(huán)氧乙烷消毒備用. 用常規(guī)骨水泥(PMMA)制成同樣大小的棒材作對照. 取健康新西蘭兔12只，體質(zhì)量2.02.5 kg，手術(shù)前1 d背部脊柱兩側(cè)備皮，戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈麻醉，取

14、背部正中縱行切口，鈍性分離右側(cè)豎脊肌，植入CPP棒材共4枚，平行于脊柱，離中線25 mm，各植入物間隔約25 mm， 同法在對側(cè)植入PMMA骨水泥作對照，逐層縫合至皮膚. 于術(shù)后1，4，8，12 wk分別處死動物3只，切取實驗組及骨水泥組周圍肌肉組織做常規(guī)病理切片， HE染色. 觀察材料周圍組織炎癥細(xì)胞變化情況、纖維包膜形成情況及有無肌肉鈣化、壞死. 按國標(biāo)（GB/T 161751996）5對肌肉包埋實驗炎癥細(xì)胞反應(yīng)、纖維囊腔形成進行分級后評價.統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析,經(jīng)檢驗,實驗數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布,故采用x±s表示，組間比較采用KruskalWal

15、lis檢驗,多重比較采用Nemenyi檢驗.2結(jié)果2.1CPP材料萃出液最大耐受量預(yù)試驗結(jié)果    表明，CPP材料基本無毒，測不到LD50；最大耐受量測定結(jié)果表明，一次腹腔注射 CPP材料萃出液每1 kg質(zhì)量40 mL，觀察7 d內(nèi)小鼠未見死亡，也未見異常反應(yīng). 說明CPP材料萃出液對小鼠的最大耐受量大于40 mL/kg.2.2小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗CPP組的微核細(xì)胞數(shù)和陰性對照組相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而環(huán)磷酰胺組的微核細(xì)胞數(shù)，和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1).表1CPP材料萃出液對小鼠微核發(fā)生率的影響

16、（略）2.3小鼠精子畸變CPP組的精子畸變率和陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而陽性對照組的精子畸變率和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2).2.4小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變CPP組的染色體畸變率和陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而陽性對照組的染色體畸變率和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2).2.5致畸CPP組和對照組胚仔外觀和內(nèi)臟發(fā)育未出現(xiàn)明顯畸變. 而乙酰水楊酸組則出現(xiàn)胚仔頭面與身體的畸形如腦露、脊椎裂，側(cè)腦室擴大，腦骨、骨柄、顳骨、蝶骨、枕骨的未骨化和骨化不全等，總畸變率為（80.10±11.

17、00）%（表2）.表2CPP材料毒理學(xué)檢測結(jié)果（略）2.6CPP材料肌肉植入試驗對兔肌肉組織反應(yīng)261實驗動物的大體觀察所有動物均成活，傷口無紅腫，愈合良好，無感染及竇道產(chǎn)生，未見變態(tài)反應(yīng)、中毒及熱源反應(yīng). 手術(shù)傷口愈合良好，未見感染及竇道產(chǎn)生.262試件標(biāo)本的大體觀察術(shù)后1 wk，試件表面光澤稍暗淡，光滑平整；4 wk，試件形態(tài)無變化，透明度稍有降低；8 wk，試件透明度呈不均勻降低，形態(tài)仍無變化；12 wk，試件呈不均勻乳白色，表面光潔度下降， 試件仍完整，表面有點凹狀吸收.263組織切片光鏡觀察CPP棒植入兔豎脊肌后HE染色觀察：1 wk，未見纖維囊形成，可見較多的炎性細(xì)胞浸潤，以中性粒

18、細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，淋巴細(xì)胞相對較多，偶見巨細(xì)胞反應(yīng)(圖1)；4 wk后，可見大量成纖維細(xì)胞形成，炎性細(xì)胞少見，纖維包膜界限較清晰(圖2)；8 wk后，纖維包膜界限清晰，厚度較4 wk時變薄，可見少許淋巴細(xì)胞(圖3). 12 wk膠原纖維致密變薄，成纖維細(xì)胞減少，只見少量淋巴細(xì)胞(圖4). PMMA組肌肉組織學(xué)變化與試驗組無明顯差異. 實驗結(jié)果符合國標(biāo)（GB/T161751996）5中對醫(yī)用有機材料植入生物學(xué)評價試驗的要求，說明材料對周圍組織無刺激性.3討論生物相容性要求醫(yī)用材料植入體內(nèi)后，必須對人體無毒性、無刺激性、無抗原性、無遺傳毒性和致癌性，與組織、細(xì)胞接觸無任何不良反應(yīng). 因此，材料的

19、生物相容性優(yōu)劣是生物醫(yī)用材料研究設(shè)計中首先考慮的重要問題.較多的炎性細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，淋巴細(xì)胞相對較多，偶見巨細(xì)胞反應(yīng).作為體內(nèi)植入的可吸收性生物醫(yī)用材料，對其生物學(xué)特性要求極為嚴(yán)格. 在一種新型材料臨床應(yīng)用前，須完成其毒理學(xué)特性檢測，綜合評定其生物學(xué)特性是否符合醫(yī)用要求6-7. 為此，我們對這一新型材料毒理學(xué)進行了評價，為其應(yīng)用于骨科臨床提供重要的理論依據(jù). 毒理學(xué)實驗結(jié)果表明， 最大耐受量的CPP材料不影響小鼠骨髓細(xì)胞微核率、小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率和小鼠精子畸變率，致畸試驗陰性，說明CPP材料對機體無毒.膠原纖維致密變薄，成纖維細(xì)胞減少，只見少量淋巴細(xì)胞.當(dāng)醫(yī)用材料植

20、入體內(nèi)某一部位時，局部的組織對異物的反應(yīng)屬于一種機體防御性應(yīng)答反應(yīng)，植入物體周圍組織將出現(xiàn)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞聚集，發(fā)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng). 當(dāng)材料有毒性物質(zhì)滲出時，就會出現(xiàn)局部炎癥不斷加劇，嚴(yán)重時出現(xiàn)組織壞死. 植入物在體內(nèi)長期存在時，材料被淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和膠原纖維包裹，形成纖維性包裹，使正常組織和材料隔開. 如果材料無任何毒性，性能比較穩(wěn)定，組織相容性良好，則在0.5 a，1 a或更長時間包裹囊變薄，囊壁中的淋巴細(xì)胞消失，在顯微鏡下只見到很薄的12層成纖維細(xì)胞形成的無炎性反應(yīng)的正常包膜囊.植入試驗是目前國際上通用的評價醫(yī)用生物材料對組織毒性刺激反應(yīng)、生物材料安全性的一種重要的體

21、內(nèi)實驗方法. 在無明顯損傷和感染條件下，若材料中無有害物質(zhì)存在，組織反應(yīng)在早期呈現(xiàn)異物刺激引起的輕、中度炎癥反應(yīng)，2 wk以后轉(zhuǎn)化為慢性炎癥病理變化. 材料中任何低分子物質(zhì)或其他化學(xué)溶劑的存在，都將影響炎癥反應(yīng)時間的長短和囊壁形成的厚薄及疏密. 一些學(xué)者認(rèn)為，將CPC植入體內(nèi)后，能與周圍組織良好共存，未發(fā)現(xiàn)正常生理過程出現(xiàn)改變，未見明顯炎性反應(yīng)， 無異物巨細(xì)胞及排斥反應(yīng)出現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)有致畸性8-12. 本材料植入兔肌肉后亦得出類似試驗結(jié)果，符合標(biāo)準(zhǔn)要求；肌肉內(nèi)植入后早期有輕度炎性反應(yīng)，后期形成薄層包膜，與常規(guī)對照組無明顯差異. 說明CPP材料安全性良好.上述毒理學(xué)檢測及安全性評定結(jié)果表明，CPP

22、材料對機體無毒，對周圍組織反應(yīng)小，并具有良好生物相容性，是一安全而理想的可吸收性生物醫(yī)用材料.【參考文獻】1常青,石宗利,李重庵. 聚磷酸鈣可降解纖維研究J. 環(huán)境科學(xué),1997, 18（2）:52-53.2石宗利,戴剛,李重庵, 等. 一種新型骨組織工程材料CPP纖維的制備和性能J. 蘭州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2001, 37（2）：47-51.3General Tests and Assays: Biological Tests and Assays. The United States Pharmacopeia (USP) 23. The United States Pharmacopeial Convention, Inc. M. 1995: 1650-1720.4GB 1519394，中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品安全性毒理學(xué)評價程序及方法S5GB/T 161751996，（ICS 07.100.10 C48）,中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)用有機硅材料生物學(xué)評價試驗方法S.6Ruhe PQ, Hedberg EL, Padron NT. Biocompatibility and degradation of poly (DLlacticcoglycolic acid)/calcium phosphate cement compo