動物細(xì)胞工程第二節(jié)(志強(qiáng)上課用)

1、知識回顧：l動物細(xì)胞工程技術(shù)包括有哪些技術(shù)；其基本工程技術(shù)是什么；l動物細(xì)胞培養(yǎng)指的是什么？依據(jù)原理；l動物細(xì)胞培養(yǎng)需要哪些條件；動物細(xì)胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要區(qū)別有哪些？l動物體細(xì)胞核移植指的是什么？依據(jù)的原理；l簡述動物體細(xì)胞核移植過程；核移植流程核移植流程:1、供體細(xì)胞的采集與培養(yǎng)、供體細(xì)胞的采集與培養(yǎng)6、用物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，使其完成減、用物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，使其完成減數(shù)分裂進(jìn)程。數(shù)分裂進(jìn)程。5、電刺激促融使供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞，構(gòu)建、電刺激促融使供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎。重組胚胎。4、將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞、將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞3、顯微

2、操作去除卵母細(xì)胞中的核、顯微操作去除卵母細(xì)胞中的核2、受體卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)、受體卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)7、胚胎移植入代孕母牛體內(nèi)、胚胎移植入代孕母牛體內(nèi)8、妊娠分娩與供體遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)相同的犢牛。、妊娠分娩與供體遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)相同的犢牛。 細(xì)胞融合是正常的生命活動細(xì)胞融合是正常的生命活動兩個(gè)細(xì)胞正在融合兩個(gè)細(xì)胞正在融合 受精作用受精作用1 1、定義：、定義：指用自然或人工方指用自然或人工方法使兩個(gè)或多個(gè)不同的細(xì)胞法使兩個(gè)或多個(gè)不同的細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的過程。融合成一個(gè)細(xì)胞的過程。一、動物細(xì)胞融合一、動物細(xì)胞融合細(xì)胞雜交：細(xì)胞雜交：不同基因型的細(xì)不同基因型的細(xì)胞之間的融合就是胞之間的融合就

3、是細(xì)胞雜交細(xì)胞雜交。雜交細(xì)胞：雜交細(xì)胞：融合后形成的具融合后形成的具有原來有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息信息的的單核細(xì)胞單核細(xì)胞成為雜交細(xì)成為雜交細(xì)胞胞。2、誘導(dǎo)融合的方法：誘導(dǎo)融合的方法： 生物法：生物法：滅活的病毒滅活的病毒誘導(dǎo)融誘導(dǎo)融合合.(.(利用滅活仙臺病毒是動物細(xì)胞融利用滅活仙臺病毒是動物細(xì)胞融合所特有的。合所特有的。 這是由于病毒的磷脂外這是由于病毒的磷脂外衣與動物細(xì)胞的膜十分相似的緣故。衣與動物細(xì)胞的膜十分相似的緣故。病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。進(jìn)細(xì)胞融合的功能。) ) 化學(xué)法：化學(xué)法：聚乙二醇聚乙二醇PEG

4、PEG誘導(dǎo)融合誘導(dǎo)融合. . 物理法：物理法：電激電激融合融合病毒顆粒黏病毒顆粒黏 附細(xì)胞表面附細(xì)胞表面細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜被細(xì)胞膜被 病毒顆粒穿通病毒顆粒穿通細(xì)胞融合、形成雜種細(xì)胞細(xì)胞融合、形成雜種細(xì)胞 因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合，不滅質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合，不滅活的話會感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合?；畹脑挄腥炯?xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。3 3、動物細(xì)胞融合技術(shù)的意義、應(yīng)、動物細(xì)胞融合技術(shù)的意義、應(yīng)用用意義：細(xì)胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局意義：細(xì)胞融合技術(shù)突破了有性雜交的

5、局 限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。應(yīng)用：利用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體。應(yīng)用：利用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體。 人們獲得抗體的傳統(tǒng)方法是人們獲得抗體的傳統(tǒng)方法是? ?將抗原注入動物體將抗原注入動物體, ,然后從動物血清中提取抗體然后從動物血清中提取抗體 這種方法的缺點(diǎn)是什么這種方法的缺點(diǎn)是什么? ?效率低，產(chǎn)量有限，純度低，動物抗體注入人體可效率低，產(chǎn)量有限，純度低，動物抗體注入人體可能產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。能產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。 運(yùn)用已學(xué)知識，設(shè)想怎樣獲得單一類型的抗體？運(yùn)用已學(xué)知識，設(shè)想怎樣獲得單一類型的抗體？ 能否用單個(gè)能否用單個(gè)B B淋巴細(xì)胞通過克隆形成的細(xì)胞群來淋巴細(xì)

6、胞通過克隆形成的細(xì)胞群來產(chǎn)生單一類型的抗體呢？產(chǎn)生單一類型的抗體呢？B B淋巴細(xì)胞在體外不能無限增殖。淋巴細(xì)胞在體外不能無限增殖。二：動物細(xì)胞融合的成功應(yīng)用二：動物細(xì)胞融合的成功應(yīng)用 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備思思考考單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備極富創(chuàng)造性的方案極富創(chuàng)造性的方案 將能夠產(chǎn)生特定抗體的將能夠產(chǎn)生特定抗體的B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞和具有無限增殖能和具有無限增殖能力的力的骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合在一起，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交融合在一起，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一瘤細(xì)胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種的特異性抗體。

7、這種單一類型的只針對某一特定抗原單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。 米爾斯坦米爾斯坦( (阿根廷阿根廷) )和科勒和科勒( (德國德國) )因此在因此在19841984年獲諾年獲諾貝爾獎。貝爾獎。提取提取用特定的用特定的選選擇性培養(yǎng)基擇性培養(yǎng)基1.動物特異性免疫動物特異性免疫2.分離分離B淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞（B）；找到骨髓瘤細(xì)胞（）；找到骨髓瘤細(xì)胞（G）。注意）。注意B淋巴細(xì)淋巴細(xì)胞是一個(gè)系列。（胞是一個(gè)系列。（B1,B2,B3,-Bn）3.細(xì)胞融合細(xì)胞融合三種融合方式三種融合方式:（BB;BG;GG）4.第一次篩選：在第一次篩選：

8、在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選上培養(yǎng)篩選雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞（只有（只有BG雜交瘤細(xì)胞存活。但雜交瘤細(xì)胞存活。但BG雜交瘤細(xì)胞也是一個(gè)系列：雜交瘤細(xì)胞也是一個(gè)系列：如如B1G,B2G-BnG。而。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）在此培養(yǎng)基上不能存活。）5.第二次篩選：在第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系列雜交瘤細(xì)胞系列每孔每孔只放一個(gè)雜交瘤細(xì)胞。只放一個(gè)雜交瘤細(xì)胞。“克隆化培養(yǎng)克隆化培養(yǎng)”每個(gè)雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)每個(gè)雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行行“單一抗體檢測單一抗體檢測”，“檢測陽性檢測陽性”的孔內(nèi)即是所需要的雜交的孔內(nèi)即是所需要的雜交瘤細(xì)胞。瘤細(xì)胞。6.選擇

9、所需要的雜交瘤克隆細(xì)胞群，選擇所需要的雜交瘤克隆細(xì)胞群，體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)或注射到或注射到小鼠腹腔小鼠腹腔內(nèi)增殖內(nèi)增殖。7.提取單克隆抗體。提取單克隆抗體。1、單抗的制備過程要點(diǎn)：、單抗的制備過程要點(diǎn)：4 4）、如何進(jìn)行第）、如何進(jìn)行第2 2次篩選？次篩選？培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞。培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞。第第1 1次篩選得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。第次篩選得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。第2 2次篩選得次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞群。到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞群。問題強(qiáng)化：問題強(qiáng)化：1 1）、本過程利用了哪些原理？）、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞

10、融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理2 2）、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與）、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B B細(xì)胞融合？細(xì)胞融合？這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有不僅具有B B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體 1、作為診斷試劑作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等體內(nèi)腫瘤的定位等, ,與常規(guī)抗體相比與常規(guī)抗體相比, ,具有具有準(zhǔn)確、高

11、效、準(zhǔn)確、高效、簡易、快速簡易、快速特點(diǎn)特點(diǎn). 2、用于治療疾病和運(yùn)載藥物用于治療疾病和運(yùn)載藥物： 主要用于癌癥治療。主要用于癌癥治療。 生物導(dǎo)彈：生物導(dǎo)彈：抗癌細(xì)胞的單克隆抗體抗癌細(xì)胞的單克隆抗體+ +放射性同位素放射性同位素+ +化學(xué)化學(xué)藥物或細(xì)胞毒素藥物或細(xì)胞毒素。（單克隆抗體：導(dǎo)向。準(zhǔn)確找到癌細(xì)。（單克隆抗體：導(dǎo)向。準(zhǔn)確找到癌細(xì)胞位置，原位殺死癌細(xì)胞。）胞位置，原位殺死癌細(xì)胞。） 特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量制備。特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量制備。3 3、單克隆抗體的應(yīng)用、單克隆抗體的應(yīng)用B B體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞足夠數(shù)量的細(xì)胞足夠數(shù)量的細(xì)胞群群注射到注

12、射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C 下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)的生產(chǎn)破傷下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)方案風(fēng)桿菌單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)方案2 2、該方案能達(dá)到預(yù)期效果嗎？為什么？、該方案能達(dá)到預(yù)期效果嗎？為什么？4 4、圖中、圖中B B為為_過程，常用過程，常用_作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼承承_的遺傳特性，既能的遺傳特性，既能_,_,又能又能_。1 1、該實(shí)驗(yàn)方案的目的是、該實(shí)驗(yàn)方案的目的是_3 3、A A是從小鼠的脾臟中取得是從小鼠的脾臟中取得_,_,該細(xì)胞能夠產(chǎn)生該細(xì)胞能夠產(chǎn)生_5 5、C C過程指細(xì)胞培養(yǎng)，該過程包括過程指細(xì)胞培養(yǎng)，該過程包括_培養(yǎng)和培養(yǎng)和_培養(yǎng)兩個(gè)階段，其培養(yǎng)兩個(gè)階段，其中中_代以內(nèi)的的細(xì)胞屬于細(xì)胞株。代以內(nèi)的的細(xì)胞屬于細(xì)胞株。制備單克隆抗體制備單克隆抗體B B細(xì)胞細(xì)胞抗體抗體細(xì)胞融合細(xì)胞融合滅活病毒滅活病毒雙親細(xì)胞雙親細(xì)胞分泌抗體分泌抗體無限增殖無限增殖原代原代傳代傳代5050練習(xí)練習(xí)3 3：練習(xí)練習(xí)4 4：單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和單克隆抗體制備過程中