微生物的代謝調(diào)節(jié)和代謝工程

1、第五章 微生物的代謝調(diào)節(jié)和代謝工程 在生物進(jìn)化過程中，微生物細(xì)胞形成了愈來愈完善的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞經(jīng)常處于平衡生長狀態(tài)，不會有代謝產(chǎn)物的積累。從進(jìn)化角度看，代謝產(chǎn)物的過量產(chǎn)生對細(xì)胞能量的利用和細(xì)胞組成、物質(zhì)的合成都是一種浪費。 想獲得代謝產(chǎn)物的積累就必須打破正常的代謝系統(tǒng)。可采取兩種方式： 1.通過各種育種方法，選育基因突變株，從根本上改變微生物的代謝； 2.控制微生物的各種培養(yǎng)條件，改變控制代謝速率，影響其代謝過程。即影響基因型的表達(dá)。 代謝類型：分解代謝和合成代謝代謝調(diào)節(jié)(regulation of metablism）是指微生物的代謝速度和方向按照微生物的需要而改變的一種作用,即自我調(diào)

2、節(jié)。微生物代謝的控制是指運用人為的方法對微生物的代謝調(diào)節(jié)進(jìn)行遺傳改造和條件的控制，以期按照人們的愿望，生產(chǎn)有用的微生物制品。代謝調(diào)節(jié)的方式酶合成的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)方式初級代謝的調(diào)節(jié)次級代謝的調(diào)節(jié)5.1 代謝調(diào)節(jié)方式細(xì)胞透性的調(diào)節(jié)代謝途徑區(qū)域化代謝流向的調(diào)控代謝速度的調(diào)控1，細(xì)胞透性的調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜的透性直接影響物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌，從而影響到細(xì)胞內(nèi)代謝的變化。細(xì)胞質(zhì)膜的透性的調(diào)節(jié)是微生物代謝調(diào)節(jié)的重要方式，由它控制著營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和產(chǎn)物分泌。代謝調(diào)節(jié)方式例如，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌吸收乳糖是由滲透酶和環(huán)狀A(yù)MP(cAMP)協(xié)同控制來完成的。cAMP的濃度是由腺苷酸環(huán)化酶(AC)的活性控制

3、的，也就是說，乳糖的吸收受滲透酶和AMP環(huán)化酶的控制，調(diào)節(jié)蛋白通過磷酸化的形式和腺苷酸環(huán)化酶（AC）或滲透酶結(jié)合，分別使腺苷酸環(huán)化酶活化或使?jié)B透酶失活。當(dāng)有葡萄糖時，乳糖的滲透酶以無活性狀態(tài)存在，而腺苷酸環(huán)化酶也以非活性狀態(tài)存在。代謝調(diào)節(jié)方式L-異亮氨酸的膜滲透情況BrnEBrnFBrnQ代謝調(diào)節(jié)方式2，代謝途徑區(qū)域化原核微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)雖然簡單，但也劃分出不同的區(qū)域，對于某一代謝途徑有關(guān)的酶系則集中某一區(qū)域，以保證這一代謝途徑的酶促反應(yīng)順利進(jìn)行，避免了其他途徑的干擾。例如呼吸的酶系集中在細(xì)胞質(zhì)膜上；而與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的酶系則位于核蛋白體上；分解大分子的水解酶，在革蘭氏陰性菌里是位于壁膜間隙中，

4、而革蘭氏陽性菌則將這些水解酶類，分泌于胞外。代謝調(diào)節(jié)方式 在真核微生物細(xì)胞里，各種酶系被細(xì)胞器隔離分布。如與呼吸產(chǎn)能有關(guān)的酶系集中于線粒體內(nèi)膜上；蛋白質(zhì)的合成酶系位于核蛋白體上；DNA合成的某些酶位于細(xì)胞核里。代謝調(diào)節(jié)方式細(xì)胞具有復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)使其代謝活動只能在特定的部位上進(jìn)行，即代謝活動是區(qū)域化的，其實質(zhì)是控制酶與底物接觸，使各個反應(yīng)有序地進(jìn)行。代謝調(diào)節(jié)方式線粒體:丙酮酸氧化;三羧酸循環(huán);b-氧化;呼吸鏈電子傳遞;氧化磷酸化細(xì)胞質(zhì):酵解;磷戊糖途徑;糖原合成;脂肪酸合成;細(xì)胞核:核酸合成內(nèi)質(zhì)網(wǎng):蛋白質(zhì)合成;磷脂合成酶定位的區(qū)域化代謝調(diào)節(jié)方式3，代謝流向的調(diào)控微生物在不同條件下可以通過控制各代謝

5、途徑中某個酶促反應(yīng)的速率來控制代謝物的流向，從而保持機(jī)體代謝的平衡。它包括兩種形式由一個關(guān)鍵酶控制的可逆反應(yīng)由兩種酶控制的逆單向反應(yīng)代謝調(diào)節(jié)方式由一個關(guān)鍵酶控制的可逆反應(yīng) 同一個酶可以通過不同輔基(或輔酶)控制代謝物的流向。例如，谷氨酸脫氫酶以NADP+為輔酶時，主要是催化谷氨酸的合成，當(dāng)以NAD+為輔酶時，則催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通過不同的輔基來控制代謝物的流向。由一個關(guān)鍵酶控制的可逆反應(yīng) :同一個酶可以通過不同輔基(或輔酶)控制代謝物的流向。例如，谷氨酸脫氫酶以NADP+為輔酶時，主要是催化谷氨酸的合成，當(dāng)以NAD+為輔酶時，則催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通過不同的輔基來控制

6、代謝物的流向。代謝調(diào)節(jié)方式由兩種酶控制的逆單向反應(yīng) 逆單向反應(yīng)是在生物體代謝的關(guān)鍵部位的某些反應(yīng)，它是由兩種各自不同的酶來催化的。即在一個“可逆”反應(yīng)中，其中一種酶催化正反應(yīng)，而另一種酶則催化逆反應(yīng)。例如，葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催化的，而其逆反應(yīng)則是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1，6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的，逆反應(yīng)則由1，6-二磷酸果糖酯酶催化。代謝調(diào)節(jié)方式4，代謝速度的調(diào)控在不可逆反應(yīng)中，微生物通過調(diào)節(jié)酶的活性和酶量來控制代謝物的流量。微生物在不同條件下能按照需要，通過激活或抑制原有酶的活性或通過誘導(dǎo)或阻遏酶的合成來自我調(diào)節(jié)其代謝速度，使之高度經(jīng)濟(jì)

7、有效地利用能量和原料進(jìn)行生長繁殖。代謝調(diào)節(jié)方式5.2 酶活性的調(diào)節(jié)概 念酶活性調(diào)節(jié)是指一定數(shù)量的酶，通過其分子構(gòu)象或分子結(jié)構(gòu)的改變來調(diào)節(jié)其催化反應(yīng)的速率。影響因素底物和產(chǎn)物的性質(zhì)和濃度環(huán)境因子(如壓力、pH、離子強(qiáng)度和輔助因子等)其他的酶的存在調(diào)節(jié)方式激活已有酶的活性抑制已有酶的活性（一）激活激活：在激活劑的作用下，使原來無活性的酶變成有活性，或使原來活性低的酶提高了活性的現(xiàn)象。代謝調(diào)節(jié)的激活作用：主要是指代謝物對酶的激活。前（體）饋激活，指代謝途徑中后面的酶促反應(yīng)，可被該途徑中較前面的一個中間產(chǎn)物所促進(jìn)。代謝中間產(chǎn)物的反饋激活，指代謝中間產(chǎn)物對該代謝途徑的前面的酶起激活作用酶活性的調(diào)節(jié)前（體

8、）饋激活和反饋激活示意圖A®B ® C ® D ® FA®B ® ® GCDEE例1：糖代謝途徑中丙酮酸積累激活丙酮酸羧化酶例2：乙酰CoA的積累激活PEP羧化酶酶的反饋激活葡萄糖草酰乙酸丙酮酸羧化酶乙酰CoA活化磷酸烯醇式丙酮酸擰檬酸a-酮戊二酸1，6-二磷酸果糖（二）抑制抑制：由于某些物質(zhì)的存在， 降低酶活性的現(xiàn)象。反饋抑制（feedback inhibition） ：反饋抑制是指代謝的末端產(chǎn)物對酶(往往是代謝途徑中的第一個酶)活性的抑 制。無分支代謝途徑的調(diào)節(jié)有分支代謝途徑的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)抑制和激活相反。由于某些物質(zhì)

9、的存在， 降低酶活性，稱為抑制。抑制可以是不可逆 的，這將造成代謝作用的停止；抑制也有可逆的，當(dāng)抑制劑除去后， 酶活性又恢復(fù)。在代謝 調(diào)節(jié)過程中所發(fā)生的抑制現(xiàn)象主要是可逆的，而且大多屬于反饋抑制。 反遺抑制 反饋抑制是指代謝的末端產(chǎn)物對酶(往往是代謝途徑中的第一個酶)活性的抑 制。反饋抑制作用在生物體內(nèi)普通存在，它在維持細(xì)胞正常代謝、經(jīng)濟(jì)有效地利用代謝原 料、以及適應(yīng)環(huán)境的變化，都具有重要作用。（二）抑制抑制：由于某些物質(zhì)的存在， 降低酶活性的現(xiàn)象。反饋抑制（feedback inhibition） ：反饋抑制是指代謝的末端產(chǎn)物對酶(往往是代謝途徑中的第一個酶)活性的抑 制。無分支代謝途徑的調(diào)

10、節(jié)有分支代謝途徑的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)抑制和激活相反。由于某些物質(zhì)的存在， 降低酶活性，稱為抑制。抑制可以是不可逆 的，這將造成代謝作用的停止；抑制也有可逆的，當(dāng)抑制劑除去后， 酶活性又恢復(fù)。在代謝 調(diào)節(jié)過程中所發(fā)生的抑制現(xiàn)象主要是可逆的，而且大多屬于反饋抑制。 反遺抑制 反饋抑制是指代謝的末端產(chǎn)物對酶(往往是代謝途徑中的第一個酶)活性的抑 制。反饋抑制作用在生物體內(nèi)普通存在，它在維持細(xì)胞正常代謝、經(jīng)濟(jì)有效地利用代謝原 料、以及適應(yīng)環(huán)境的變化，都具有重要作用。1，無分支代謝途徑的調(diào)節(jié)通常是在線形的代謝途徑中末端產(chǎn)物對催化第一步反應(yīng)的酶活性有抑制作用。酶活性的調(diào)節(jié)如圖827所示。例如，在大腸桿菌中，

11、由蘇氨酸(Thr)合成異亮氨酸(IIeu)時，異亮氨酸對催化反應(yīng)途徑中的第一步反應(yīng)的蘇氨酸脫氨酶(TD)有抑制作用。蘇氨酸 -酮丁酸 異亮氨酸TD酶活性的調(diào)節(jié)2，有分支代謝途徑的調(diào)節(jié)在有兩種或兩種以上的末端產(chǎn)物的分支合成代謝途徑中，調(diào)節(jié)方式較復(fù)雜，其共同特點是每個分支途徑的末端產(chǎn)物控制分支點后的第一個酶，同時每個末端產(chǎn)物又對整個途徑的第一個酶有部分的抑制作用，分支代謝的反饋調(diào)節(jié)方式有多種:順序反饋抑制（sequential feedback inhibition） 同工酶的反饋抑制（isoenzyme feedback inhibition） 協(xié)同反饋抑制（concerted feedback

12、 inhibition） 累積反饋抑制（cumulative feedback inhibition） 超相加反饋抑制（cooperative feedback inhibition） 酶活性的調(diào)節(jié)（1）順序反饋抑制sequential feedback inhibition 分支代謝途徑中的兩個末端產(chǎn)物，不能直接抑制途徑中的第一個酶，只有當(dāng)兩個末端產(chǎn)物都過量時，才能對途徑中的第一個酶有抑制作用。酶活性的調(diào)節(jié)例如，枯草桿菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制鄰氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙氨酸(Phe)抑制預(yù)苯酸脫水酶(PT)，酪氨酸(Tyr)抑制預(yù)苯酸脫氫酶(PD)，預(yù)苯酸和分支酸又部

13、分地抑制7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸合成酶(DS)。PEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：4-磷酸赤蘚糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸；CA：分支酸；Per：預(yù)苯酸；AA：鄰氨基苯甲酸；HPPA：對羥基苯丙酮酸；PPA：苯丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Try：色氨酸；Phe：苯丙氨酸；I：7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸合成酶；II：鄰氨基苯甲酸合成酶ASPTPDPEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：4-磷酸赤蘚糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸；CA：分支酸；Per：預(yù)苯酸；AA：鄰氨基苯甲酸；HPPA：對羥基苯丙酮酸；PPA：苯丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Try：色氨酸；Phe：苯

14、丙氨酸；I：7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸合成酶；II：鄰氨基苯甲酸合成酶；III：分支酸變位酶；IV：預(yù)苯酸脫氫酶；V：預(yù)苯酸脫水酶（2）同工酶的反饋抑制isoenzyme feedback inhibition 同功酶是指能催化同一生化反應(yīng)，但它們的結(jié)構(gòu)稍有不同，可分別被相應(yīng)的末端產(chǎn)物抑制的一類酶。其特點是：途徑中第一個反應(yīng)被兩個不同的酶所催化，一個酶被H抑制，另一個酶被G抑制。只有當(dāng)H和G同時過量才能完全阻止A轉(zhuǎn)變?yōu)锽。例如，大腸桿菌以天門冬氨酸為前體合成蘇氨酸(Thr)、異亮氨酸(Ileu)、甲硫氨酸(Met)和賴氨酸(Lys)的代謝途徑中有三種天門冬氨酸激酶的同功酶(AKI、AKI

15、I和AKIII)和兩種高絲氨酸脫氫酶的同功酶(HSDHI和HSDHII)。其中AKI和HSDHI受到蘇氨酸、異亮氨酸的反饋抑制和阻遏，AKII和HSDHII受甲硫氨酸的反饋抑制和阻遏；AKIII受賴氨酸的反饋抑制和阻遏。 Asp：天門冬氨酸；Asp-Pi：天門冬酰磷酸；Asa：天門冬氨酸半醛；Hse：高絲氨酸；Thr：蘇氨酸；Ileu：異亮氨酸；KB：-酮丁酸；Met：甲硫氨酸；Lys：賴氨酸；R：阻遏作用；I：反饋抑制；AK：天門冬氨酸激酶；HSDH：高絲氨酸脫氫酶（3）協(xié)同反饋抑制concerted feedback inhibition 在分支代謝系統(tǒng)中，幾種末端產(chǎn)物同時都過量，才對途徑

16、中的第一個酶具有抑制作用，如果末端產(chǎn)物單獨過量則對途徑中的第一個酶無抑制作用。例如，莢膜紅假單胞菌中天門冬氨酸族氨基酸生物合成途徑中，天門冬氨酸激酶(AK)是受末端產(chǎn)物賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制。（4）累積反饋抑制cumulative feedback inhibition在分支代謝途徑中各種末端產(chǎn)物單獨過量時，它們各自能對途徑中的第一個反應(yīng)的酶僅產(chǎn)生較小的抑制作用。一種末端產(chǎn)物單獨過量并不影響其它末端產(chǎn)物的形成，只有當(dāng)幾種末端產(chǎn)物同時過量時，才對途徑中的第一個酶產(chǎn)生較大的抑制。酶活性的調(diào)節(jié)例如，大腸桿菌谷氨酰胺合成酶(GS)活性的調(diào)節(jié)是一個典型的累積反饋調(diào)節(jié)的例子。谷氨酰胺由谷氨酸、銨和A

17、TP合成。谷氨酰胺中的酰胺基是色氨酸、組氨酸、氨基甲酰磷酸、6-磷酸葡萄糖胺、CTP、AMP、GMP等化合物生物合成過程中的氮源。谷氨酰胺合成酶被谷氨酰胺代謝的每種末端產(chǎn)物以及丙氨酸和甘氨酸所累積抑制。谷氨酰胺合成酶對這些抑制物中的每一種末端產(chǎn)物均有特異的結(jié)合部位。當(dāng)上述8種末端產(chǎn)物同時過量都與酶結(jié)合時，谷氨酰胺合成酶的活性將受到最大的抑制。（5）超相加反饋抑制cooperative feedback inhibition超相加反饋抑制是一種既不同于協(xié)同反饋抑制又不同于累積反饋抑制。對一個分支代謝途徑中，幾種末端產(chǎn)物單獨過量時，僅產(chǎn)生對共同途徑的第一個酶部分的抑制。如果每種末端產(chǎn)物都過量時，其

18、抑制作用則超過各種末端產(chǎn)物單獨過量時抑制的總和。酶活性的調(diào)節(jié)例如，在嘌呤核苷酸的生物合成途徑中，催化第一步反應(yīng)的酶，5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的酰胺基轉(zhuǎn)移酶，可被各種嘌呤核苷酸產(chǎn)物(如AMP、GMP)所抑制。例如，一定量的GMP或AMP僅能抑制5-磷酸核糖-1-焦磷酸酰胺基轉(zhuǎn)移酶活力的10，而當(dāng)二者混合時，則可抑制其酶活力的50。因為這些嘌呤核苷酸與5-磷酸核糖-1-焦磷酸并無結(jié)構(gòu)相似性，又因該酶是一種調(diào)節(jié)酶，GMP和AMP可能分別結(jié)合在該酶的不同部位上。酶活性調(diào)節(jié)包括：酶的激活作用 酶的抑制作用酶活性調(diào)節(jié)的機(jī)制：有變構(gòu)調(diào)節(jié)理論、化學(xué)修飾作用、締合與解離、競爭性抑制等。 1）

19、0; 變構(gòu)調(diào)節(jié)理論：變構(gòu)酶為一種變構(gòu)蛋白，酶分子空間構(gòu)象的變化 影響酶活。其上具有兩個以上立體專一性不同的接受部位，一個是活性中心，另一個是調(diào)節(jié)中心?；钚晕稽c:與底物結(jié)合變構(gòu)位點:與抑制劑結(jié)合,構(gòu)象變化,不能與底物結(jié)合 與激活劑結(jié)合, 構(gòu)象變化,促進(jìn)與底物結(jié)合 2）  化學(xué)修飾作用（共價修飾）： 是指蛋白質(zhì)分子中的一個或多個氨基酸殘基與一化學(xué)基團(tuán)共價連接或解開，使其活性改變的作用。 用共價修飾方式可使酶鈍化或活化。從蛋白質(zhì)中除去或加入小的化學(xué)基團(tuán)可以是磷酸基，甲基，乙基，腺苷酰基，蛋白質(zhì)的共價結(jié)合部位一般為絲氨酸殘基的CH2OH。共價修飾分為可逆的和不可逆的兩種。 酶合成調(diào)節(jié)的類型：

20、包括誘導(dǎo)和阻遏兩種類型。 誘導(dǎo)：是指在某種化合物作用下，導(dǎo)致某種酶合成或合成速率提高的現(xiàn)象。5.3 酶合成（酶量）的調(diào)節(jié)阻遏：是在某種物質(zhì)作用下導(dǎo)致某種酶合成停止或合成速率降低的現(xiàn)象。 酶合成的誘導(dǎo)與阻遏同時存在于微生物中，通過它們的協(xié)調(diào)作用能有效地控制胞內(nèi)酶量變化。 1. 酶合成的誘導(dǎo)作用 在微生物里，酶可以分成誘導(dǎo)酶與組成酶兩大類。組成酶：是機(jī)體內(nèi)一類不依賴于酶的底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶,如EMP途徑的一些酶。誘導(dǎo)酶(又稱適應(yīng)酶)：是一類依賴于底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶 決定誘導(dǎo)酶合成的基因以隱性狀態(tài)存在于染色體中。 5.3酶合成（酶量）的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑：能夠

21、誘導(dǎo)某種酶合成的化合物稱為該酶的誘導(dǎo)劑。 誘導(dǎo)劑可以是被誘導(dǎo)的酶的底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物，一種誘導(dǎo)酶的合成可以有一種以上的誘導(dǎo)劑，但是這些誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)能力不同，而且一種誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)能力還與誘導(dǎo)劑的濃度有關(guān)。 阻止酶合成的現(xiàn)象稱為酶合成的阻遏。阻遏酶合成的物質(zhì)稱為阻遏物。5.3酶合成（酶量）的調(diào)節(jié)2. 酶合成的阻遏終點產(chǎn)物（末端產(chǎn)物）反饋阻遏：如果阻遏物是被阻遏生成的酶(或酶系)所催化生成的終點產(chǎn)物，則這種阻遏現(xiàn)象稱為終點產(chǎn)物（末端產(chǎn)物）反饋阻遏。代謝產(chǎn)物反饋阻遏：如果阻遏物是其分解代謝的產(chǎn)物，則稱為分解代謝產(chǎn)物阻遏。 1）. 末端產(chǎn)物反饋阻遏 這種阻遏現(xiàn)象主要發(fā)生在合成代謝途徑上。這種現(xiàn)象最初

22、是在大腸桿菌合成甲硫氨酸的途徑中被發(fā)現(xiàn)的。如果在培養(yǎng)基中加入過量的甲硫氨酸時， 則這些酶系的合成都同時被阻遏。 5.3酶合成（酶量）的調(diào)節(jié)2. 酶合成的阻遏由于利用葡萄糖的酶系是固有的，而利用乳糖(或阿拉伯糖、半乳糖等)的酶系是誘導(dǎo)生成的。在有葡萄糖的情況下，阻遏了利用乳糖的酶系的合成。因而只有當(dāng)葡萄糖被利用完之后，乳糖才能誘導(dǎo)能利用它的酶系合成，由于合成新酶系需要一定的時間，所以在二次生長之間出現(xiàn)了一段停滯期。2） 分解代謝產(chǎn)物阻遏枯草桿菌的二次生長曲線5.3酶合成（酶量）的調(diào)節(jié)2. 酶合成的阻遏3） 酶合成調(diào)節(jié)的機(jī)制 主要是操縱子學(xué)說。根據(jù)這個理論認(rèn)為在DNA分子的不同區(qū)段上分布著調(diào)節(jié)基因

23、和操縱子；操縱子由操縱基因(O) 、一群功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因(S)以及在操縱基因與調(diào)節(jié)基因之間的啟動基因(P)組成，調(diào)節(jié)基因編碼一種低分子量的變構(gòu)蛋白(或稱調(diào)節(jié)蛋白)，這種蛋白可以結(jié)合到操縱基因上，以控制基因的轉(zhuǎn)錄；5.3 酶合成（酶量）的調(diào)節(jié)2. 酶合成的阻遏酶合成誘導(dǎo)的機(jī)制酶合成阻遏的機(jī)制根據(jù)操縱子的調(diào)節(jié)方式不同，可以將操縱子調(diào)節(jié)分成三種類型： 單一效應(yīng)物的調(diào)節(jié)，二種效應(yīng)物的共同調(diào)節(jié)弱化調(diào)節(jié)區(qū)別：酶活性調(diào)節(jié):是對現(xiàn)有的酶在活性變化上進(jìn)行調(diào)節(jié)，它不會涉及酶量的變化， 酶量的調(diào)節(jié):不涉及現(xiàn)有酶活性的變化，只是通過影響酶合成或酶合成速率以控制酶量變化，達(dá)到控制代謝過程的目的。 從調(diào)節(jié)作用的特點上看

24、:酶活性調(diào)節(jié)的效果既及時又迅速，但由于酶量調(diào)節(jié)涉及到酶蛋白合成，它調(diào)節(jié)的效果相應(yīng)地來得慢。酶量的調(diào)節(jié)與酶活調(diào)節(jié)的區(qū)別5.4 初級代謝的調(diào)節(jié)Regulation of Primary Metabolism初級代謝與次級代謝初級代謝：是為生物提供能量、合成中間體及其關(guān)鍵大分子的各種相互關(guān)聯(lián)的代謝網(wǎng)絡(luò)（包括分解與合成） ，對菌的生長是必需的。初級代謝產(chǎn)物有單糖、核苷酸、脂肪酸、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類等等。次級代謝：次級代謝主要涉及合成過程，其終產(chǎn)物、次級代謝物對菌的生長不是必需的，對其生命活動可能具有某種意義，通常是在生長后期開始形成的。次級代謝產(chǎn)物主要有抗生素、維生素、生物堿、色素、毒素等等。

25、初級代謝調(diào)節(jié)產(chǎn)能代謝的調(diào)節(jié)：能荷調(diào)節(jié)(Energy Charge Regulation)核蛋白體合成的調(diào)節(jié)（Regulation of Ribosome Synthesis）氨基酸、核苷酸合成代謝的調(diào)節(jié)（Regulation of amino acids and nucleotide metabolism）能荷調(diào)節(jié)能荷：即指細(xì)胞中ATP、ADP、AMP系統(tǒng)中可為代謝反應(yīng)供能的高能磷酸鍵的量度能荷的大小與細(xì)胞中ATP、ADP和AMP的相對含量有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞中全部腺苷酸均以ATP形式存在時，則能荷最大，為100%，即能荷為滿載。當(dāng)全部以AMP形式存在時，則能荷最小，為零。當(dāng)全部以ADP形式存在時，能

26、荷居中，為50%。若三者并存時，能荷則隨三者含量的比例不同而表現(xiàn)不同的百分值。能荷調(diào)節(jié)(Energy Charge Regulation)研究證明，細(xì)胞中能荷高時，抑制了ATP的生成，但促進(jìn)了ATP的利用，也就是說，高能荷可促進(jìn)分解代謝，并抑制合成代謝。相反，低能荷則促進(jìn)合成代謝，抑制分解代謝。能荷調(diào)節(jié)是通過ATP、ADP和AMP分子對某些酶分子進(jìn)行變構(gòu)調(diào)節(jié)進(jìn)行的。例如糖酵解中，磷酸果糖激酶是一個關(guān)鍵酶，它受ATP的強(qiáng)烈抑制，但受ADP和AMP促進(jìn)。丙酮酸激酶也是如此。在三羧酸循環(huán)中，丙酮酸脫氫酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶和-酮戊二酸脫氫酶等，都受ATP的抑制和ADP的促進(jìn)。呼吸鏈的氧化磷

27、酸化速度同樣受ATP抑制和ADP促進(jìn)。 5.5 次級代謝的調(diào)節(jié)Regulation of Secondary Metabolism初級代謝對次級代謝的調(diào)節(jié)碳代謝物的調(diào)節(jié)作用氮代謝物的調(diào)節(jié)作用磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用次級代謝中的誘導(dǎo)作用及產(chǎn)物的反饋作用次級代謝中細(xì)胞膜透性調(diào)節(jié)初級代謝對次級代謝的調(diào)節(jié)許多次級代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)是由少數(shù)幾種初級代謝產(chǎn)物構(gòu)成的，所以次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為母體衍生出來的，次級代謝途徑并不是獨立的，而是與初級代謝途徑有密切關(guān)系的。因此次級代謝必然會受到初級代謝的調(diào)節(jié)。例如青霉素的合成會受到賴氨酸的強(qiáng)烈抑制，而賴氨酸合成的前體 - 氨基己二酸可以緩解賴氨酸的抑制作用，并能刺

28、激青霉素的合成。這是因為 - 氨基己二酸是合成青霉素和賴氨酸的共同前體。如果賴氨酸過量，它就會抑制這個反應(yīng)途徑中的第一個酶，減少 - 氨基己二酸的產(chǎn)量，從而進(jìn)一步影響青霉素的合成。碳源代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)碳分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)指能迅速被利用的碳源(葡萄糖)或其分解代謝產(chǎn)物，對其他代謝中的酶(包括分解酶和合成酶)的調(diào)節(jié)。分為分解產(chǎn)物阻遏和抑制兩種。葡萄糖是菌體生長良好的碳源和能源，但對青霉素、頭孢菌素、卡那霉素、新霉素、絲裂霉素等都有明顯降低產(chǎn)量的作用。氮代謝物的調(diào)節(jié)作用在次級代謝中，氮分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)，即被迅速利用的氮源(氨)抑制作用于含底物的酶(蛋白酶、硝酸鹽還原酶、酰胺酶、脲酶、組氨酸酶)的合成。在

29、次級代謝中，其阻遏作用也確實存在。在抗生素生產(chǎn)中使用黃豆餅粉就是由于它緩慢分解成有阻遏作用的氨基酸和氨，防止或減弱氮分解代謝產(chǎn)物阻遏作用的結(jié)果。磷酸鹽的調(diào)節(jié)磷酸鹽不僅是菌體生長的主要限制性營養(yǎng)成分，還是調(diào)節(jié)抗生素生物合成的重要參數(shù)。其機(jī)制按效應(yīng)劑說有直接作用，即磷酸鹽自身影響抗生素合成，和間接作用，即磷酸鹽調(diào)節(jié)胞內(nèi)其他效應(yīng)劑(如ATP、腺苷酸能量負(fù)荷和cAMP)，進(jìn)而影響抗生素合成。已發(fā)現(xiàn)過量磷酸鹽對四環(huán)素、氨基糖苷類和多烯大環(huán)內(nèi)酯等32種抗生素的合成產(chǎn)生阻抑作用。細(xì)胞膜透性的調(diào)節(jié)外界物質(zhì)的吸收或代謝產(chǎn)物的分泌都需經(jīng)細(xì)胞膜的運輸，如發(fā)生障礙，則胞內(nèi)合成代謝物不能分泌出來，影響發(fā)酵產(chǎn)物收獲，或胞

30、外營養(yǎng)物不能進(jìn)入胞內(nèi)，也影響產(chǎn)物合成，使產(chǎn)量下降。如在青霉素發(fā)酵中，產(chǎn)生菌細(xì)胞膜輸入硫化物能力的大小影響青霉素發(fā)酵單位的高低。如果輸入硫化物能力增加，硫源供應(yīng)允足，合成青霉素的量就增多。5.6代謝調(diào)節(jié)理論在工業(yè)發(fā)酵上的應(yīng)用（代謝調(diào)控）工業(yè)發(fā)酵的目的：大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。代謝的人工控制：人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行。人工控制代謝的手段： 控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）； 改變微生物遺傳特性(遺傳學(xué)方法）； 改變細(xì)胞膜透性；1.各種發(fā)酵條件對微生物代謝的影響 在微生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵條件適合與否是發(fā)酵過程成敗的重要條件，因為發(fā)酵條件既能影響微生物的生長

31、，又能影響代謝產(chǎn)物的形成。發(fā)酵工藝條件的控制例如在谷氨酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵條件不同，則發(fā)酵生成的主要產(chǎn)物也不同，如下表：2. 使用誘導(dǎo)物 許多與蛋白質(zhì)、糖類或其他物質(zhì)降解有關(guān)的酶類都是誘導(dǎo)酶，在發(fā)酵過程中加入相應(yīng)的底物作為誘導(dǎo)物，可以有效的增加這些酶的產(chǎn)量。如加入槐糖(1，2-D-葡二糖)誘導(dǎo)木霉菌的纖維素酶的生成，木糖誘導(dǎo)半纖維素酶和葡萄糖異構(gòu)酶的生成等。 誘導(dǎo)物的濃度過高及能被迅速利用時，會發(fā)生酶合成的阻遏，這在纖維二糖對纖維素酶的產(chǎn)生，木二糖對半纖維素酶產(chǎn)生中都己觀察到，這也是使用誘導(dǎo)物時應(yīng)予注意的發(fā)酵工藝條件的控制3. 添加生物合成的前體 前體是指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，能被微生

32、物直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而自身的結(jié)構(gòu)無多大變化，且具有促進(jìn)產(chǎn)物合成的作用。如青霉素G的生產(chǎn)中，苯乙酰-CoA是限速性因子，補(bǔ)加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的產(chǎn)量。發(fā)酵工藝條件的控制前體與誘導(dǎo)物的區(qū)別： 有時難于區(qū)分促進(jìn)作用是誘導(dǎo)物的作用還是前體的作用。 一般，可把那些能在生長期內(nèi)、生產(chǎn)期前促進(jìn)產(chǎn)物合成的化合物看做誘導(dǎo)物，而前體往往只在生產(chǎn)期內(nèi)起作用。 另外，誘導(dǎo)物可以被非前體的結(jié)構(gòu)類似物取代。4.培養(yǎng)基成分和濃度的控制 （1）在考慮培養(yǎng)基組成與各組成成分的比例時， 要保證能夠滿足機(jī)體生長的需要， 要有利于代謝產(chǎn)物的形成， 同時還要盡量避免使用容易引起分解代謝產(chǎn)物阻遏的成分或避免使用高用量

33、的這種物質(zhì)。發(fā)酵工藝條件的控制防止碳分解代謝阻遏或抑制的發(fā)生青霉素發(fā)酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以減少碳分解阻遏的發(fā)生，是一項很有效的提高產(chǎn)量的方法。 使用寡糖、多糖等緩慢利用的碳源，葡萄糖與麥芽糖、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與淀粉混合碳源的利用，也都能減少碳分解阻遏的發(fā)生。加入影響糖代謝的硫氰酸芐酯可使金霉菌對葡萄糖的利用速度減緩，可增加金霉素的產(chǎn)量。 防止氮、磷代謝阻遏的發(fā)生避免使用高濃度的銨鹽做氮源以防止氮代謝阻遏的發(fā)生，是抗生素發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中比較成熟的經(jīng)驗。在抗生素產(chǎn)生期如補(bǔ)加氮源則會造成發(fā)酵逆轉(zhuǎn)，返回生長期，抗生素的產(chǎn)量會大為減少。使用亞適量(對菌體生長)的磷酸鹽，亦是抗生素發(fā)酵工業(yè)中遵循

34、的原則之一。 為防止氮、磷分解阻遏的發(fā)生，應(yīng)選用黃豆餅粉、蛋白胨類物質(zhì)為主要原料，而盡量少用易被迅速利用的無機(jī)氮源。 因此在發(fā)酵培養(yǎng)基中通常是采用有適量速效碳源或氮源，以促進(jìn)機(jī)體的生長；又要有充足的遲效碳源或氮源，以利于發(fā)酵產(chǎn)物的形成，從而也可以避免速效碳源或氮源在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生分解代謝產(chǎn)物阻遏。 例如用甘油代替果糖作碳源培養(yǎng)嗜熱脂肪酵母，可以使淀粉酶產(chǎn)量提高25倍以上。. 菌種遺傳特性的改變 優(yōu)良菌種是提高發(fā)酵效果的重要前提。在微生物發(fā)酵上通常采用的優(yōu)良菌種指那些能夠克服末端產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)的和通過基因重組與基因擴(kuò)增方法篩選出的新菌種，這些優(yōu)良菌種可以過量合成所需要的產(chǎn)物。 （1）對于直線式代謝途徑

35、：選育營養(yǎng)缺陷性突變株只能積累中間代謝產(chǎn)物 A a B b C c D d E 1. 營養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用末端產(chǎn)物E對生長乃是必需的，所以，應(yīng)在培養(yǎng)基中限量供給E，使之足以維持菌株生長，但又不至于造成反饋調(diào)節(jié)（阻遏或抑制），這樣才能有利于菌株積累中間產(chǎn)物C 。(2) 分支代謝途徑：情況較復(fù)雜，可利用營養(yǎng)缺陷性克服協(xié)同或累加反饋抑制積累末端產(chǎn)物，亦可利用雙重缺陷發(fā)酵生產(chǎn)中間產(chǎn)物分支途徑賴氨酸發(fā)酵:谷氨酸棒桿菌的Hom分支途徑肌苷酸發(fā)酵（IMP合成途徑的代謝調(diào)控）調(diào)控理論的實踐應(yīng)用2 抗反饋控制或反饋阻遏突變株的應(yīng)用抗反饋控制突變株是指對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐?，或兩者兼有之的菌株?？狗纸獯x

36、阻遏突變株:如天冬氨酸激酶是賴氨酸生物合成途徑中的調(diào)節(jié)酶，由黃色短桿菌分離到對賴氨酸的類似物(2-氨基半胱氨酸)有抗性的突變株，它對天冬氨酸激酶的反饋抑制不敏感，賴氨酸的產(chǎn)量可達(dá)57mgm1。3 選育組成型突變株和超產(chǎn)突變株在發(fā)酵工業(yè)中，要選擇到一種廉價、高效的誘導(dǎo)物是不容易的，分批限量加入誘導(dǎo)物在工藝上也多不便，更為有效的方法是改變菌株的遺傳特性，除去對誘導(dǎo)物的需要，即選育組成型突變株。 通過誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，都可達(dá)到此目的。 這樣的突變株稱為 組成型突變株。少數(shù)情況下，組成型突變株可產(chǎn)生大量的、比親本高的多的酶，

37、這種突變株稱為超產(chǎn)突變株。4 篩選耐前體或前體類似物的突變株加入前體有提高次級產(chǎn)物產(chǎn)量的效果；但過量對菌體又會有毒。篩選對前體育抗性的突變株以減少或消除前體的反饋阻遏，從而可獲得高產(chǎn)。如抗苯乙酸的青霉突變株，其青霉素的產(chǎn)量會增加。半胱氨酸、纈氨酸是-內(nèi)酰胺類抗生素的前體，篩選上述氨基酸的結(jié)構(gòu)類似物，三氟亮氨酸、D-纈氨酸的抗性菌株，其-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)量會提高。 控制細(xì)胞膜滲透性使胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物迅速滲漏出去,解除末端產(chǎn)物的反饋抑制。 1. 用生理學(xué)手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺損 如: 在Glu發(fā)酵中把生物素濃度控制在亞適量可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改變細(xì)胞膜的成分，進(jìn)而改變膜透性

38、；當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量較高時采用適量添加青霉素的方法；再如：產(chǎn)氨短桿菌的核苷酸發(fā)酵中控制因素是Mn2+； Mn2+的作用與生物素相似。2. 利用膜缺損突變株 油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過程中，有限制地添加油酸，合成有缺損的膜，使細(xì)胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸產(chǎn)量。甘油缺陷型菌株的細(xì)胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量滲漏。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。5.7代謝工程 代謝工程是指利用基因工程技術(shù)，定向地對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，以改變微生物的代謝特性，并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，構(gòu)建新的代謝

39、途徑，生產(chǎn)新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)領(lǐng)域。 基本思想是： 根據(jù)已有的遺傳和生化知識，找出限速步驟，進(jìn)行遺傳操作代謝工程：定向改造微生物的自然能力以生產(chǎn)(降解)某種物質(zhì)為目標(biāo)的工業(yè)生物技術(shù)，需要 拓展底物利用能力和范圍 引入新的合成途徑，或延伸已有途徑 減少副產(chǎn)物形成；提高產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度 改善細(xì)胞生理功能傳統(tǒng)育種：隨機(jī)突變，非理性設(shè)計代謝工程：定向遺傳修飾，理性設(shè)計 為了實現(xiàn)某種工業(yè)目的（生產(chǎn)工業(yè)原料或降解有毒物質(zhì)），傳統(tǒng)的手段是從自然界中篩選微生物、并通過化學(xué)或物理誘變改善其工業(yè)性能雖然在工業(yè)應(yīng)用上是有效的，但由于突變的非定向性和設(shè)計的非理性，越來越暴露出其難以認(rèn)識微生物生理本質(zhì)的缺陷。代謝工程策略碳水化合物原料丙酮丁醇C3酸P利用系統(tǒng)生物學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)新的支路途徑和調(diào)控位點´´酸P´´´´設(shè)計新的代謝工程策略代謝工程策略碳水化合物原料C3酸P´´酸P´´´´實現(xiàn)代謝途徑重構(gòu)´遺傳修飾設(shè)計策略代謝分析出發(fā)菌株高效生產(chǎn)菌株代謝