微生物發(fā)酵技術(shù)實訓(xùn)教案

1、野生型菌株的篩選經(jīng)典的發(fā)酵產(chǎn)物來自微生物，土壤是微生物的大本營。生產(chǎn)菌株的選育源頭都來自于自然界。如何從自然界中篩選目的微生物，可以根據(jù)目的微生物和產(chǎn)物的特性作為篩選條件，進(jìn)行篩選提高篩選效率，從而有效的解決菌株從無到有的問題。實訓(xùn)一產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選一實驗?zāi)康暮Y選一株能夠合成分解淀粉的微生物。二原理自然界微生物種類繁多，有些微生物能夠以淀粉作為碳源進(jìn)行生長繁殖是因為它們能夠合成分泌淀粉酶，因此我們能夠從自然界中定向分離出合成淀粉酶的微生物。當(dāng)能合成淀粉酶的微生物在固體培養(yǎng)基中生長時，會將淀粉酶分泌到菌體周圍，將菌落周圍的淀粉水解成為小分量的糊精、聚糖和單糖。這些水解物不能包裹單質(zhì)碘從而在菌體

2、周圍形成透明圈。三. 材料與儀器1. 材料蛋白胨，牛肉膏，NaCl，瓊脂條，可溶性淀粉，碘液。2. 儀器牛皮紙、培養(yǎng)皿、試管、涂布棒、恒溫培養(yǎng)箱、玻璃珠四方法與步驟1. 篩選培養(yǎng)基的配置可溶性淀粉2g，NaCl 5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，瓊脂20g，水 1000ml 2. 碘液的配置稱取KI 2.0g，用50mL去純水溶解KI，迅速稱量I2 0.5g并加入KI溶液中，用純水定容到100ml，攪拌溶解后保存在棕色瓶中，橡皮塞封口。 3. 土樣的采集 每大組取三種不同環(huán)境的土樣并記錄當(dāng)時取樣環(huán)境情況（每一小組以其中一個地方進(jìn)行分離）。 以小組為單位進(jìn)行稀釋分離。取土樣1克，加入9mL 無菌水

3、，逐步稀釋至105、106、107。（每個梯度涂2個瓶皿）。30恒溫培養(yǎng)48小時產(chǎn)淀粉酶菌株的鑒定。挑選單菌落影印到無菌瓶皿上，同時用簽字筆對各單菌落在底皿標(biāo)號。標(biāo)記接種過的培養(yǎng)皿30培養(yǎng)24h，取其中一皿噴灑稀碘液記錄有水解圈的單菌落。與此對應(yīng)找出合成淀粉酶的菌株。比透明圈透明圈直徑（mm）/ 菌落直徑（mm）5每小組調(diào)去活性優(yōu)良的菌株接入斜面試管保存，待下一次用。五記錄與結(jié)果1.環(huán)境情況地點一：地點二：地點三：2. 繪制出透明圈數(shù)據(jù)共享地點一地點二地點三產(chǎn)酶菌落數(shù)比透明圈六結(jié)果分析從不同地點獲得的結(jié)果進(jìn)行分析為什么會出現(xiàn)這樣的差異你可以初步得出什么樣的結(jié)論。七作業(yè)1. 為什么要用淀粉作為碳

4、源？2. 在觀察結(jié)果的過程中為什么要及時觀察,否則會有什么的后果.3. 為什么同樣一個同樣要稀釋幾個不同梯度進(jìn)行涂平板.菌種選育微生物菌種的選育目的防止菌種退化解決生產(chǎn)實際問題，提高生產(chǎn)能力，提高產(chǎn)品質(zhì)量，開發(fā)新產(chǎn)品。目前菌種選育的方法主要有自然選育、誘變育種、雜交育種、分子育種等手段。但是誘變育種還是育種的主流，誘變育種根據(jù)誘變劑的種類可分為化學(xué)誘變和物理誘變。本實驗以紫外線作為物理劑進(jìn)行誘變。誘變過程一般包括誘變出發(fā)菌株的選擇、誘變劑量的選擇和誘變及其篩選。實訓(xùn)二產(chǎn)淀粉酶菌株的誘變育種一. 目的在最佳誘變劑量下選育發(fā)生淀粉酶產(chǎn)量發(fā)生正突變的菌株。二. 原理發(fā)生正突變的概率約為10-8左右，

5、需要在大量的照射菌落中尋找發(fā)生正突變的菌株。如果從大量的待選輻照菌中進(jìn)行定量或半定量篩選分析，工作量巨大，不切合實際。一般根據(jù)經(jīng)驗依據(jù)微生物的形態(tài)和高產(chǎn)菌的關(guān)系或根據(jù)比透明圈與對照的比透明大小進(jìn)行篩選。形成透明圈的大小不僅與遺傳有關(guān)還與培養(yǎng)條件有關(guān)。為了消除培養(yǎng)環(huán)境的誤差，在此規(guī)定當(dāng)比透明大于對照比透明25%為正突變，小于25%為負(fù)突變，在此±25%之間認(rèn)為是沒有發(fā)生突變。三. 材料與儀器 1. 材料（出發(fā)菌株選取一個；例如枯草芽孢桿菌）蛋白胨，牛肉膏，NaCl，瓊脂條，可溶性淀粉，碘液。2. 儀器紫外燈、磁力攪拌器、報紙、紅燈泡、燈口、電線、插座、瓶皿、無菌三角瓶（內(nèi)含玻璃珠）、含

6、有磁針的無菌瓶皿四方法與步驟1. 培養(yǎng)基可溶性淀粉2g，NaCl 5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，瓊脂20g，水 1000ml2. 無菌生理鹽水3. 出發(fā)菌株的制備（無菌條件下操作）將出發(fā)菌株從試管中用25mL生理鹽水多次洗出洗出，倒入含有玻璃珠的無菌三角瓶中，進(jìn)行反復(fù)振蕩20min。4. 紫外線誘變及初篩選擇合適輻照劑量對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，接入搖瓶培養(yǎng)2個小時后稀釋涂布平板，用報紙包裹在黑暗條件下培養(yǎng)48h，然后噴灑稀碘液記錄比透明圈。比透明圈透明圈直徑（mm）/ 菌落直徑（mm）五.記錄匯總與分析1.列出各組結(jié)果2.各做進(jìn)行對比分析在不同劑量條件的正突變發(fā)生率和發(fā)生正突變幅度和計量的關(guān)系以

7、及發(fā)生最大突變的幅度在什么劑量條件下。六討論七作業(yè) 1. 統(tǒng)計不同劑量條件的正突變發(fā)生率和發(fā)生正突變幅度和計量的關(guān)系以及發(fā)生最大突變的幅度在什么劑量條件下的意義是什么？2. 為什么最后把最佳誘變劑量用致死率和正突變率進(jìn)行表示，而不用誘變時間進(jìn)行描述？實訓(xùn)三 產(chǎn)淀粉酶菌株的誘變育種結(jié)果觀察及優(yōu)良菌株的篩選實訓(xùn)四磷細(xì)菌扁平種的擴(kuò)大生產(chǎn)一、實訓(xùn)目的：掌握菌種的純化、復(fù)壯，扁平種擴(kuò)大培養(yǎng)過程二、實訓(xùn)用品：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、酒精燈、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、扁瓶、顯微鏡、計數(shù)板、計數(shù)器等三、實訓(xùn)步驟：1、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制作（試管、三角瓶、扁平培養(yǎng)基）2、保藏菌種的純化、復(fù)壯（革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽孢，為橢圓

8、形或柱形周生或側(cè)生鞭毛，能運(yùn)動，能產(chǎn)生接觸酶即過氧化氫酶陽性）3、挑選出符合特征的數(shù)個單菌落轉(zhuǎn)管擴(kuò)大同時做三角瓶搖床試驗，對達(dá)到生產(chǎn)要求的純化株進(jìn)行扁瓶擴(kuò)大培養(yǎng)四、 磷細(xì)菌扁瓶種質(zhì)量鑒定1、無噬菌斑、無污染，符合磷細(xì)菌培養(yǎng)特征2、芽孢形成情況實訓(xùn)五青霉菌種實驗室階段擴(kuò)大生產(chǎn)（米孢子生產(chǎn)）一、 實訓(xùn)目的：掌握菌種的純化、復(fù)壯，米孢子的擴(kuò)大培養(yǎng)過程二、 實訓(xùn)用品：PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、酒精燈、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、小米、蒸鍋、三角瓶、扁平、顯微鏡搖床、計數(shù)板、計數(shù)器等三、 實訓(xùn)步驟：1、PDA培養(yǎng)基的制做1、 保藏菌種的純化復(fù)壯（挑選出符合特征的單菌落）2、 挑選出符合特征的數(shù)個單孢子菌落轉(zhuǎn)管同時做

9、三角瓶搖床發(fā)酵實驗，一個菌落做三到四個平行樣，選出產(chǎn)抗生素效價高的復(fù)壯株進(jìn)行米孢子的擴(kuò)大培養(yǎng)3、 米孢子的擴(kuò)大培養(yǎng)四、 米孢子質(zhì)量鑒定1、 無雜菌污染2、 米孢子成熟度，顏色、米孢子數(shù)量集中實訓(xùn)：一、食品的微生物檢驗（講授、演示）教學(xué)目標(biāo)： 1、掌握食品中菌落總數(shù)測定意義及方法2、掌握食品中大腸菌群測定意義及方法3、掌握沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌的檢驗方法4、掌握食品中酵母菌及霉菌總數(shù)的檢驗方法5、掌握食品中黃曲霉毒素B1的檢驗方法6、罐頭食品商業(yè)無菌的檢驗二、 食品中灰分的測定一、概述（一）、灰分的基本概念食品經(jīng)灼燒后所殘留的無機(jī)物質(zhì)即為灰分（二）、灰分測定的主要意義1、食品的灰分中

10、含有豐富的礦物質(zhì)元素,大量元素和微量元素,在維持機(jī)體的正常生理功能,保障人體健康方面具有重要意義.2、食品的總灰分含量是某些食品的重要質(zhì)量指標(biāo)，是食品常規(guī)檢驗的項目之一。3、判斷食品受污染的程度 （三）、灰分的分類1、粗灰分（總灰分）灰分不完全或不確切地代表無機(jī)物的總量，如某些金屬氧化物會吸收有機(jī)物分解產(chǎn)生的CO2而形成碳酸鹽，使無機(jī)成分增多了，有的又揮發(fā)了（如Cl、I、Pb為易揮發(fā)元素。有機(jī)P、S等生成磷酸鹽和硫酸鹽，質(zhì)量有所變化。而且不能完全排除混入的泥沙、塵埃及未燃盡的炭粒。因此灼燒后的殘留物稱為粗灰分（總灰分）。2、水溶性灰分反映可溶性K、Na、Ca、Mg等元素的氧化物和鹽類的含量。3

11、、水不溶性灰分反映Fe、Al等金屬的氧化物、堿土金屬的堿式磷酸鹽的含量,以及由于污染混入產(chǎn)品的泥砂等機(jī)械性物質(zhì).4、酸不溶性灰分反映污染的泥沙及機(jī)械物和食品中原來存在的微量SiO2的含量。二、總灰分的測定 (一) 原理：把一定的樣品經(jīng)炭化后放入高溫爐內(nèi)灼燒轉(zhuǎn)化，稱量殘留物的重量至恒重，計算出樣品總灰分的含量。 灰分的測定過程（以瓷坩堝為例） 1、瓷坩堝的準(zhǔn)備將新坩堝用（1:4）的HCl煮沸12小時，洗凈涼干。用0.5%FeCl3 與等量藍(lán)墨水的混合液在坩堝外壁及蓋子上編號。 2、樣品的預(yù)處理可用測定水分之后的樣品。富含脂肪的樣品先提取脂肪后再測灰分。對于液體樣品應(yīng)先在水浴上蒸干，否則直接炭化，

12、液體沸騰易造成濺失。果蔬、動物組織等含水分較多的樣品,先制備成均勻樣品，再準(zhǔn)確稱取樣品置于已知重量坩堝中，放烘箱中干燥（先6070，后105），再炭化。 谷物、豆類等水分含量較少的固體樣，粉碎均勻后可直接稱取、炭化。 3、炭化樣品準(zhǔn)確稱量一定量處理好的樣品，放在高溫爐之前，要先進(jìn)行炭化處理，炭化操作一般在電爐下進(jìn)行，半蓋坩堝蓋，小心加熱使樣品在通氣情況下逐漸炭化，直至無黑煙產(chǎn)生。對易膨脹、發(fā)泡的如含糖多的，含蛋白多的樣品，可在樣品上加數(shù)滴辛醇或純植物油，再進(jìn)行炭化。4、灰化炭化后，把坩堝移入已達(dá)規(guī)定溫度（525 600）的高溫爐口，稍停片刻，再慢慢移入爐膛內(nèi)，以下操作同求坩堝恒重時一樣，至恒重

13、，即兩次結(jié)果相差< 0.5 mg 。（二）加速灰化的方法樣品初步灼燒后，取出，冷卻，從灰化容器邊緣慢慢加入少量無離子水，使殘灰充分濕潤（不可直接灑在殘灰上，以防殘灰飛揚(yáng)損失），用玻璃棒研碎，使水溶性鹽類溶解，被包住的C粒暴露出來，把玻璃棒上粘的東西用水沖進(jìn)容器里，在水浴上蒸發(fā)至干涸，至 120 130烘箱內(nèi)干燥，再灼燒至恒重。經(jīng)初步灼燒后，放冷，加入幾滴HNO3、雙氧水等，蒸干后再灼燒至恒重，利用它們的氧化作用來加速C?；一?。也可加入10（NH4）2CO3等疏松劑，促進(jìn)灰化。這些物質(zhì)的添加不會增加殘灰的質(zhì)量，灼燒后完全消失。 （3）添加 MgO、CaCO3 等惰性不溶物質(zhì)，它們的作用純屬

14、機(jī)械性，它們和灰分混雜在一起，使C粒不受覆蓋，應(yīng)做空白試驗，因為它們使殘灰增重。（三）注意事項：從干燥器中取出冷卻的坩堝時，因內(nèi)部成真空，開蓋恢復(fù)常壓時應(yīng)讓空氣緩緩進(jìn)入，以防殘灰飛散?；一蟮臍堅闪糇鰿a、P、Fe等成分的分析。新坩堝使用前須在HCl（1+4）中煮沸12小時，自來水或蒸餾水洗凈烘干。用過的坩堝，應(yīng)把殘灰及時倒掉，初步洗刷后，用粗HCl(廢）浸泡1020分鐘，再用水沖刷洗凈。炭化時，應(yīng)避免樣品明火燃燒而導(dǎo)致微粒噴出，只有在炭化完全，不冒煙時才能放入高溫電爐中，灼燒空坩堝與灼燒樣品條件一致減少系統(tǒng)誤差。對含糖分、淀粉、蛋白質(zhì)、較高的樣品防止其發(fā)泡溢出，炭化前加數(shù)滴純植物油，灼燒溫

15、度不超600，否則造成鉀、鈉、氯等易揮發(fā)成分損失。灰分重點：灰分的定義、分類?？偦曳值臏y定原理、方法、條件、加速灰化的方法。三、 食品中脂肪含量測定一、概述（一）脂類物質(zhì)的測定意義 1、脂肪是食品中重要的營養(yǎng)成分之一。是食物中能量最高的營養(yǎng)素。但是攝入過量對人體健康不利！脂肪 = 甘油（丙三醇） + 脂肪酸 2、在食品加工生產(chǎn)過程中，原料，半成品，成品的脂類含量對產(chǎn)品的風(fēng)味、組織結(jié)構(gòu)、品質(zhì)、外觀、口感等都有直接影響，所以脂肪含量是一項重要的控制指標(biāo)。（二）脂類的測定不同來源的食品所含的脂肪在結(jié)構(gòu)上有許多差異，所以也沒有一種通用的提取劑。脂類的共同特點是在水中的溶解度非常小，能溶于脂肪溶劑中，再

16、根據(jù)相似相溶的規(guī)律具體選擇溶劑。常用測定脂類的有機(jī)溶劑： 1、乙醚乙醚可飽和2%的水。含水乙醚在萃取脂肪的同時，會抽提出糖分等非脂成分。所以必須用無水乙醚作提取劑，被測樣品也要事先烘干 2、石油醚石油醚的沸點比乙醚高，不太易燃，溶解脂肪能力比乙醚弱，吸收水分比乙醚少，允許樣品含微量的水分。有時也采取乙醚+石油醚共用。但乙醚、石油醚都只能提取樣品中游離態(tài)的脂肪。對于結(jié)合態(tài)的脂類，必須預(yù)先用酸或堿及乙醇破壞脂類與非脂類的結(jié)合后，才能提取。 3、氯仿甲醇一種有效的溶劑，對脂蛋白、磷脂提取效率較高。特別適用于水產(chǎn)品、家禽、蛋制品中脂肪的提取。樣品的予處理 1、固體樣品要粉碎，顆粒大小要合適，注意粉碎過

17、程中的溫度，防止脂肪氧化。 2、樣品要干燥 3、酸水解對于乙醚不能滲入內(nèi)部的或含結(jié)合態(tài)脂肪。 二、脂類的測定方法 (一)索氏提取法 1、原理將經(jīng)前處理的、分散且干燥的樣品用乙醚或石油醚等溶劑回流提取，使樣品中的脂肪進(jìn)入溶劑中，回收溶劑后所得到的殘留物，即為粗脂肪。粗脂肪殘留物中除游離脂肪外，還含有色素、樹脂、蠟狀物、揮發(fā)油等。 2、適用范圍與特點適用于脂類含量較高，結(jié)合態(tài)脂類含量少或經(jīng)水解處理過的,（結(jié)合態(tài)已轉(zhuǎn)變成游離態(tài)），樣品應(yīng)能烘干，磨細(xì)，不易吸濕結(jié)塊。此法經(jīng)典，對大多數(shù)樣品的測定結(jié)果比較可靠。但費時長（816 h）溶劑用量大，需要專門的儀器,索氏提取器。 3、測定方法 (1)濾紙筒的制備

18、 (2)樣品處理固體樣品：精密稱取干燥并研細(xì)的樣品 25g（可取測定水分后的樣品)，必要時拌以海砂，無損地移入濾紙筒內(nèi)。半固體或液體樣品：稱取5.0一10.0g于蒸發(fā)皿中，加入海砂約20g于沸水浴上蒸干后，再于95105烘干、研細(xì)，全部移入濾紙筒內(nèi)，蒸發(fā)皿及粘附有樣品的玻璃棒都用沾有乙醚的脫脂棉擦凈，將棉花一同放進(jìn)濾紙筒內(nèi)。 (3)抽提將濾紙筒或濾紙包放入索氏抽提器內(nèi)，連接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入無水乙醚或石油醚（3060沸程），加量為接受瓶的23體積，于水浴上(夏天65，冬天80左右)加熱使乙醚或石油醚不斷的回流提取，一般視含油量高低提取612小時，至抽提完全為止（用濾紙試

19、）。 (4)稱重取下接受瓶，回收乙醚或石油醚，待接受瓶內(nèi)乙醚剩 1 2 ml 時，在水浴上蒸干，再于100105干燥 2小時，取出放干燥器內(nèi)冷卻30分鐘，稱重，并重復(fù)操作至恒重。 4、結(jié)果計算脂肪()(m2-m1) / m×100 m2接受瓶和脂肪的質(zhì)量，g； ml接受瓶的質(zhì)量，g； m樣品的質(zhì)量(如為測定水分后的樣品質(zhì)量計)，g。 5、注意及說明 (1)樣品應(yīng)干燥后研細(xì)，樣品含水分會影響溶劑提取效果，而且溶劑會吸收樣品中的水分造成非脂成分溶出。裝樣品的濾紙筒一定要嚴(yán)密，不能往外漏樣品，但不要包得太緊影響溶劑滲透。放入濾紙筒時高度不要超過回流彎管，否則超過彎管的樣品中的脂肪不能提盡，

20、造成誤差。 (2)對含多量糖及糊精的樣品，要先以冷水使糖及糊精溶解，經(jīng)過濾除去，將殘渣連同濾紙一起烘干，再一起放入抽提管中。 (3)抽提用的乙醚或石油醚要求無水、無醇、無過氧化物，揮發(fā)殘渣含量低。因水和醇可導(dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解，如水溶性鹽類、糖類等，使得測定結(jié)果偏高。過氧化物會導(dǎo)致脂肪氧化，在烘干時也有引起爆炸的危險。 (4)乙醚中過氧化物的檢查方法：取6ml 乙醚，加2ml 10%的碘化鉀溶液，用力振搖，放置1分鐘，若出現(xiàn)黃色，則證明有過氧化物存在。過氧化物如:H2O2、Na2O2、CaO2、 BaO2、 ZnO2、 MgO2等去處過氧化物的方法：將乙醚倒入蒸餾瓶中，加一段無銹鐵絲或鋁絲，收集

21、重蒸餾乙醚(5)提取時水浴溫度不可過高，以每分鐘從冷凝管滴下80滴左右，每小時回流612次為宜，提取過程應(yīng)注意防火。 (6)在抽提時，冷凝管上端最好連接一個氯化鈣干燥管，這樣，可防止空氣中水分進(jìn)入，也可避免乙醚揮發(fā)在空氣中，如無此裝置可塞一團(tuán)干燥的脫脂棉球。 (7)抽提是否完全，可憑經(jīng)驗，也可用濾紙或毛玻璃檢查，由抽提管下口滴下的乙醚滴在濾紙或毛玻璃上，揮發(fā)后不留下油跡表明已抽提完全。(8)在揮發(fā)乙醚或石油醚時，切忌用直接火加熱，應(yīng)該用電熱套，電水浴等。烘前應(yīng)驅(qū)除全部殘余的乙醚，因乙醚稍有殘留，放入烘箱時，有發(fā)生爆炸的危險。 (9)反復(fù)加熱會因脂類氧化而增重。重量增加時，以增重前的重量作為恒重

22、。 (10)因為乙醚是易燃、易爆物質(zhì)麻醉劑，要注意室內(nèi)通風(fēng)，并且不能有火源。樣品及醚的浸出物在烘箱中干燥時，時間不能過長，防止極不飽和的脂肪酸氧化增重，一般真空能夠干燥箱70-75干燥1小時，普通干燥箱中于95-105干燥1-2小時，冷卻稱重后，再于同樣溫度下干燥0.5小時，如此反復(fù)干燥直恒重。四、食品中蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量的測定一、食品中蛋白質(zhì)的含量及測定意義二、凱氏定氮法凱氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出，經(jīng)長期改進(jìn)，已演變?yōu)楝F(xiàn)在的常量法、微量法、半微量法以及自動定氮儀法等多種方法。由于凱氏定氮法是測定食品中總氮量后，乘以蛋白質(zhì)系數(shù)而得到蛋白質(zhì)含量，不能將樣品中常含有的胺、

23、核酸、生物堿、含氮脂類、色素等非蛋白質(zhì)的含氮物質(zhì)分離，故結(jié)果稱粗蛋白質(zhì)。1、半微量凱氏定氮法（1）原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使食品中有機(jī)物分解，其中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水逸出，蛋白質(zhì)中的氮轉(zhuǎn)化為氨并與硫酸結(jié)合生成硫酸銨留在硫酸中。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后，再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。有關(guān)化學(xué)反應(yīng)方程式如下:樣品（蛋白質(zhì)及其它有機(jī)化合物）H2SO4 （NH4）2SO4CO2SO2H2O催化劑2NaOH（NH4）2SO4 2NH3Na2SO42H2O2NH3H3BO3（NH4）2B4O75H2O（NH4）2B4

24、O75H2O HCL2NH4CL4 H3BO3（2）試劑（3）儀器（4）操作方法樣品處理:準(zhǔn)確稱取0.22.0g固體樣品或 25g半固體樣品或吸取102OmL液體樣品(約相當(dāng)?shù)?040mg，移入干燥的100mL或500mL凱氏燒瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20mL濃硫酸，搖均后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至溶液呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h。取下放冷，小心加20mL水。放冷后，轉(zhuǎn)移入100mL容量瓶中，并用少量水洗凱氏燒瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，搖勻備用。取

25、與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白試驗。蒸餾及滴定:按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至約2/3處，加甲基紅指示液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，用調(diào)壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。向100ml接收瓶內(nèi)加入10ml硼酸溶液（20g/L）及混合指示液1-2滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0mL樣品消化稀釋液，由小玻杯加入反應(yīng)室，并以l0mL水洗滌小玻杯，洗液流入反應(yīng)室，塞緊小玻杯的棒狀玻塞。將l0mL氫氧化鈉溶液 (400g/L)倒入小玻杯，提起玻塞使其流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。

26、蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過冷凝管而進(jìn)入接收瓶內(nèi)，蒸餾 5 min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾 l min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液 (0.05mol/L)滴定至灰色或紫紅色。同時吸取10.0mL試劑空白消化液同樣進(jìn)行蒸餾及滴定（5）計算（6）說明及注意事項樣品消化時，濃硫酸的脫水性使有機(jī)物脫水碳化，加熱條件下，濃硫酸的氧化性將碳氧化為二氧化碳，氫生成水，硫酸則被還原為二氧化硫: 2H2S04+C2S02+2H2O+CO2二氧化硫?qū)⒌€原為氨，本身則被氧化為三氧化硫。氨與硫酸作用生成硫酸銨，留在溶液中:H2S04+2NH3=(NH4)2S04消化時

27、加入硫酸銅作為催化劑，加速反應(yīng)的進(jìn)行。除硫酸銅外，氧化汞、汞、硒粉、二氧化鐵等也可作為消化反應(yīng)的催化劑，其中汞化合物催化效果最好，但汞及汞化合物劇毒，考慮到催化效果、價格及對環(huán)境的污染等因素，應(yīng)用最多的是硫酸銅。硫酸銅還可作為蒸餾時樣液堿化時的指示劑，若加堿不足，樣液呈藍(lán)色而不生成氫氧化銅沉淀，需增加堿量。消化時加入硫酸鉀可以提高消化溫度，加快有機(jī)物分解。硫酸的沸點在340左右，加入硫酸鉀后，可使硫酸沸點提高到400以上。硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度過高，會使銨鹽分解而損失。除硫酸鉀外，硫酸鈉也有同樣作用，但效果不如硫酸鉀。樣品消化時，還可加入少量過氧化氫、次氯酸鈉等氧化劑，加速有機(jī)物氧化。消化時注意轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，利用冷凝的硫酸將附在瓶壁上的固體洗下，保證樣品消化完全。樣品含脂肪或糖較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，應(yīng)注意控制熱源強(qiáng)度；以免泡沫溢出瓶外。一般消化至呈清透明后，再消化3Omin即可。有機(jī)物分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，含鐵較多時，呈較深綠色。蒸餾裝置不能漏氣。蒸餾時，水蒸氣氣量應(yīng)均勻充足，蒸餾過程不能?；饠鄽?，以免發(fā)生倒吸。氨是否蒸餾完全可用pH試紙進(jìn)行檢查，也可控制蒸餾時間確定。 硼酸作為吸收液，由于硼酸是極弱的酸，在此只起吸收氨的作用