第十三章-酶類藥物的分析

1、1酶類藥物的分析酶類藥物的分析第一節(jié)第一節(jié) 概述概述第二節(jié)第二節(jié) 酶類藥物的鑒別與檢查酶類藥物的鑒別與檢查第三節(jié)第三節(jié) 酶活力測定方法酶活力測定方法第四節(jié)第四節(jié) 酶活力測定方法設(shè)計(jì)酶活力測定方法設(shè)計(jì)第五節(jié)第五節(jié) 典型酶類藥物的檢測典型酶類藥物的檢測2第一節(jié)第一節(jié) 概述概述n在生物體內(nèi)，酶能降低生化反應(yīng)在生物體內(nèi)，酶能降低生化反應(yīng)活化能活化能，加快可逆，加快可逆反應(yīng)的進(jìn)行速度，使之盡快達(dá)到平衡。反應(yīng)的進(jìn)行速度，使之盡快達(dá)到平衡。n一、酶的特性一、酶的特性n二、酶的分類二、酶的分類n三、酶的化學(xué)組成三、酶的化學(xué)組成n四、酶的催化反應(yīng)機(jī)制四、酶的催化反應(yīng)機(jī)制n五、酶催化反應(yīng)動力學(xué)五、酶催化反應(yīng)動力學(xué)

2、3一、酶的特性一、酶的特性 1酶是高效催化劑。酶是高效催化劑。 n2酶對底物的結(jié)構(gòu)具有嚴(yán)格的選擇性。酶對底物的結(jié)構(gòu)具有嚴(yán)格的選擇性。 n（1）相對專一性：）相對專一性：n（2）絕對專一性）絕對專一性:n（3）立體異構(gòu)專一性）立體異構(gòu)專一性:n3酶催化反應(yīng)的反應(yīng)條件溫和。酶催化反應(yīng)的反應(yīng)條件溫和。n4酶的催化活性在生物體內(nèi)受多種因素的調(diào)節(jié)酶的催化活性在生物體內(nèi)受多種因素的調(diào)節(jié)。4二、酶的分類二、酶的分類n氧化還原酶氧化還原酶n轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶n水解酶水解酶n裂合酶裂合酶n異構(gòu)酶異構(gòu)酶n合成酶（或稱連接酶）合成酶（或稱連接酶）5三、酶的化學(xué)組成三、酶的化學(xué)組成 n分為分為簡單酶和結(jié)合酶簡單酶和結(jié)合酶兩

3、大類。兩大類。n結(jié)合酶類中除含有蛋白外，還含有某種熱穩(wěn)定結(jié)合酶類中除含有蛋白外，還含有某種熱穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)的小分子物質(zhì)，二者結(jié)合起來，稱的非蛋白質(zhì)的小分子物質(zhì)，二者結(jié)合起來，稱為為“全酶全酶”，才呈現(xiàn)生物催化活性。，才呈現(xiàn)生物催化活性。n結(jié)合酶結(jié)合酶 = 酶蛋白酶蛋白 + 輔助因子輔助因子6四、酶的催化反應(yīng)機(jī)制四、酶的催化反應(yīng)機(jī)制 n1酶酶-底物復(fù)合物的形成底物復(fù)合物的形成 在酶促反應(yīng)中，反應(yīng)在酶促反應(yīng)中，反應(yīng)底物首先與酶分子上活性部位結(jié)合，形成底物首先與酶分子上活性部位結(jié)合，形成酶酶-底底物復(fù)合物物復(fù)合物，降低反應(yīng)的，降低反應(yīng)的活性能活性能，使酶促反應(yīng)順，使酶促反應(yīng)順利進(jìn)行。利進(jìn)行。n2酶酶

4、-底物復(fù)合物加速反應(yīng)速率的原因底物復(fù)合物加速反應(yīng)速率的原因n（1）定向作用與底物濃縮）定向作用與底物濃縮 n（2）酶使底物分子變形）酶使底物分子變形 n（3）酸堿催化）酸堿催化n（4）共價(jià)催化）共價(jià)催化 。7五、酶催化反應(yīng)動力學(xué)五、酶催化反應(yīng)動力學(xué) n酶的活力單位酶的活力單位 酶活性單位（酶活性單位（U）是酶活性是酶活性高低的一種量度，用高低的一種量度，用U/g或或U/ml表示。表示。n酶活力單位定義：在規(guī)定的條件下，每分酶活力單位定義：在規(guī)定的條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化鐘能轉(zhuǎn)化1mol底物所需要的酶量，稱一底物所需要的酶量，稱一個(gè)酶的活力單位。個(gè)酶的活力單位。n酶的比活力酶的比活力 每毫克酶蛋白所

5、含酶活力，每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg。 8Michaelis-MentenMichaelis-Menten快速平衡學(xué)說快速平衡學(xué)說n底物濃度的增加，反應(yīng)底物濃度的增加，反應(yīng)速度上升呈速度上升呈雙曲線雙曲線。n在在低底物濃度低底物濃度時(shí)，反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)速度呈直線上升，表現(xiàn)速度呈直線上升，表現(xiàn)為為一級反應(yīng)一級反應(yīng)。n在高濃度時(shí)，反應(yīng)速度在高濃度時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值，呈現(xiàn)達(dá)到一個(gè)極限值，呈現(xiàn)零級反應(yīng)零級反應(yīng)。9米氏方程米氏方程n酶反應(yīng)動力學(xué)方程式：酶反應(yīng)動力學(xué)方程式：nV反應(yīng)初速度反應(yīng)初速度nVm最大反應(yīng)速度最大反應(yīng)速度nKs 米氏常數(shù)，米氏常數(shù)，Ks=K1/K1， Ks為為ES的解離常數(shù)

6、，的解離常數(shù)，表示酶與底物的親和力表示酶與底物的親和力。nKs為反應(yīng)速度為反應(yīng)速度V是最大反應(yīng)速度是最大反應(yīng)速度Vm一半時(shí)所需底物濃一半時(shí)所需底物濃度，即度，即V=1/2 Vm時(shí)，時(shí)，Ks=S。10Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)學(xué)說穩(wěn)態(tài)學(xué)說 nES的形成速度與的形成速度與ES的解離速度相等，達(dá)到的解離速度相等，達(dá)到動態(tài)平動態(tài)平衡衡，即，即“穩(wěn)態(tài)穩(wěn)態(tài)”，反應(yīng)方程式：，反應(yīng)方程式：nKm取代了取代了Ks，當(dāng)當(dāng)V=1/2 Vm時(shí)，時(shí)，Km=S。nKm也可表示為底物與酶的親和力。也可表示為底物與酶的親和力。11第二節(jié)第二節(jié) 酶類藥物的鑒別與檢查酶類藥物的鑒別與檢查n鑒別方法常用鑒別方法常用蛋白質(zhì)鑒別

7、方法蛋白質(zhì)鑒別方法，如在堿性條件，如在堿性條件下的雙縮脲反應(yīng)。下的雙縮脲反應(yīng)。n專用于酶的鑒別方法：專用于酶的鑒別方法：n 酶活性試驗(yàn)：與特異性底物反應(yīng)（酶活性試驗(yàn)：與特異性底物反應(yīng)（胰蛋白酶胰蛋白酶）。）。n 沉淀試驗(yàn)沉淀試驗(yàn)：胃蛋白酶胃蛋白酶n 動物試驗(yàn)：動物試驗(yàn)：透明質(zhì)酸酶透明質(zhì)酸酶水解粘多糖。水解粘多糖。 12酶類藥物的檢查酶類藥物的檢查 n酶類藥物是生化產(chǎn)品和微生物發(fā)酵產(chǎn)品，在酶類藥物是生化產(chǎn)品和微生物發(fā)酵產(chǎn)品，在生產(chǎn)過程中可能帶入微量的生產(chǎn)過程中可能帶入微量的脂肪類物質(zhì)、其脂肪類物質(zhì)、其他的酶類和大分子雜質(zhì)他的酶類和大分子雜質(zhì)，影響酶質(zhì)量，需有，影響酶質(zhì)量，需有含量限度。含量限度。

8、13酶類藥物的檢查酶類藥物的檢查n（一）脂肪含量限度檢查一）脂肪含量限度檢查n檢查方法，乙醚浸提，干燥檢查方法，乙醚浸提，干燥，精密稱定，脂肪精密稱定，脂肪不得過規(guī)定的含量不得過規(guī)定的含量。n（二）其他酶類含量限度檢查二）其他酶類含量限度檢查n胰蛋白酶、糜蛋白酶均是從牛、豬的胰臟中提胰蛋白酶、糜蛋白酶均是從牛、豬的胰臟中提取的蛋白分解酶。取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶時(shí)又易帶入微提取胰蛋白酶時(shí)又易帶入微量的糜蛋白酶量的糜蛋白酶。n（三）大分子活性物質(zhì)含量限度檢查（三）大分子活性物質(zhì)含量限度檢查14胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量n每每2500U胰蛋白酶中不得多于胰蛋白酶中

9、不得多于50U的糜蛋白酶。的糜蛋白酶。n糜蛋白酶專屬水解糜蛋白酶專屬水解芳香氨基酸芳香氨基酸（L-酪氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸）苯丙氨酸）的羧基形成的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵的羧基形成的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵。n用用N-乙酰乙酰-L-酪氨酸乙酯酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-Tyrosine Ethylester，ATEE）作底物，通過作底物，通過分光光度法測定此分光光度法測定此酶對底物的水解速率酶對底物的水解速率來檢查來檢查該酶的含量限度。該酶的含量限度。15第三節(jié)第三節(jié) 酶活力測定方法酶活力測定方法n固定時(shí)間法固定時(shí)間法 n連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法 n （一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示

10、的連續(xù)監(jiān)測法：作指示的連續(xù)監(jiān)測法：n 直接測定法直接測定法 n 偶聯(lián)法偶聯(lián)法n 三聯(lián)酶活測定三聯(lián)酶活測定n （二）、不需（二）、不需NAD+或或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法：作指示的連續(xù)監(jiān)測法：n固定濃度法固定濃度法 16一、固定時(shí)間法一、固定時(shí)間法 n在適宜的條件下，使酶和底物共同保溫在適宜的條件下，使酶和底物共同保溫一定一定時(shí)間時(shí)間，然后測定，然后測定產(chǎn)物生成的量產(chǎn)物生成的量或或底物消耗的底物消耗的量量從而間接推算出酶的含量（或活力）。從而間接推算出酶的含量（或活力）。n nE表示酶濃度，表示酶濃度，P為反應(yīng)產(chǎn)物濃度，為反應(yīng)產(chǎn)物濃度，t 表表示酶作用時(shí)間，示酶作用時(shí)間，K為常數(shù)。為常數(shù)。1

11、7注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)n缺點(diǎn)：無法了解整個(gè)反應(yīng)缺點(diǎn)：無法了解整個(gè)反應(yīng)過程是否都是零級反應(yīng)。過程是否都是零級反應(yīng)。n注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：n1、底物飽和、底物飽和n2、時(shí)間、時(shí)間18二、連續(xù)監(jiān)測法二、連續(xù)監(jiān)測法 n在酶反應(yīng)過程中，在酶反應(yīng)過程中，連續(xù)記錄不同時(shí)間的底物消耗量連續(xù)記錄不同時(shí)間的底物消耗量或產(chǎn)物生成量或產(chǎn)物生成量。 n（一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法作指示的連續(xù)監(jiān)測法n（二）、不需（二）、不需NAD+或或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法作指示的連續(xù)監(jiān)測法19（一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法：作指示的連續(xù)監(jiān)測法：n還原型輔酶（還原型輔酶（N

12、ADH和和NADPH）在在340nm處有處有紫外吸收紫外吸收，氧化型輔酶（，氧化型輔酶（NAD+和和NADP+）在在340nm處無紫外吸收處無紫外吸收.n利用利用340nm處每分鐘處每分鐘吸收度升高或降低的速率吸收度升高或降低的速率與與酶活性成正比的關(guān)系，推算出酶的活力單位。酶活性成正比的關(guān)系，推算出酶的活力單位。n包括：包括：n 直接測定法直接測定法 n 偶聯(lián)法偶聯(lián)法n 三聯(lián)酶活測定三聯(lián)酶活測定 20直接測定法直接測定法n大多數(shù)需大多數(shù)需NADH（NADPH）參加的脫氫酶，參加的脫氫酶，可利用紫外分光光度法可利用紫外分光光度法直接測定反應(yīng)體系在直接測定反應(yīng)體系在340nm處吸收度的變化處吸收

13、度的變化，計(jì)算酶活力單位。，計(jì)算酶活力單位。n丙酮酸丙酮酸NADHH+ 乳酸乳酸NAD+ n340nm處吸收度降低的速率處吸收度降低的速率與與NADH的氧化速的氧化速率成正比，率成正比，與與LDH的活力成正比的活力成正比。21偶聯(lián)法偶聯(lián)法n此類酶催化反應(yīng)不需此類酶催化反應(yīng)不需NAD+或或NADP+，但當(dāng)與需但當(dāng)與需NAD+或或NADP+的脫氫酶反應(yīng)偶聯(lián)的脫氫酶反應(yīng)偶聯(lián)以后，能用以后，能用紫外紫外分光光度法測定分光光度法測定. .n由脫氫酶引起的反應(yīng)為由脫氫酶引起的反應(yīng)為指示反應(yīng)指示反應(yīng)，脫氫酶是指示酶，脫氫酶是指示酶，指示酶活力要比測定酶活力至少大指示酶活力要比測定酶活力至少大100倍倍。n例

14、如：谷草轉(zhuǎn)氨酶的測定：例如：谷草轉(zhuǎn)氨酶的測定：22三聯(lián)酶活測定三聯(lián)酶活測定n引入一個(gè)輔助酶反應(yīng)，將被測酶反應(yīng)系統(tǒng)與指示酶反應(yīng)系統(tǒng)聯(lián)引入一個(gè)輔助酶反應(yīng)，將被測酶反應(yīng)系統(tǒng)與指示酶反應(yīng)系統(tǒng)聯(lián)系起來，組成一個(gè)系起來，組成一個(gè)“三合一三合一”酶反應(yīng)系統(tǒng)酶反應(yīng)系統(tǒng)，使底物轉(zhuǎn)化率、輔，使底物轉(zhuǎn)化率、輔助酶反應(yīng)和助酶反應(yīng)和NADH（NADPH）氧化速率之間成正比函數(shù)關(guān)系，氧化速率之間成正比函數(shù)關(guān)系，輔助酶和指示酶的活力必須大大超過測定酶活力輔助酶和指示酶的活力必須大大超過測定酶活力。n例如：磷酸肌酸例如：磷酸肌酸+ADP 肌酸肌酸ATP (1)n 葡萄糖葡萄糖ATP G-6-P ADP (2)nG-6-P +

15、 NADP+ 葡萄糖酸葡萄糖酸-6-磷酸磷酸 NADPH H+ (3)n(1) 被測反應(yīng)，被測反應(yīng)，(2)輔助反應(yīng)，輔助反應(yīng)，HK（己糖激酶）輔助酶，己糖激酶）輔助酶，(3) 指示反應(yīng)，指示反應(yīng)， G-6-PDH（6磷酸葡萄糖脫氫酶）指示酶。磷酸葡萄糖脫氫酶）指示酶。23（二）不需（二）不需NAD+或或NADP+指示的連續(xù)監(jiān)指示的連續(xù)監(jiān)測法：測法：n酶底物大多是人工合成的酶底物大多是人工合成的“色素元色素元”，其本，其本身無色，經(jīng)身無色，經(jīng)酶作用后釋放出有色的反應(yīng)產(chǎn)物酶作用后釋放出有色的反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)反應(yīng)過程中吸收度增高速率，算出酶活根據(jù)反應(yīng)過程中吸收度增高速率，算出酶活力單位。力單位。n例如

16、：例如：n磷酸對硝基苯酚酯磷酸對硝基苯酚酯 對硝基苯酚對硝基苯酚24三、固定濃度法三、固定濃度法n根據(jù)酶催化反應(yīng)，使根據(jù)酶催化反應(yīng)，使反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)物達(dá)到額定的濃達(dá)到額定的濃度時(shí)其度時(shí)其反應(yīng)時(shí)間與酶濃度成反比反應(yīng)時(shí)間與酶濃度成反比的原理進(jìn)行的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)的。設(shè)計(jì)的。n P=KEtn測定時(shí)間測定時(shí)間.n以所需時(shí)間的倒數(shù)（以所需時(shí)間的倒數(shù)（1/t）對酶濃度作圖即對酶濃度作圖即可制備標(biāo)準(zhǔn)曲線?？芍苽錁?biāo)準(zhǔn)曲線。n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1、記錄時(shí)間。、記錄時(shí)間。2、準(zhǔn)確、準(zhǔn)確25二、底物與產(chǎn)物的測定方法二、底物與產(chǎn)物的測定方法 （酶反應(yīng)的檢酶反應(yīng)的檢測方法測方法） 1、化學(xué)方法化學(xué)方法：用化學(xué)法測定其中某一底物或

17、產(chǎn)物的變化值。：用化學(xué)法測定其中某一底物或產(chǎn)物的變化值。n2、分光光度法分光光度法： 常用的有常用的有比色法比色法和和紫外分光光度法紫外分光光度法。n3、熒光測定法：熒光測定法： 簡單、靈敏、快速簡單、靈敏、快速。n4、電化學(xué)分析法電化學(xué)分析法n（1） 離子選擇性電極分析法離子選擇性電極分析法n（2） 微電流法微電流法n5、其他方法其他方法n如測定氣體的測壓法，測定產(chǎn)物旋光度變化值的旋光測定法。如測定氣體的測壓法，測定產(chǎn)物旋光度變化值的旋光測定法。26第五節(jié)第五節(jié) 酶類藥物的檢測酶類藥物的檢測 n肽鍵水解酶肽鍵水解酶 n 1、胰蛋白酶胰蛋白酶n 2、彈性蛋白酶彈性蛋白酶n 3、尿激酶尿激酶（氣

18、泡上升法氣泡上升法）n脂鍵水解酶脂鍵水解酶胰脂肪酶胰脂肪酶 n糖苷鍵水解酶糖苷鍵水解酶 溶菌酶溶菌酶n其它其它（超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶）27一、肽鍵水解酶一、肽鍵水解酶n1、胰蛋白酶、胰蛋白酶n2、彈性蛋白酶、彈性蛋白酶n3、尿激酶、尿激酶281、胰蛋白酶、胰蛋白酶比色法比色法n胰蛋白酶：由牛、羊、豬等胰蛋白酶：由牛、羊、豬等動物的胰臟中提取動物的胰臟中提取的一種蛋白水解酶的一種蛋白水解酶。n牛胰蛋白酶：牛胰蛋白酶：233個(gè)氨基酸，分子量個(gè)氨基酸，分子量24000，等電點(diǎn)等電點(diǎn)10.1。n豬胰蛋白酶：豬胰蛋白酶：214個(gè)氨基酸，分子量個(gè)氨基酸，分子量23400，等電點(diǎn)等電點(diǎn)10.8。n胰

19、蛋白酶最胰蛋白酶最適適pH為為7.68.0，電泳純的胰蛋，電泳純的胰蛋白酶的比活為白酶的比活為8000單位單位/mg。29原理原理n胰蛋白酶專一作用于賴氨酸、精氨酸等胰蛋白酶專一作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸堿性氨基酸的羧的羧基組成的基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵肽鍵、酰胺鍵及酯鍵，水解速度為酯鍵，水解速度為酯鍵酰胺酰胺鍵鍵肽鍵。肽鍵。nBAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)nBAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)n苯甲酰苯甲酰L精氨酸乙酯（精氨酸乙酯（BAEE）在胰蛋白酶的作用下，在胰蛋白酶的作用下，酯鍵被水解生成苯甲酰酯鍵被水解生成苯甲酰

20、L精氨酸，在精氨酸，在253nm波長處波長處的吸收度隨酶促反應(yīng)遞增，根據(jù)活力單位定義計(jì)算酶活的吸收度隨酶促反應(yīng)遞增，根據(jù)活力單位定義計(jì)算酶活力。力。30測定法：測定法：n取呈取呈直線的吸收度直線的吸收度，按下式計(jì)算：，按下式計(jì)算：nP為為每每mg供試中含胰蛋白酶的量供試中含胰蛋白酶的量，U；A1為直線上終止的吸收度；為直線上終止的吸收度；nA2為直線上開始的吸收度；為直線上開始的吸收度；nT為為A1至至A2讀數(shù)的時(shí)間，讀數(shù)的時(shí)間，min；nW為測定液中供試品的量，為測定液中供試品的量，mg；n吸收度每分鐘改變吸收度每分鐘改變0.003，即相當(dāng)于，即相當(dāng)于1個(gè)胰蛋白酶單位個(gè)胰蛋白酶單位 。31

21、2、胰胰彈性蛋白酶彈性蛋白酶n胰彈性蛋白酶：胰彈性蛋白酶：為肽鏈內(nèi)斷酶為肽鏈內(nèi)斷酶，存在于哺乳動，存在于哺乳動物胰臟。物胰臟。n彈性酶用于治療高血脂癥、動脈粥樣硬化和脂彈性酶用于治療高血脂癥、動脈粥樣硬化和脂肪肝。肪肝。n胰彈性蛋白酶是由胰彈性蛋白酶是由240個(gè)氨基酸組成的單一肽鏈，個(gè)氨基酸組成的單一肽鏈，有四對二硫鍵。分子量為有四對二硫鍵。分子量為25900，等電點(diǎn)等電點(diǎn)為為pH9.5。n胰彈性蛋白酶除水解彈性蛋白外，還可以水解胰彈性蛋白酶除水解彈性蛋白外，還可以水解血紅蛋白、酪蛋白等蛋白。血紅蛋白、酪蛋白等蛋白。n剛果紅彈性蛋白剛果紅彈性蛋白。32原理原理n剛果紅彈性蛋白法剛果紅彈性蛋白法

22、：以剛果紅彈性蛋白為底物，由以剛果紅彈性蛋白為底物，由于剛果紅彈性蛋白酶結(jié)合的共價(jià)鍵能被彈性酶水解，于剛果紅彈性蛋白酶結(jié)合的共價(jià)鍵能被彈性酶水解，根據(jù)根據(jù)剛果紅在剛果紅在495nm處有最大吸收，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查處有最大吸收，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查得彈性酶單位數(shù)。得彈性酶單位數(shù)。n單位：單位：20分鐘水解分鐘水解1mg剛果紅彈性蛋白所需的酶量為剛果紅彈性蛋白所需的酶量為一個(gè)彈性酶活力單位。一個(gè)彈性酶活力單位。33方法方法:n 343、尿激酶、尿激酶n由人尿中分離提純后制得的一種堿性蛋白水解酶。由人尿中分離提純后制得的一種堿性蛋白水解酶。n主要作用是激活人體內(nèi)主要作用是激活人體內(nèi)纖維蛋白溶解酶原纖維蛋白

23、溶解酶原使其成使其成為有為有活性的纖維蛋白溶酶活性的纖維蛋白溶酶，從而解聚血纖維蛋白，從而解聚血纖維蛋白，溶解血栓。溶解血栓。n天然尿激酶的分子量為天然尿激酶的分子量為54000，其作用于纖維蛋其作用于纖維蛋白溶解酶原的賴氨酸或精氨酸鍵使其裂解成纖維白溶解酶原的賴氨酸或精氨酸鍵使其裂解成纖維蛋白溶解酶蛋白溶解酶。35效價(jià)測定原理效價(jià)測定原理(氣泡上升氣泡上升法法)n尿激酶尿激酶激活人體內(nèi)激活人體內(nèi)纖維蛋白溶解酶原纖維蛋白溶解酶原使其轉(zhuǎn)化成使其轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶纖維蛋白溶酶；n纖維蛋白原纖維蛋白原在在凝血酶凝血酶的作用下，轉(zhuǎn)變成的作用下，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝塊纖維蛋白凝塊，此凝塊在，此凝塊在纖維蛋纖

24、維蛋白溶酶白溶酶作用下，水解為可溶性小分子多肽。作用下，水解為可溶性小分子多肽。n在在纖維蛋白溶酶原纖維蛋白溶酶原過量的情況下，過量的情況下，尿激酶量尿激酶量與與纖維蛋白凝塊的溶解時(shí)間纖維蛋白凝塊的溶解時(shí)間的對數(shù)成直線關(guān)系。的對數(shù)成直線關(guān)系。36操作操作n試管中加試管中加纖維蛋白原溶液纖維蛋白原溶液0.3ml（37水?。┧。﹏標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0mln加混合溶液加混合溶液0.4mln立即搖勻計(jì)時(shí)，立即搖勻計(jì)時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在3045秒內(nèi)凝結(jié)秒內(nèi)凝結(jié)，當(dāng)當(dāng)凝塊內(nèi)小氣泡上升到系統(tǒng)體積一半時(shí)凝塊內(nèi)小氣泡上升到系統(tǒng)體積一半時(shí)作為反應(yīng)作為反應(yīng)終點(diǎn)。終點(diǎn)。n以尿激酶的濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)

25、時(shí)間的對數(shù)為以尿激酶的濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)時(shí)間的對數(shù)為縱坐標(biāo)縱坐標(biāo)。37二、脂鍵水解酶二、脂鍵水解酶胰脂肪酶胰脂肪酶n胰脂肪酶是一種水解酶，在一定條件下把胰脂肪酶是一種水解酶，在一定條件下把甘甘油三脂類脂肪油三脂類脂肪逐步水解，最后生成逐步水解，最后生成甘油及相甘油及相應(yīng)的脂肪酸應(yīng)的脂肪酸。n底物底物:橄欖油橄欖油npH指示連續(xù)滴定法：穩(wěn)定指示連續(xù)滴定法：穩(wěn)定pH條件下避免因條件下避免因pH值改變而引起酶活力的改變。值改變而引起酶活力的改變。n用已知濃度的用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)堿溶液標(biāo)準(zhǔn)堿溶液滴定，可定量地測滴定，可定量地測定定脂肪酸脂肪酸的量，從而得知的量，從而得知脂肪酶脂肪酶活力活力。38測定測

26、定n 39計(jì)算計(jì)算n每分鐘每分鐘水解橄欖油水解橄欖油產(chǎn)生產(chǎn)生1mol脂肪酸脂肪酸的酶量，的酶量，為為1個(gè)活力單位。個(gè)活力單位。n每克含有的胰脂肪酶單位每克含有的胰脂肪酶單位nA:供試品消耗供試品消耗NaOH （0.1mol/L）的體積的體積nB:空白消耗空白消耗NaOH （0.1mol/L）的體積的體積nW:供試品取樣量（供試品取樣量（g）nN:供試品稀釋倍數(shù)。供試品稀釋倍數(shù)。40三、糖苷鍵水解酶三、糖苷鍵水解酶 溶菌酶溶菌酶n蛋清中提取的能蛋清中提取的能分解粘多糖的堿性水解酶分解粘多糖的堿性水解酶。n主要作用于革蘭氏陽性菌，使胞壁中的肽聚糖主要作用于革蘭氏陽性菌，使胞壁中的肽聚糖分解導(dǎo)致細(xì)菌

27、溶解。分解導(dǎo)致細(xì)菌溶解。n溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。n溶菌酶分子量為溶菌酶分子量為1400015000，由，由129個(gè)氨基個(gè)氨基酸殘基組成，等電點(diǎn)為酸殘基組成，等電點(diǎn)為10.011.1。n溶菌酶屬糖苷水解酶，能以某些細(xì)菌細(xì)胞中的溶菌酶屬糖苷水解酶，能以某些細(xì)菌細(xì)胞中的多糖為底物。多糖為底物。41效價(jià)測定比濁法效價(jià)測定比濁法n以以溶酶小球菌溶酶小球菌為底物，主要成分為粘多糖，粘多為底物，主要成分為粘多糖，粘多糖由糖由NAG和和NAM重復(fù)而成。重復(fù)而成。n溶菌酶水解專屬性強(qiáng)，它只能水解溶菌酶水解專屬性強(qiáng)，它只能水解NAM C1 和和NAG C4之間之間的的1，4糖

28、苷鍵。糖苷鍵。n溶酶小球菌胞壁中的粘多糖經(jīng)過溶菌酶的水解作溶酶小球菌胞壁中的粘多糖經(jīng)過溶菌酶的水解作用后，菌體因滲透壓不平衡，導(dǎo)致用后，菌體因滲透壓不平衡，導(dǎo)致溶菌溶菌，溶液的，溶液的吸收度下降吸收度下降。n在一定的條件下，每分鐘在一定的條件下，每分鐘吸收度下降吸收度下降0.001為一為一個(gè)酶活力單位。個(gè)酶活力單位。42比濁法測定比濁法測定n計(jì)算：計(jì)算：n酶活力單位（酶活力單位（u/mg） =nW為測試液中供試品為測試液中供試品的重量（的重量（g）43比色法測定溶菌酶活性比色法測定溶菌酶活性 n用染料艷紅用染料艷紅K2BP標(biāo)記的標(biāo)記的M.Lysodeikticus為底物，酶催化細(xì)胞壁分解時(shí)游離

29、出染色碎片為底物，酶催化細(xì)胞壁分解時(shí)游離出染色碎片（產(chǎn)物）（產(chǎn)物）n反應(yīng)后離心除去未分解底物，上清液比色，反應(yīng)后離心除去未分解底物，上清液比色，吸吸收度為溶菌酶活力的函數(shù)收度為溶菌酶活力的函數(shù)。44溶菌酶效價(jià)測定比色法溶菌酶效價(jià)測定比色法n 45四、超氧化物歧化酶四、超氧化物歧化酶n由由哺乳動物紅細(xì)胞哺乳動物紅細(xì)胞分離而得的金屬酶，能分離而得的金屬酶，能催催化超氧化物游離基轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧化超氧化物游離基轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧。n來源于牛、豬、人紅血球的超氧化物歧化酶來源于牛、豬、人紅血球的超氧化物歧化酶（SOD）含銅和鋅，分子量含銅和鋅，分子量32000左右。左右。nSOD對熱較穩(wěn)定，對熱較穩(wěn)

30、定，在在pH5.39.5范圍內(nèi)對范圍內(nèi)對酶活性影響不大。酶活性影響不大。n牛紅細(xì)胞牛紅細(xì)胞SOD PI為為4.95。46效價(jià)測定效價(jià)測定nSOD測定方法：測定方法：n直接法：直接測定反應(yīng)過程中直接法：直接測定反應(yīng)過程中 O2- 的變化。的變化。n間接法：同時(shí)使用間接法：同時(shí)使用氧自由基指示清除劑氧自由基指示清除劑， SOD與指與指示劑清除劑競爭示劑清除劑競爭O2- ，從而抑制指示劑清除劑與從而抑制指示劑清除劑與O2- 的結(jié)合，根據(jù)的結(jié)合，根據(jù)指示劑清除劑與指示劑清除劑與O2- 反應(yīng)速度的變化反應(yīng)速度的變化可可間接測定間接測定SOD的活性。的活性。n間接法包括：間接法包括：黃嘌呤氧化酶細(xì)胞色素黃

31、嘌呤氧化酶細(xì)胞色素C法法和和聯(lián)苯三聯(lián)苯三酚法酚法。47黃嘌呤氧化酶細(xì)胞色素黃嘌呤氧化酶細(xì)胞色素C法法n原理：原理：在有氧條件下，黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤成在有氧條件下，黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤成尿酸，與此同時(shí)產(chǎn)生尿酸，與此同時(shí)產(chǎn)生O2- ，氧化型細(xì)胞色素氧化型細(xì)胞色素C被被O2- 還還原為還原型細(xì)胞色素原為還原型細(xì)胞色素C，后者在后者在550nm有最大吸收，因有最大吸收，因此測定氧化性細(xì)胞色素此測定氧化性細(xì)胞色素C在加入在加入SOD前后的光吸收變前后的光吸收變化可間接計(jì)算酶活性?；砷g接計(jì)算酶活性。48方法方法n 49注意點(diǎn)注意點(diǎn)n在特定條件下，在特定條件下，25 （pH7.8）每分鐘抑制細(xì)每

32、分鐘抑制細(xì)胞色素胞色素C還原速率達(dá)還原速率達(dá)50所需要的酶量為一個(gè)活所需要的酶量為一個(gè)活力單位。力單位。n注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：n重金屬離子易使黃嘌呤氧化酶失活，因此反應(yīng)體重金屬離子易使黃嘌呤氧化酶失活，因此反應(yīng)體系中必須添加系中必須添加EDTA。n反應(yīng)體系中含過氧化氫酶可引起還原型細(xì)胞色素反應(yīng)體系中含過氧化氫酶可引起還原型細(xì)胞色素C發(fā)生過氧化作用，從而干擾檢測的正確。發(fā)生過氧化作用，從而干擾檢測的正確。50聯(lián)苯三酚法聯(lián)苯三酚法n原理：原理：在堿性條件下，聯(lián)苯三酚會發(fā)生自氧化在堿性條件下，聯(lián)苯三酚會發(fā)生自氧化生成紅生成紅 酚，同時(shí)生成酚，同時(shí)生成O2- 。n定義定義:在一定條件下，在一定條件下，

33、每分鐘抑制聯(lián)苯三酚自每分鐘抑制聯(lián)苯三酚自氧化速率達(dá)氧化速率達(dá)50的酶量的酶量為一個(gè)酶活力單位。為一個(gè)酶活力單位。51操作操作n定義定義:在一定條件下，在一定條件下，每分鐘抑制聯(lián)苯三酚自每分鐘抑制聯(lián)苯三酚自氧化速率達(dá)氧化速率達(dá)50的酶量的酶量為一個(gè)酶活力單位。為一個(gè)酶活力單位。52實(shí)例：尿激酶（實(shí)例：尿激酶（urokinase） n本品系從本品系從新鮮人尿中提取新鮮人尿中提取的一種的一種激活纖維蛋激活纖維蛋白溶酶原白溶酶原的酶。的酶。n由高分子量由高分子量54000和低分子量和低分子量33000組成的組成的混合物，混合物，高分子量含量不得少于高分子量含量不得少于90%，每，每1mg蛋白中尿激酶活

34、力不得少于蛋白中尿激酶活力不得少于12萬萬U，蛋蛋白分解藥物。白分解藥物。53尿激酶尿激酶n（一）性狀（一）性狀n本品為白色非結(jié)晶狀粉末本品為白色非結(jié)晶狀粉末n（二）鑒別（二）鑒別n取比活力測定項(xiàng)下的取比活力測定項(xiàng)下的供試品供試品溶液，用巴比妥溶液，用巴比妥-氯化鈉氯化鈉緩沖液（緩沖液（pH7.8）稀釋成每稀釋成每1ml中含中含20U的溶液，的溶液，吸取吸取1ml，加加纖維蛋白原纖維蛋白原溶液溶液0.3ml，再依次加入再依次加入纖維蛋白溶酶原纖維蛋白溶酶原溶液溶液0.2ml，凝血酶凝血酶溶液溶液0.2ml，迅迅速搖勻，立即置速搖勻，立即置370.5恒溫水浴中保溫，記時(shí)，恒溫水浴中保溫，記時(shí)，反

35、應(yīng)系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在應(yīng)在3045s內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在15min內(nèi)內(nèi)重新溶解重新溶解。以。以0.9%氯化鈉溶液作空白，同法操作，氯化鈉溶液作空白，同法操作，凝塊在凝塊在2h內(nèi)不溶。內(nèi)不溶。54（三）檢查（三）檢查 n1溶液的澄清度與顏色，溶液的澄清度與顏色， 應(yīng)澄清無色。應(yīng)澄清無色。n2分子組分比分子組分比 取本品，加水制成每取本品，加水制成每1ml中含中含2mg的溶液后，加入等體積的緩沖液（取濃縮膠緩沖液的溶液后，加入等體積的緩沖液（取濃縮膠緩沖液2.5ml，20%十二烷基磺酸鈉溶液十二烷基磺酸鈉溶液2.5ml，20%十十二烷基磺酸鈉溶液的二烷基磺酸鈉溶液的10ml），），置水浴中

36、置水浴中3min，放放冷，作為供試品溶液；取供試品溶液冷，作為供試品溶液；取供試品溶液10l，加至樣加至樣品孔，照電泳法測定，按下式計(jì)算高分子尿激酶相品孔，照電泳法測定，按下式計(jì)算高分子尿激酶相對含量（對含量（%）。）。55（三）檢查（三）檢查n3干燥失重干燥失重 取本品，以五氧化二磷為干燥劑，在取本品，以五氧化二磷為干燥劑，在60減壓干燥至恒重，減失重量不得過減壓干燥至恒重，減失重量不得過5.0%。 n4異常毒性取本品，加氯化鈉注射液制成每異常毒性取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含中含5000U的溶液，依法檢查的溶液，依法檢查，按靜脈注射法給藥，按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定。應(yīng)符合規(guī)定。n5熱原熱原 取本品，加氯化鈉注射液制成每取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含中含20000U的溶液，依法檢測的溶液，依法檢測，按家兔體重每按家兔體重每1kg注注射射1ml，應(yīng)符合規(guī)定。應(yīng)符合規(guī)定。566. 凝血質(zhì)樣活性物質(zhì)凝血質(zhì)樣活性物質(zhì)n（1）血漿的制備）血漿的制備 。n（2）復(fù)鈣試驗(yàn)）復(fù)鈣試驗(yàn) 取小試管，加取小試管，加血漿血漿0.1ml、6-氨基己酸溶液氨基己酸溶液0.1ml及巴比及巴比妥緩沖液妥緩沖液0.1ml，再加入再加入氯化鈣氯化鈣溶液觀察凝固時(shí)間。以凝固時(shí)間最