標(biāo)準(zhǔn)方程的繪制及應(yīng)用

1、實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析Oct. 25th, 2014I、標(biāo)準(zhǔn)方程的繪制及應(yīng)用、標(biāo)準(zhǔn)方程的繪制及應(yīng)用1. 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析Part 22. 標(biāo)準(zhǔn)方程的繪制及應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方程的意義實驗方法檢索Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)方程趨勢線與回歸方程、R2值方程應(yīng)用 標(biāo)準(zhǔn)方程繪制及應(yīng)用 以Lowery法測定蛋白質(zhì)含量為例，講述標(biāo)準(zhǔn)方程的設(shè)計及應(yīng)用 趨勢線的繪制及意義 標(biāo)準(zhǔn)方程的求解及應(yīng)用y = 111.23x - 1.2441R2 = 0.99220204060801001200.0000.2000.4000.6000.8001.000系列1線性 (系列1) 單因素實驗數(shù)據(jù)處理及作圖 以蛋白酶比活力為響應(yīng)值，設(shè)計蛋白酶的提

2、取條件 單因素實驗設(shè)計方案 單因素數(shù)據(jù)處理 方差分析 SigmaPlot繪制單因素圖形酶活 (U/mL)0246810上清 液比 例 (%)-.4-.20.0.2.4.6.8上清 液菌 懸 液比 率 (%) 提取方法 及 酶活 總 量 (U/mL)對 照凍 融 法超聲 法溶 菌 酶法蛋白酶法脲酶法11.2812.4412.28-0.095.5619.29 響應(yīng)面法優(yōu)化生產(chǎn)工藝 以蛋白酶比活力為響應(yīng)值，利用Design Expert設(shè)計響應(yīng)面實驗 工藝優(yōu)化中響應(yīng)面的應(yīng)用 響應(yīng)面設(shè)計及數(shù)據(jù)分析 圖形處理與美化用SigmaPlot 繪制的柱層析圖 本部分課程的學(xué)習(xí)以實例進(jìn)行 課程講授與學(xué)生實戰(zhàn)練習(xí)各

3、占一半時間 上課時請隨身攜帶筆記本電腦 標(biāo)準(zhǔn)方程，即標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，一般指直線回歸方程 本質(zhì)本質(zhì)：通過大量觀察數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，揭示出相關(guān)變量之間的內(nèi)在規(guī)律： 找出變量間相關(guān)關(guān)系的近似數(shù)學(xué)表達(dá)式回歸方程 檢驗回歸方程的效果是否顯著 由2個或幾個變量的值，通過回歸方程來預(yù)測或控制另一變量的值 由Lowery于1940年代發(fā)明的，測定蛋白質(zhì)含量的方法。 基本原理：1.顯色原理與雙縮脲方法雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin酚酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度2.兩種顯色原因：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物3. Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽磷

4、鉬酸鹽磷鎢酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）4.在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。檢測范圍： 20250 g/mLThe Lowry protein assay is a biochemical assay for determining the total level of protein in a solution.The total protein concentration is exhibited by a color change of the sample solution in proportion to

5、protein concentration, which can then be measured using colorimetric techniques. It is named for the biochemist Oliver H. Lowry who developed the reagent in the 1940s. His 1951 paper describing the technique is the most-highly cited paper ever in the scientific literature, cited over 200,000 times 實

6、驗方法檢索途徑： 實驗指導(dǎo)書 國家/地方標(biāo)準(zhǔn) 學(xué)術(shù)論文 實驗方法選擇 根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇 根據(jù)實驗器材、設(shè)備 根據(jù)準(zhǔn)確度要求（1）試劑甲：）試劑甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉 （KNaC4H4O64H2O）。溶解于500毫升蒸餾水中。（B） 0.5克硫酸銅（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。（2）試劑乙：）試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO42H2O）,25克鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上

7、回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入150克 硫 酸 鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或 G-球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。1.取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別

8、加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。2.用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025）放置10分鐘。3.再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。4.然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1

9、分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。2.進(jìn)行多試管操作時，為了防止出錯，每位學(xué)生都必須在實驗記錄本上預(yù)先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的吸光度值。管號管號12345678910標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)蛋蛋白質(zhì)白質(zhì)（mL）00.10.20.40.

10、60.81.0 未知未知蛋蛋白質(zhì)白質(zhì)（mL) 0.20.40.6蒸餾水蒸餾水（mL）1.00.90.80.60.40.200.80.60.4試劑試劑甲甲（mL）5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0試劑試劑乙乙（mL）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5吸光度吸光度值值（A700） 每管中每管中蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的量的量（mg） 04080120160200y = 573.78x - 2.2799R2 = 0.9990501001502002500.00000.05000.10000.15000.20000.25000.30000.35000.4000蛋

11、白質(zhì)濃度（蛋白質(zhì)濃度（g/mL)吸光度（吸光度（Abs 758nm)Lowery法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線0.01.02.03.04.05.06.07.08.03.53.84.14.44.75.0酶酶活活力力（U）pH值值菌懸液低菌懸液低pH值耐受性值耐受性A1C3C7D6LY083 Excel數(shù)據(jù)錄入 公式編輯及運算：均值、求和 操作技巧：序列填充、復(fù)制格式 Excel繪圖：散點圖 Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：趨勢線、R2值 將實驗設(shè)計的數(shù)據(jù)錄入Excel 標(biāo)準(zhǔn)曲線至少做三個平行，實驗完成后，將實驗結(jié)果(A700nm吸光度值吸光度值）錄入Excel 求和：=sum(B14:B16) 求均值

12、：=average(B14:B16) 求偏差：=stdev(B14:B16) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的初始值為250 mg/mL 請計算，7支試管中各自的蛋白質(zhì)濃度是多少？ 準(zhǔn)備數(shù)據(jù) 蛋白質(zhì)濃度 吸光度值 做散點圖 R2值表示回歸方程的可信度，越接近于1，可信度越高。 一般情況下，要求達(dá)到0.99以上y = 24.146x + 5.5287R2 = 0.61770.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.0045.000.0000.2000.4000.6000.8001.0001.200蛋白質(zhì)濃度（蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）A700吸光度值吸光度值系列1線性 (系列1) 標(biāo)準(zhǔn)方程為 y=38.169x