瓊脂柱法測定抗真菌藥物對皮膚癬菌的

1、瓊脂柱法測定抗真菌藥物對皮膚癬菌的MIC中華皮膚科雜志 1998年第5期第31卷 技術與方法作者：李少平劉維達王紅單位：210042 中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學皮膚 病研究 所李少平(楊森培訓計劃高級進修醫(yī)師，現(xiàn)在天津長征醫(yī)院)劉維達(指導者)王紅因抗真菌藥物敏感 性測定(MIC)影響因素多而難以標準化，尤其是接種菌的精確定量一直未能解決。最近But ty等 1推薦一種瓊脂柱法，我們參照此方法并做了改進，獲滿意的結果， 現(xiàn)報道如下。一、材料和方法(一)材料：1.菌株：20株受試皮膚癬菌菌株由中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學真菌中心提供。其中 有8株紅色毛癬菌為臨床新分離株。菌株的鑒定主要依

2、據(jù)菌落特征及鏡下形態(tài)學特點。2.培養(yǎng)基：沙堡氯霉素瓊脂(SDA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。3.藥物：酮康唑粉由南京第二制藥廠提供，批號94037，生產(chǎn)日期1994年4月，含量99.71% 。4.藥敏板：直徑2cm的24孔Nanclon細胞培養(yǎng)板(丹麥產(chǎn))，一次性使用或消毒后重復使用。(二)方法：1.挑取純菌落點種在直徑9cm SDA(瓊脂含量分別為1%、2%)和PDA平皿的中心，28保濕培養(yǎng) 15天。2.稱取6.4mg酮康唑粉，溶于500l二甲基亞砜中作為母液，然后用去離子水按19比例稀 釋，再做10級倍比稀釋，分別與一定量不同硬度SDA及PDA培養(yǎng)基在50水浴混勻，最終獲工 作濃度6.4

3、0.012g/ml。3.取不同稀釋度含藥瓊脂(50)1ml，分別注入細胞培養(yǎng)板的孔洞中，同時做對照(溶媒及空 白對照)。冷凝后用直徑0.6cm打孔器在培養(yǎng)板孔內瓊脂中央打孔洞。4.同上述方法，用同直徑的打孔器在長有菌落的瓊脂上打孔，位置約在平皿菌落中心至邊緣 距離的外1/3處，將覆有菌落的瓊脂柱小心置入培養(yǎng)板孔的等徑小洞中。5.接種后的藥敏板置28培養(yǎng)，于第3天和第7天觀察結果。3天后，對照孔接種的瓊脂柱邊 可見接種菌呈花冠樣毛邊生長，其它含藥孔若呈此種特征判為陽性，否則判為陰性，其開始 孔濃度即為MIC。培養(yǎng)7天后，菌落直徑等于或大于0.8cm(即接種菌生長直徑)判為陽性，否 則判為陰性。6

4、.按照Butty等1方法將帶菌瓊脂柱接種在平皿內含藥的瓊脂 空洞中，空洞距平皿邊緣2cm，彼此相距2cm，余同上。7.將本法所測的MIC與微量稀釋法進行比較，探討瓊脂硬度及不同培養(yǎng)基對MIC的影響。二、結果1.不同皮膚癬菌在SDA的瓊脂柱上于接種后第7天菌落大小明顯不同，在本實驗中，若菌落直徑1.5cm(如絮狀表皮癬菌等)，接種后7天觀察結果，其余在3天后觀 察(如紅色毛癬菌)。2.改良瓊脂柱法結果見圖1。A和B為須癬毛癬菌，C和D則為犬小孢子菌，A6、B6、C6 、D6為兩菌株的空白對照。藥物濃度按A5、C5B5、D5A4、C4順序由0.0 12g/ml倍比增加。須癬毛癬菌和犬小孢子菌的MI

5、C孔分別為B2和D3，即MIC值為1.6 g/ml和0.8g/ml。圖1將接種菌瓊脂柱接種在含藥24孔Manclon板上，7天生長情況(改良法)3.20株皮膚癬菌用兩種方法及不同瓊脂硬度在體外對酮康唑的敏感性測定結 果見附表。從中可知瓊脂柱法測定MIC值一般比微量稀釋法高12個稀釋度；2% SDA MIC值高于1 % SDA。PDA由于在第7天仍無菌落生長而未能記錄。附表20株皮膚癬菌體外對酮康唑敏感性測定結果(MIC，g/ml)菌種菌株方法瓊脂硬度瓊脂柱法微量稀釋法1% SDA2% SDA紅色毛癬菌90.128*0.067*0.803*0.108*許蘭氏毛癬菌10.100.050.100.0

6、2紫色毛癬菌10.400.100.200.40斷發(fā)毛癬菌10.800.400.400.80須癬毛癬菌21.60*0.40*0.80*1.60*鐵銹色毛癬菌10.200.200.200.20石膏樣小孢子菌20.30*0.20*0.30*0.40*犬小孢子菌10.800.200.200.40奧杜盎小孢子菌10.400.200.400.40絮狀表皮癬菌10.800.400.800.80均值200.5530.220.3480.531*為均值三、討論關于絲狀真菌的藥物敏感性測定，目前常用的方法有瓊脂稀釋法和液體稀釋法，其共同不足 之處 是接種物不易準確定量，分生孢子與菌絲比例不易控制。本文方法的最大優(yōu)點是在不 改變接種真菌自然生長狀態(tài)的前題下定量取材，保證菌絲與分生孢子間比例一致，較好地解 決了上述問題。我們對Butty等報道方法1 所做的改進是用24 孔培養(yǎng)板(見圖1)代替培養(yǎng)皿作為藥敏試驗載體，將同一藥物濃度不同菌種的傳統(tǒng)模 式(紙片法)改為同一菌種不同藥物濃