一種簡(jiǎn)易的豬肉和牛肉分子生物學(xué)鑒別方法研究

1、0引言中國(guó)肉制品市場(chǎng)管理雖然出臺(tái)了很多政策和措施，但大多是關(guān)于肉品質(zhì)、摻水、摻淀粉等其他項(xiàng)目的一些檢測(cè)，關(guān)于各種肉質(zhì)之間的鑒別方面的研究相對(duì)較少1。然而市場(chǎng)上卻有很多假冒牛肉等現(xiàn)象，比如有人拿病死豬肉內(nèi)摻入牛油，裝入塑料袋里冷凍后就變成了“牛肉卷”，此外還涉及到一些民族的宗教信仰問(wèn)題(如在清真食品中摻入豬肉、豬油 。目前檢測(cè)食品和飼料中的動(dòng)物源成份的方法主要有以顯微鏡觀察為基礎(chǔ)的方法；以檢測(cè)蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的方法；以檢測(cè)DNA 為基礎(chǔ)的方法2。以DNA 為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法又分為：核酸探針雜交、PCR-RFLP 分析、DNA 指紋分析和PCR 特異擴(kuò)增。其中以PCR 特異擴(kuò)增最為簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，在實(shí)

2、際應(yīng)用中最為廣泛3-6。雜交探針需要用熒光或放射性物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記；PCR-RFLP 分析法中使用的限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析有諸多不便；指紋分析中DNA 指紋操作難度相對(duì)較大，故這三種DNA 檢測(cè)的方法在實(shí)際檢測(cè)中都較少應(yīng)用，且鑒別方法繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，建立一種簡(jiǎn)捷、快速、有效的鑒別肉品的方法就顯得非常必要了，基金項(xiàng)目：“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃“食品凝膠和風(fēng)味控制技術(shù)開(kāi)發(fā)研究”（2006BAD05A03）。第一作者簡(jiǎn)介：曹黛麗，女，1987年出生，重慶市人，本科生，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)。通信地址：210095南京市衛(wèi)崗一號(hào)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)70信箱，E-mail：caodai-li425。收

3、稿日期：2009-06-23，修回日期：2009-07-02。一種簡(jiǎn)易的豬肉和牛肉分子生物學(xué)鑒別方法研究曹黛麗1，陳超1，宋平1，侯京強(qiáng)1，徐幸蓮2，楊靜靜1，楊德吉1（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京210095，2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京210095）摘要：建立了基于微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別牛、豬肉制品的方法。根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記種間特異性的特點(diǎn)，從Gen-bank 中篩選出牛微衛(wèi)星Sign 和豬微衛(wèi)星標(biāo)記Sign ，并依據(jù)各個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物。提取牛、豬肉各48個(gè)樣品中的DNA 作為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳后得到了各自的目的條帶379bp 和585bp ，根據(jù)目的條帶的出現(xiàn)與否鑒別牛

4、肉和豬肉。該方法進(jìn)行鑒定靈敏度高，特異性好，而且方法簡(jiǎn)單，易于操作，結(jié)果易于判斷。關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星標(biāo)記；PCR ；鑒別；豬肉；牛肉中圖分類號(hào)：TS251.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 論文編號(hào)：2009-1277A Simple Method for Distinction between Pork andBeef by Molecular Biological TechniqueCao Daili 1, Chen Chao 1, Song Ping 1, Hou Jingqiang 1, Xu Xinglian 2, Yang Jingjing 1, Yang Deji 1(1College of Vet

5、erinaty Medicine, Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095;2College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095Abstract:A method was set up based on microsatellites for distinction between pork and beef. According to the inter-species specificity of the m

6、icrosatellites, some loci of bovine and porcine were selected from Gene bank, named Sign and Sign II, and the primers were designed for each microsatellite according to the flanking sequence. The DNA samples were extracted from 48individuals of cattle and pig for PCR reactions, which prod ucts were

7、used to Electrophoresis. The results show that the target strips were observed which were 379bp and 585bp separatively. These strips can identify which sample from cattle or pig. This method is accurate, specific, quick and simple, and the result is easily judged. Key words:microsatellite, PCR, dist

8、inction, pork, beef 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)2009,25(18:110-112Chinese Agricultural Science BulletinNNNNNNPPPPPPM379bp 150bp400bp300bp 200bp 100bp而使用特定微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行PCR 特異擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定就符合這些要求。動(dòng)物產(chǎn)品中存有基因組DNA ，可以作為檢測(cè)的靶序列7。該試驗(yàn)根據(jù)微衛(wèi)星的位點(diǎn)特異性特點(diǎn)，篩選牛和豬的特異性微衛(wèi)星標(biāo)記，以其側(cè)翼保守序列設(shè)計(jì)出引物，試圖建立一種簡(jiǎn)便的PCR 技術(shù)鑒別肉制品中的牛源性、豬源性成分。1材料與方法1.1樣本的采集在市場(chǎng)上隨機(jī)采集牛和豬肉制品。每種動(dòng)物采

9、集48個(gè)個(gè)體樣本，總共96個(gè)樣本。1.2微衛(wèi)星標(biāo)記的選取及引物設(shè)計(jì)根據(jù)動(dòng)物種間特異性、種內(nèi)品種間無(wú)特異性的原則，篩選出了1個(gè)牛微衛(wèi)星標(biāo)記命名為Sign ，1個(gè)豬微衛(wèi)星標(biāo)記命名為Sign 。根據(jù)Genbank 公布的序列，選擇其側(cè)翼保守序列，用PrimerPrimer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。牛、豬特異性微衛(wèi)星標(biāo)記及引物信息詳見(jiàn)表1。表1牛、豬特異性微衛(wèi)星標(biāo)記及引物信息動(dòng)物種類牛豬微衛(wèi)星標(biāo)記Sign Sign 目的片段長(zhǎng)度/bp379585引物序列上游引物下游引物上游引物下游引物5-CAGACATTCAGGAGCCCTTCACA-35TCCAAGGAGGAGTGCT

10、AAAGTGC-35TTGCGCATTCAGATTTAATTGGTTC-35CTGGGACTATGGGAGTGTAAGGAGC-31.3主要試劑血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒、PCRMix 、MARKER （天根生化科技（北京）有限公司，GOLDView DNA 染色(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司 。1.4儀器PTC-200型PCR 儀（MJ-Research ）、HE-120多功能水平電泳槽（上海天能科學(xué)儀器）、GIS-2500全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科學(xué)儀器）、Anke TGL-16B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、WH-2微型漩渦混合儀震蕩器（上海滬西分析儀器廠）、組織勻

11、漿器。1.5試驗(yàn)方法PCRMix12.5l ，10mmol/L，上、下游引物各1l ，模板DNA 1l ，補(bǔ)水至25l 。2.1牛的特異性微衛(wèi)星標(biāo)記Sign 用選取的牛的特異性微衛(wèi)星標(biāo)記Sign 分別對(duì)牛肉樣本和豬肉樣本進(jìn)行了PCR 特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳后得到了如圖1所示的結(jié)果。此圖表明，所有牛肉樣本都出現(xiàn)了379bp 的目的條帶，所有豬肉樣本都沒(méi)有。圖1牛特異性微衛(wèi)星Sign 電泳結(jié)果注：N ：牛；P. 豬；M ：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（600bp,500bp,400bp,200bp,100bp ）2.2豬的特異性微衛(wèi)星標(biāo)記Sign 用選取的豬的特異性微衛(wèi)星標(biāo)記Sign 分別對(duì)牛肉樣本和豬肉樣本

12、進(jìn)行了PCR 特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳得到了如圖2所示的結(jié)果。所有豬肉樣品都有585bp 條帶，而所有牛肉樣本中都沒(méi)有。說(shuō)明這個(gè)特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)只在豬肉樣本中存在。通過(guò)此微衛(wèi)星標(biāo)記可曹黛麗等：一種簡(jiǎn)易的豬肉和牛肉分子生物學(xué)鑒別方法研究·· 111 3討論試驗(yàn)結(jié)果表明，用牛的特異性微衛(wèi)星標(biāo)記Sign 能明顯鑒別出牛肉，豬肉為陰性；用豬的特異性微衛(wèi)星標(biāo)記Sign 能明顯鑒別出豬肉，而牛肉則為陰性。主要依據(jù)為是否出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶。在對(duì)市場(chǎng)上未知牛肉或豬肉的情況下，對(duì)這兩種肉品能進(jìn)行鑒定，而且應(yīng)當(dāng)把這兩種引物同時(shí)用于PCR 擴(kuò)增，綜合結(jié)果進(jìn)行分析，以提高分辨的準(zhǔn)確性。檢測(cè)結(jié)果不但能確

13、定是否為牛肉，還能判斷是否為豬肉。因此這樣的結(jié)果對(duì)于市場(chǎng)上鑒別特別有意義。當(dāng)然在這兩個(gè)物種之外的，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。 微衛(wèi)星標(biāo)記的方法進(jìn)行肉質(zhì)鑒別的方法簡(jiǎn)易、方便、快捷，且特異性高。隨機(jī)在不同地點(diǎn)、不同時(shí)段采集的兩組48個(gè)樣品出現(xiàn)了高度的一致性，可見(jiàn)鑒別結(jié)果的可信度高。整個(gè)鑒別過(guò)程耗時(shí)較短，在一個(gè)工作日內(nèi)就能得出結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感性都很高，也適合大批量樣本的鑒別。是一種新型的且具有相當(dāng)市場(chǎng)應(yīng)用前景的肉品來(lái)源鑒別方法。該試驗(yàn)也為其他物種使用特異微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)便鑒定提供了良好的借鑒。但是在位點(diǎn)選擇時(shí)，要遵循種間特異、種內(nèi)通用的原則，否則就可能因品種間的差異而出現(xiàn)誤差。試驗(yàn)在前期

14、預(yù)備時(shí)，牛和豬的位點(diǎn)都預(yù)備了10個(gè)以上，根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)的結(jié)果，淘汰了種間特異性差、種內(nèi)特異性強(qiáng)的位點(diǎn)，確定了以一個(gè)牛的位點(diǎn)和一個(gè)豬的位點(diǎn)進(jìn)行平行鑒定的基本方法。至于用多少個(gè)位點(diǎn)合適，試驗(yàn)的結(jié)果可以在一定程度上說(shuō)明，豬牛各一個(gè)聯(lián)合應(yīng)用就可以了。雖然在至更多，以提高種內(nèi)鑒別的精準(zhǔn)性，但對(duì)于牛、豬的種間鑒定，如果位點(diǎn)選擇合適，各使用一個(gè)，累積鑒定效果仍然是可行的，該試驗(yàn)結(jié)果兩組48個(gè)樣品都表現(xiàn)出高度的一致性，盡管樣本量還不太大。但這樣可以省工、省時(shí)、省成本。參考文獻(xiàn)1潘良文, 陳家華. 食品和飼料中動(dòng)物源成分的檢測(cè)方法的進(jìn)展J.檢驗(yàn)檢疫科學(xué).2002,12(2:45-61.2陳穎, 吳亞君, 徐寶梁.

15、 進(jìn)出口動(dòng)物源性產(chǎn)品中牛羊成分的檢測(cè)方法J.食品工業(yè)科技.2004(8:144-146.3Calvo J H, Rodellar C, Zaragoza P, etal. Beef and bovine-derived material identi-fication in processed and unprocessed food and feed by PCR amplification J.J Agric Food Chem, 2002,50(19:5262-5264. 4Frezza D. A Copetitive Polymerase Chain Reaction-Based Ap

16、-proach for the Identification and Semiquantification of Mitochondri-al DNA in Differently Heat-Treated Bovine Meat and Bone MealJ.Food Protection,2003,66(1:103-109.5Bottero M T, Dalmasso I A, Nucera D, et al. Development of a PCR assay for the detection of animal tissues in ruminant feeds J.J Food

17、Prot,2003, 66(12:2307-2312. 6趙秀玲, 聞偉剛, 余旭平, 等.Chelex-100快速提取動(dòng)物源飼料DNA 方法的建立J.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2004,22(1:82-85.7Krcmar P, Rencova E. Identification of bovine specific DNA in feed stuffs J.JFood Prot., 2001, 64(1:117-119.8管峰, 楊利國(guó), 艾君濤, 等.STR 基因座在奶牛個(gè)體識(shí)別中的應(yīng)用J.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,21(2:4-6.9凌鳳俊, 鄭秀芬, 葉健, 等. 牛多態(tài)性遺傳標(biāo)記

18、系統(tǒng)性的研究J.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2005(139:14-18. 一種簡(jiǎn)易的豬肉和牛肉分子生物學(xué)鑒別方法研究作者：曹黛麗， 陳超， 宋平， 侯京強(qiáng)， 徐幸蓮， 楊靜靜， 楊德吉， Cao Daili， Chen Chao， Song Ping， Hou Jingqiang ， Xu Xinglian， Yang Jingjing， Yang Deji作者單位：曹黛麗,陳超,宋平,侯京強(qiáng),楊靜靜,楊德吉,Cao Daili,Chen Chao,Song Ping,Hou Jingqiang,Yang Jingjing,YangDeji(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,南京,210095， 徐幸蓮,Xu

19、 Xinglian(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,南京,210095刊名：中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 英文刊名：CHINESE AGRICULTURAL SCIENCE BULLETIN年，卷(期：2009,25(18被引用次數(shù)：2次參考文獻(xiàn)(9條1. 潘良文. 陳家華 食品和飼料中動(dòng)物源成分的檢測(cè)方法的進(jìn)展期刊論文-檢驗(yàn)檢疫科學(xué) 2002(022. 陳穎. 吳亞君. 徐寶梁 進(jìn)出口動(dòng)物源性產(chǎn)品中牛羊成分的檢測(cè)方法期刊論文-食品工業(yè)科技 2004(083. Calvo J H. Rodellar C. Zaragoza P. etal Beef and bovine-derived material ident

20、i-fication in processed and unprocessed food andfeed by PCR amplification外文期刊 2002(194. Frezza D A Copetitive Polymerase Chain Reaction-Based Approach for the Identification and Semiquantifieation ofMitochondrial DNA in Differently Heat-Treated Bovine Meat and Bone Meal 2003(015. Bottero M T. Dalmas

21、so I A. Nucera D Development of a PCR assay for the detection of animal tissues in ruminant feeds外文期刊2003(126. 趙秀玲. 聞偉剛. 余旭平 Chelex-100快速提取動(dòng)物源飼料DNA方法的建立期刊論文-上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版 2004(017. Krcmar P. Rent . ova E Identification of bovine specific DNA in feed stuffs外文期刊 2001(018. 管峰. 楊利國(guó). 艾君濤 STR基因座在奶牛個(gè)體識(shí)別中的應(yīng)用期刊論文-中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 2005(029. 凌風(fēng)俊. 鄭秀芬. 葉健