食品理化檢驗 霉菌毒素檢驗課件

1、霉菌毒素的檢驗霉菌毒素的檢驗掌握：掌握：o黃曲霉毒素的理化性質(zhì)和薄層色譜法測定黃曲霉毒素的理化性質(zhì)和薄層色譜法測定黃曲霉毒素黃曲霉毒素B1的原理和方法的原理和方法o微柱篩選法測定微柱篩選法測定AFTB1的原理及方法的原理及方法o赭曲霉毒素的理化性質(zhì)和薄層色譜法測定赭曲霉毒素的理化性質(zhì)和薄層色譜法測定的原理及方法的原理及方法熟悉：熟悉：o展青霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇展青霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇、和雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、毒素、玉米赤霉烯酮的測定方法玉米赤霉烯酮的測定方法了解：了解：o霉菌毒素的命名、分類、危害和霉菌毒素的命名、分類、危害和污染來源污染來源v 概述概述v 黃曲霉

2、毒素的檢驗黃曲霉毒素的檢驗v 赭赭zh曲霉毒素曲霉毒素v 展青霉素展青霉素v 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇v T-2毒素毒素v 玉米赤霉烯酮的測定方法玉米赤霉烯酮的測定方法目錄目錄霉菌及霉菌毒素霉菌及霉菌毒素v霉菌霉菌：是絲狀真菌的俗稱，意即：是絲狀真菌的俗稱，意即發(fā)霉的真菌發(fā)霉的真菌，它們往往能形成分枝繁茂的菌絲體，但又不象蘑它們往往能形成分枝繁茂的菌絲體，但又不象蘑菇那樣產(chǎn)生大型的子實體。菇那樣產(chǎn)生大型的子實體。常見毒性大的霉菌毒素常見毒性大的霉菌毒素：黃曲霉毒素：黃曲霉毒素（AFT）、雜色曲霉素、赭曲霉毒素、）、雜色曲霉素、赭曲霉毒素、伏馬菌素、展

3、青霉素、桔青霉素、玉伏馬菌素、展青霉素、桔青霉素、玉米赤霉烯酮米赤霉烯酮霉菌毒素的命名與分類霉菌毒素的命名與分類按照產(chǎn)生毒素的霉菌名稱來命名按照產(chǎn)生毒素的霉菌名稱來命名按毒作用部位分按毒作用部位分肝臟毒素肝臟毒素腎臟毒素腎臟毒素神經(jīng)毒素神經(jīng)毒素類似性激素作用物質(zhì)類似性激素作用物質(zhì)按毒素來源分按毒素來源分曲霉毒素曲霉毒素青霉毒素青霉毒素鐮刀菌毒素鐮刀菌毒素霉菌毒素的分類霉菌毒素的分類按毒作用機理按毒作用機理抑制蛋白質(zhì)合成類抑制蛋白質(zhì)合成類作用于離子通道類作用于離子通道類作用于細(xì)胞骨架類作用于細(xì)胞骨架類作用于細(xì)胞突觸類作用于細(xì)胞突觸類霉菌毒素的分類霉菌毒素的分類按毒素結(jié)構(gòu)分按毒素結(jié)構(gòu)分二呋喃環(huán)二呋

4、喃環(huán)內(nèi)酯環(huán)內(nèi)酯環(huán)醌類醌類霉菌毒素的產(chǎn)生條件霉菌毒素的產(chǎn)生條件v 水分水分v pHv 溫度溫度v 濕度濕度v 氧氣氧氣霉菌毒性與危害霉菌毒性與危害v肝、腎、神經(jīng)、生殖、消化系統(tǒng)的損害肝、腎、神經(jīng)、生殖、消化系統(tǒng)的損害v免疫抑制、細(xì)胞毒性免疫抑制、細(xì)胞毒性v致癌、致畸、致突變，如黃曲霉毒素能誘發(fā)人、致癌、致畸、致突變，如黃曲霉毒素能誘發(fā)人、猴、鼠、禽類發(fā)生肝癌，致癌所需時間最短為猴、鼠、禽類發(fā)生肝癌，致癌所需時間最短為24周。周。 v第二節(jié)第二節(jié) 黃曲霉毒素的檢驗黃曲霉毒素的檢驗黃曲霉毒素黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT) v黃曲霉、寄生霉和溫特霉的代謝產(chǎn)物黃曲霉、寄生霉和溫特霉的代謝產(chǎn)物

5、 v劇毒物，其毒性是氰化鉀的劇毒物，其毒性是氰化鉀的10倍倍，為砒霜的為砒霜的68倍倍，是目前發(fā)現(xiàn)的最強的化學(xué)致癌物質(zhì)之一是目前發(fā)現(xiàn)的最強的化學(xué)致癌物質(zhì)之一v黃曲霉毒素黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強最為多見，其毒性和致癌性也最強v高溫高濕地區(qū)生產(chǎn)的高溫高濕地區(qū)生產(chǎn)的花生、玉米花生、玉米、大米、棉籽等、大米、棉籽等最容易被污染最容易被污染基基本本結(jié)結(jié)構(gòu)：構(gòu)：二二呋呋喃喃環(huán)環(huán)和和香香豆豆素素 產(chǎn)生熒光顏色產(chǎn)生熒光顏色不同，可分為不同，可分為B族（藍色）族（藍色）和和G族（綠色）族（綠色）兩大類及其衍兩大類及其衍生物生物 主要存在于牛奶中主要存在于牛奶中AFTB1及其衍生物及其衍生物A

6、FTG2及其衍生物及其衍生物黃曲霉毒素黃曲霉毒素的理化性質(zhì)的理化性質(zhì)n耐熱，高于耐熱，高于280裂解；耐光，不耐氧化劑裂解；耐光，不耐氧化劑n難溶于水，乙醚、石油醚，難溶于水，乙醚、石油醚，易溶于甲醇和氯仿易溶于甲醇和氯仿n在堿性條件下，其結(jié)構(gòu)中的內(nèi)脂環(huán)可被破壞形成在堿性條件下，其結(jié)構(gòu)中的內(nèi)脂環(huán)可被破壞形成香豆素鈉鹽，該鹽能溶于水，無毒。香豆素鈉鹽，該鹽能溶于水，無毒。n在酸性條件下，能發(fā)生逆反應(yīng)，恢復(fù)其毒性。其在酸性條件下，能發(fā)生逆反應(yīng)，恢復(fù)其毒性。其反應(yīng)式為：反應(yīng)式為： OOOCH3OOONaOHHClOOOCH3OHONa O CO黃曲霉毒素黃曲霉毒素B1黃曲霉毒素的分析方法黃曲霉毒素的

7、分析方法TLC酶聯(lián)免疫吸附法（酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）微柱篩選法微柱篩選法HPLC國標(biāo)法國標(biāo)法薄層色譜法薄層色譜法單向展開法單向展開法 樣品中樣品中AFTB1經(jīng)甲醇經(jīng)甲醇-水溶液提取水溶液提取后，濃縮、定容、點樣于硅膠后，濃縮、定容、點樣于硅膠G薄層板上，經(jīng)展開分離后，在波薄層板上，經(jīng)展開分離后，在波長長365nm紫外光下觀察藍紫色熒紫外光下觀察藍紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的強度與標(biāo)準(zhǔn)比較來確定含量。的強度與標(biāo)準(zhǔn)比較來確定含量。樣品處理樣品處理v樣品樣品加加正己烷（或石油醚）和甲醇正己烷（或石油醚）和甲醇- -水水溶液，震蕩溶液，震蕩分層，取甲醇分層，取

8、甲醇- -水層水層氯仿萃取氯仿萃取無水無水NaNa2 2SOSO4 4過濾過濾濾濾液蒸干液蒸干苯苯- -乙腈溶解乙腈溶解備用備用點樣點樣在距薄層板下端的在距薄層板下端的2cm基線上用微量注射器滴加基線上用微量注射器滴加樣液，標(biāo)液，一塊板滴加樣液，標(biāo)液，一塊板滴加4 個點，點的直徑個點，點的直徑3mm，大小一致，在一條直線上。滴加樣式如下：，大小一致，在一條直線上。滴加樣式如下： 第一點第二點第三點第四點第一點第二點第三點第四點樣液樣液 20 20 20 l淡標(biāo)淡標(biāo) (0.04 g/ml) 10 10 l濃標(biāo)濃標(biāo) (0.2 g/ml) 10 l （最低熒光點）（最低熒光點） （樣點）（樣點） （

9、熒光定位）（熒光定位）預(yù)展及展開預(yù)展及展開 預(yù)展，預(yù)展，12cm無水乙醚無水乙醚展開展開1012cm 丙酮：氯仿丙酮：氯仿 8 ：92觀察及確證觀察及確證365nm若若Rf=0.6附近有藍附近有藍紫色熒光紫色熒光確證確證點樣后，在點樣處滴加三氟乙酸點樣后，在點樣處滴加三氟乙酸Rf=0.1附附近有藍紫近有藍紫色熒光色熒光展開、紫外燈展開、紫外燈下觀察下觀察AFTB1AFTB2a極性增大極性增大確證點樣操作確證點樣操作 第一點第二點第三點第四點第一點第二點第三點第四點樣液樣液l 20 20淡標(biāo)淡標(biāo)（0.04 g/ml） 10 10 三氟乙酸三氟乙酸 1小滴小滴小滴小滴 （反應(yīng)（反應(yīng)5min ，熱風(fēng)

10、吹，熱風(fēng)吹2min ，40） 定量操作方法定量操作方法 第一點第二點第一點第二點 第三點第三點 第四點第四點樣液樣液 10 15 20 l淡標(biāo)淡標(biāo) 10 l0.0004g（0.04 g/ml）定量操作方法定量操作方法如樣點的熒光強度與淡標(biāo)點的熒光強如樣點的熒光強度與淡標(biāo)點的熒光強度度一致一致，則樣品中，則樣品中AFTB1含量為含量為0.0004g如樣點的熒光強度如樣點的熒光強度比最低檢出量強比最低檢出量強，則根據(jù)其強度估計則根據(jù)其強度估計減少滴加微升數(shù)或減少滴加微升數(shù)或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龑右合♂尯笤俚渭硬煌⑸?，直至，直至樣點的熒光強度與最低檢出量的熒光樣點的熒光強度與最低檢出量的熒

11、光強度一致。強度一致。高效液相色譜法測定高效液相色譜法測定AFTB1 樣品中的黃曲霉毒素經(jīng)樣品中的黃曲霉毒素經(jīng)C18柱分離，用帶柱分離，用帶熒光檢測器熒光檢測器的的高效液相色譜儀檢測，以保高效液相色譜儀檢測，以保留時間定性，峰面積或峰高留時間定性，峰面積或峰高定量。定量。樣品提取樣品提取樣品粉碎樣品粉碎加少量水加少量水氯仿提取氯仿提取無水無水Na2SO4脫水脫水過濾過濾提取液，待凈化提取液，待凈化樣品凈化和衍生物反應(yīng)樣品凈化和衍生物反應(yīng)硅鎂型吸附劑硅鎂型吸附劑1.提取液提取液2.氯仿氯仿-正己烷正己烷 氯仿氯仿-甲醇甲醇3.丙酮丙酮-水洗脫水洗脫洗脫液水浴蒸干洗脫液水浴蒸干氯仿溶解氯仿溶解部分

12、加入正己烷、三氟乙酸部分加入正己烷、三氟乙酸靜置靜置30min氮氣吹干氮氣吹干用流動相溶解用流動相溶解進高效液相色譜儀進高效液相色譜儀高效液相測定參考條件高效液相測定參考條件v檢測器：熒光檢測器檢測器：熒光檢測器 激發(fā)波長：激發(fā)波長：360nm 發(fā)射波長：發(fā)射波長：425nmv色譜柱：色譜柱：C18v流動相：甲醇流動相：甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀（磷酸二氫鉀（1+1 ） 或乙腈或乙腈-甲醇甲醇-水（水（50+150+300）v流速：流速：1.3ml/min微柱篩選法微柱篩選法P130 樣液中黃曲霉毒素被微柱管內(nèi)樣液中黃曲霉毒素被微柱管內(nèi)硅鎂型吸附劑層硅鎂型吸附劑層吸附后吸附后,在在36

13、5nm紫外光燈下顯示藍紫色熒光環(huán)紫外光燈下顯示藍紫色熒光環(huán)，其熒光強度與黃曲霉毒素在一定的濃度范圍內(nèi)其熒光強度與黃曲霉毒素在一定的濃度范圍內(nèi)成正比例關(guān)系。由于在微柱上不能分離黃曲霉成正比例關(guān)系。由于在微柱上不能分離黃曲霉毒素毒素B1、B2、G1、G2, 所以測得結(jié)果為總的黃所以測得結(jié)果為總的黃曲霉毒素含量曲霉毒素含量。GB/T 5009.23-2006玻璃微柱管玻璃微柱管：內(nèi)徑內(nèi)徑0.4cm，長，長12cm, 為便于加液可在管的為便于加液可在管的上部接一段粗的管口。上部接一段粗的管口。 微柱層析架微柱層析架：附有接受洗脫廢液的附有接受洗脫廢液的容器，要盡可能密閉。容器，要盡可能密閉。下層甲醇水

14、提取液下層甲醇水提取液花生油花生油振搖振搖石油醚石油醚甲醇甲醇-水水氯仿氯仿下層下層棄去水層，洗去殘留甲醇棄去水層，洗去殘留甲醇過濾過濾備用備用無水硫酸鈉無水硫酸鈉水水黃曲霉毒素的提取黃曲霉毒素的提取甲醇甲醇-水水-石油醚提取法石油醚提取法下層萃取液下層萃取液玉米磨碎玉米磨碎潤濕潤濕氯仿氯仿過濾過濾備用備用無水硫酸鈉無水硫酸鈉黃曲霉毒素的提取黃曲霉毒素的提取三氯甲烷水提取法三氯甲烷水提取法甲醇甲醇-水水微柱管制備微柱管制備脫脂棉（鋪頂層）脫脂棉（鋪頂層）3cm 無水硫酸鈉（無水硫酸鈉（60100目）目）1.5cm酸性氧化鋁酸性氧化鋁12.5cm中性氧化鋁中性氧化鋁0.5cm無水硫酸鈉無水硫酸鈉

15、0.5cm硅鎂型吸附劑硅鎂型吸附劑0.5cm無水硫酸鈉無水硫酸鈉脫脂棉（作底層）脫脂棉（作底層）微柱層析微柱層析1ml液體液體樣樣液液0.0025g/ml標(biāo)標(biāo)液液0.005g/ml標(biāo)標(biāo)液液氯仿氯仿展開劑：丙酮三氯甲烷展開劑：丙酮三氯甲烷 （1:9）結(jié)果觀察與評定結(jié)果觀察與評定 365nm紫外光照射紫外光照射 若樣品柱管內(nèi)硅鎂型吸附劑層若樣品柱管內(nèi)硅鎂型吸附劑層只現(xiàn)只現(xiàn)微黃色熒光環(huán)，則樣品中黃曲霉毒微黃色熒光環(huán)，則樣品中黃曲霉毒素含量為未檢出素含量為未檢出(在在5或或10gkg以以下下)；若出現(xiàn)若出現(xiàn)藍紫色熒光環(huán)藍紫色熒光環(huán)，則需進一步，則需進一步通過薄層色譜測定法進行測定。通過薄層色譜測定法進

16、行測定。n確證時，不需重新提取樣品確證時，不需重新提取樣品n其操作如下其操作如下 ： 準(zhǔn)確吸取原三氯甲烷提取液于小蒸發(fā)皿準(zhǔn)確吸取原三氯甲烷提取液于小蒸發(fā)皿內(nèi)揮干，內(nèi)揮干， 以少量以少量苯乙腈混合液苯乙腈混合液(982)分?jǐn)?shù)次轉(zhuǎn)入刻度小管中，分?jǐn)?shù)次轉(zhuǎn)入刻度小管中， 定容至定容至1.0mL，密塞，混勻，按薄層層析法確證，密塞，混勻，按薄層層析法確證， 并測并測定黃曲霉毒素定黃曲霉毒素B1 、B2 、G1、G2 的含量。的含量。需要說明之處需要說明之處v層析用的氧化鋁、硅鎂型吸附劑及無水硫酸層析用的氧化鋁、硅鎂型吸附劑及無水硫酸鈉使用前應(yīng)在鈉使用前應(yīng)在120活化活化2 h， 裝瓶蓋嚴(yán)于干裝瓶蓋嚴(yán)于干

17、燥器內(nèi)，可保存燥器內(nèi)，可保存1周左右，周左右， 超過超過1周需再次活周需再次活化化v層析結(jié)束后，最好在層析結(jié)束后，最好在2h內(nèi)觀察內(nèi)觀察v接受洗脫液的容器要密封接受洗脫液的容器要密封v第三節(jié)第三節(jié) 赭曲霉毒素赭曲霉毒素A的檢驗的檢驗赭曲霉毒素的理化性質(zhì)赭曲霉毒素的理化性質(zhì)v由曲霉菌，如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以由曲霉菌，如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以及綠青霉等產(chǎn)生的一類毒素。及綠青霉等產(chǎn)生的一類毒素。 v赭曲霉毒素赭曲霉毒素A（OTA）毒性最大，在霉變谷物、毒性最大，在霉變谷物、飼料等最常見。飼料等最常見。vOTA微溶于水、石油醚微溶于水、石油醚，加堿成鹽，水溶解性加堿成鹽，水溶解性增大增大

18、v酸性時，溶于苯、氯仿。酸性時，溶于苯、氯仿。v對紫外線不穩(wěn)定，幾天即分解（應(yīng)避光）對紫外線不穩(wěn)定，幾天即分解（應(yīng)避光）v用用三氯甲烷三氯甲烷-0.1mol/L磷酸磷酸或或石油醚石油醚-甲醇甲醇/水水提取樣品中的赭曲霉毒素提取樣品中的赭曲霉毒素A，樣品提取液經(jīng)液樣品提取液經(jīng)液-液分配后，根據(jù)其液分配后，根據(jù)其在在365 nm紫外光燈下產(chǎn)生黃綠色熒紫外光燈下產(chǎn)生黃綠色熒光，在薄層色譜板上與標(biāo)準(zhǔn)比較測定光，在薄層色譜板上與標(biāo)準(zhǔn)比較測定含量。含量。v采用雙相展開法采用雙相展開法薄層色譜法薄層色譜法GB/T 5009.96-2003氯仿層氯仿層樣品粉碎樣品粉碎過濾過濾氯仿氯仿磷酸磷酸NaHCO3水層水

19、層氯仿層氯仿層蒸干蒸干備用備用苯苯-乙腈乙腈鹽酸鹽酸氯仿氯仿提?。追ǎ┨崛。追ǎ┘状技状?水層水層樣品粉碎樣品粉碎過濾過濾石油醚石油醚甲醇甲醇-水水氯仿層氯仿層震蕩震蕩氯仿層氯仿層備用備用苯苯-乙腈乙腈NaCl飽和飽和溶液溶液提?。ㄒ曳ǎ┨崛。ㄒ曳ǎ┞确侣确曼c樣、縱展點樣、縱展展開劑：展開劑：無水乙醚無水乙醚乙醚乙醚-甲醇甲醇-水水縱展縱展23cm 樣品樣品+標(biāo)液標(biāo)液橫展橫展展開展開1012cm樣品樣品+標(biāo)液標(biāo)液 樣液與標(biāo)品樣液與標(biāo)品展開劑：展開劑：無水乙醚無水乙醚乙醚乙醚-甲醇甲醇-水水縱展縱展展開劑：展開劑：甲苯甲苯-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲酸甲酸-水水甲苯甲苯-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲酸甲酸

20、苯苯-冰乙酸冰乙酸 縱展縱展1315cm 樣品樣品+標(biāo)液標(biāo)液觀察及確證觀察及確證365nm與標(biāo)準(zhǔn)點的與標(biāo)準(zhǔn)點的相應(yīng)處有黃相應(yīng)處有黃綠色熒光綠色熒光確證確證用碳酸氫鈉乙醇溶用碳酸氫鈉乙醇溶液噴灑色譜板，室液噴灑色譜板，室溫下干燥溫下干燥紫外燈紫外燈OTA熒光點熒光點應(yīng)由黃綠色應(yīng)由黃綠色變?yōu)樗{色變?yōu)樗{色 稀釋定量稀釋定量比較樣液中比較樣液中OA與標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)OA點的熒光強度，估計點的熒光強度，估計稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)。薄層板經(jīng)雙向展開后，當(dāng)樣品中薄層板經(jīng)雙向展開后，當(dāng)樣品中OA含量高時，含量高時，OA的熒光點會被橫向拉長的熒光點會被橫向拉長，使點變扁，使點變扁，或分成或分成兩個黃綠色熒光點兩個黃綠色熒

21、光點。在橫展過程中，在橫展過程中，原點上原點上OA的量超過了硅的量超過了硅膠的吸附能力，膠的吸附能力，原點上的雜質(zhì)和殘留溶原點上的雜質(zhì)和殘留溶劑在橫展中將劑在橫展中將OA點橫向拉長了。點橫向拉長了。稀釋定量稀釋定量v這時可根據(jù)這時可根據(jù)OA黃綠色熒光的總強度與標(biāo)準(zhǔn)熒黃綠色熒光的總強度與標(biāo)準(zhǔn)熒光強度比較，光強度比較，估計需減少的滴加微升數(shù)或所需估計需減少的滴加微升數(shù)或所需稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)。v經(jīng)稀釋后測定含量時，可在樣液點的左邊基線經(jīng)稀釋后測定含量時，可在樣液點的左邊基線上上滴加二個標(biāo)準(zhǔn)點，滴加二個標(biāo)準(zhǔn)點，OA的量可為的量可為4ng、8ng，比較樣液與兩個標(biāo)準(zhǔn)比較樣液與兩個標(biāo)準(zhǔn)OA熒光點的熒光強度

22、，熒光點的熒光強度，概略定量概略定量方法說明方法說明v本標(biāo)準(zhǔn)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了谷物和大豆規(guī)定了谷物和大豆中中OTA的薄層色譜測的薄層色譜測定方法。定方法。v本標(biāo)準(zhǔn)本標(biāo)準(zhǔn)適用于小麥、玉米和大豆適用于小麥、玉米和大豆中中OTA的測定。的測定。v薄層板上薄層板上OTA的最低檢出量為的最低檢出量為4ng。v本方法的最低檢測量為本方法的最低檢測量為10g/kg。v標(biāo)準(zhǔn)使用液冰箱黑紙避光標(biāo)準(zhǔn)使用液冰箱黑紙避光v第四節(jié)第四節(jié) 展青霉素的檢驗展青霉素的檢驗一、一、 展青霉素的理化性質(zhì)展青霉素的理化性質(zhì)v無色結(jié)晶，熔點無色結(jié)晶，熔點110，在，在70-10070-100可升華；可升華；v溶于水和乙醇；溶于水和乙醇；v

23、在堿性條件下不穩(wěn)定，在酸性溶液中較穩(wěn)定，耐在堿性條件下不穩(wěn)定，在酸性溶液中較穩(wěn)定，耐熱。熱。二、食品中的來源二、食品中的來源v主要存在于腐爛水果及其制品中主要存在于腐爛水果及其制品中v展青霉素由蕁麻青霉、擴張青霉和棒曲霉等霉菌展青霉素由蕁麻青霉、擴張青霉和棒曲霉等霉菌代謝產(chǎn)生的。代謝產(chǎn)生的。三、三、 毒性與危害毒性與危害四、衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)四、衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)五、分析方法五、分析方法v展青霉素的測定方法有氣相色譜法、高效液相色展青霉素的測定方法有氣相色譜法、高效液相色譜法和薄層色譜法。我國的標(biāo)準(zhǔn)分析方法為雙向譜法和薄層色譜法。我國的標(biāo)準(zhǔn)分析方法為雙向薄層掃描定量測定法。薄層掃描定量測定法。雙相薄層掃描測定法雙

24、相薄層掃描測定法 用乙酸乙酯提取果汁，利用用乙酸乙酯提取果汁，利用1.5%碳碳酸鈉凈化樣品，經(jīng)雙向薄層分離后，酸鈉凈化樣品，經(jīng)雙向薄層分離后，利用薄層掃描儀進行紫外反射光掃利用薄層掃描儀進行紫外反射光掃描定量。描定量。本方法適合于本方法適合于蘋果、山楂制品及其半成品中蘋果、山楂制品及其半成品中展青霉素的測定展青霉素的測定GB/T 5009.185-2003薄層掃描儀薄層掃描儀展青霉素的提取展青霉素的提取果汁：果汁：v加加乙酸乙酯乙酸乙酯，振搖，振搖2min，靜置分層。重復(fù)以上，靜置分層。重復(fù)以上步驟兩次，合并有機相。步驟兩次，合并有機相。v有機相有機相加碳酸鈉加碳酸鈉，振搖，振搖1min，靜置

25、分層后，棄，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，再用碳酸鈉重復(fù)處理一次。去碳酸鈉層，再用碳酸鈉重復(fù)處理一次。v提取液濾真空減壓濃縮近干，用少許提取液濾真空減壓濃縮近干，用少許三氯甲烷三氯甲烷清洗瓶壁，濃縮干，加三氯甲烷定溶，供薄層清洗瓶壁，濃縮干，加三氯甲烷定溶，供薄層色譜分析用。色譜分析用。展青霉素的提取展青霉素的提取鮮蘋果、果醬：鮮蘋果、果醬：v蘋果洗凈、削皮、打碎蘋果洗凈、削皮、打碎v置研缽中，加置研缽中，加無水硫酸鈉無水硫酸鈉研磨后轉(zhuǎn)至錐形瓶研磨后轉(zhuǎn)至錐形瓶v加加乙酸乙酯乙酸乙酯浸泡、振蕩，過濾浸泡、振蕩，過濾v濾液濾液減壓濃縮近干，用少許減壓濃縮近干，用少許三氯甲烷三氯甲烷清洗瓶壁，清洗瓶壁，

26、濃縮干，三氯甲烷定溶，供薄層色譜分析用。濃縮干，三氯甲烷定溶，供薄層色譜分析用。薄層分析薄層分析 點樣點樣 v 標(biāo)液與樣液相差標(biāo)液與樣液相差3cmv 在樣品點用一垂直線上，距頂在樣品點用一垂直線上，距頂端端2cm處點處點20ng的標(biāo)準(zhǔn)液，為的標(biāo)準(zhǔn)液，為位置參考點。位置參考點。固定相：硅膠固定相：硅膠GF254 薄層分析薄層分析 雙向展開雙向展開v先橫向，排除雜質(zhì)的干擾，再縱向先橫向，排除雜質(zhì)的干擾，再縱向v在在波長波長254nm紫外燈下觀察，紫外燈下觀察，v展青霉素展青霉素Rf值約為值約為0.35，若樣品點出現(xiàn)黑點，若樣品點出現(xiàn)黑點，則樣品為陽性。則樣品為陽性。v根據(jù)樣液黑色吸收點的強度高低，

27、根據(jù)樣液黑色吸收點的強度高低，稀釋不同倍稀釋不同倍數(shù)后，再點樣數(shù)后，再點樣10L，使每個樣品點展青霉素的，使每個樣品點展青霉素的絕對量在絕對量在10100ng之間之間，經(jīng)雙向展開后，進行，經(jīng)雙向展開后，進行掃描定量掃描定量測定。測定。確證確證陽性樣品的驗證：陽性樣品的驗證：v將陽性樣品的薄層色譜板將陽性樣品的薄層色譜板噴以噴以MBTH顯色劑顯色劑，130烘烤烘烤15min，冷卻至室，冷卻至室溫后，于波長溫后，于波長360nm紫外燈下觀察，紫外燈下觀察，展青霉素應(yīng)呈展青霉素應(yīng)呈橙黃色點橙黃色點。 定量定量v測定波長測定波長270nm；參考波長；參考波長310nm；反射光測定；反射光測定；掃描速度

28、掃描速度40nn/min；記錄儀紙速；記錄儀紙速20nn/min；根據(jù)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及樣品中展青霉素標(biāo)準(zhǔn)及樣品中展青霉素峰面積峰面積，按下式計算樣品，按下式計算樣品中展青霉素含量。中展青霉素含量。X果汁中展青霉素含量，果汁中展青霉素含量，g/mL；Y鮮蘋果中展青霉素含，鮮蘋果中展青霉素含，g/g；c展青霉素標(biāo)準(zhǔn)液濃度，展青霉素標(biāo)準(zhǔn)液濃度，g/mL；A樣液展青霉素峰面積；樣液展青霉素峰面積；YS展青霉素標(biāo)準(zhǔn)峰面積；展青霉素標(biāo)準(zhǔn)峰面積；V加三氯甲烷定容體積，加三氯甲烷定容體積，mL；D樣液點稀釋倍數(shù)；樣液點稀釋倍數(shù)；m樣品質(zhì)量，樣品質(zhì)量，g；V1液體樣品的體積，液體樣品的體積，mL。 第五節(jié)第五節(jié)脫氧

29、雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的檢驗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）三羥基三羥基-12,13環(huán)氧單端孢霉環(huán)氧單端孢霉-9烯烯-8酮酮可溶于水、含水甲醇、含水乙醇、乙酸乙酯等可溶于水、含水甲醇、含水乙醇、乙酸乙酯等紫外光下無熒光紫外光下無熒光雪腐鐮刀菌烯醇（雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）四羥基四羥基-12,13環(huán)氧單端孢霉環(huán)氧單端孢霉-9烯烯-8酮酮易溶于水、甲醇、乙醇等易溶于水、甲醇、乙醇等極性比極性比DON大大也稱嘔吐毒素也稱嘔吐毒素v分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)v毒性與危害毒性與危害v衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)v主要來源：

30、主要來源：DON及及NIV主要是雪腐鐮刀菌污染小主要是雪腐鐮刀菌污染小麥、玉米、豆餅等糧食和飼料產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。麥、玉米、豆餅等糧食和飼料產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。v分析方法：我國規(guī)定分析方法：我國規(guī)定DON的標(biāo)準(zhǔn)分析方法是薄層的標(biāo)準(zhǔn)分析方法是薄層色譜法（第一法）和免疫測定法（第二法）。其色譜法（第一法）和免疫測定法（第二法）。其他常用的方法有他常用的方法有GC,HPLC及微柱法。及微柱法。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-薄層色譜法測定薄層色譜法測定v脫氧雪腐鐮刀菌烯醇經(jīng)提取、凈化、濃縮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇經(jīng)提取、凈化、濃縮和硅硅膠膠G薄層展開后，加熱薄層板。由于在制備薄薄層展開后，加熱薄層板。由

31、于在制備薄層板時加入了層板時加入了三氯化鋁三氯化鋁，使脫氧雪腐鐮刀菌烯，使脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在醇在365nm紫外光燈下顯藍色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比紫外光燈下顯藍色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較。較。 本標(biāo)準(zhǔn)適合于本標(biāo)準(zhǔn)適合于谷物及其制品谷物及其制品GB/T 5009.111-2003提取提取粉碎樣品粉碎樣品加水、三氯甲烷加水、三氯甲烷-無水乙醇無水乙醇振蕩振蕩1h過濾過濾濾液蒸干濾液蒸干液液分配液液分配 凈化凈化石油醚溶解殘渣石油醚溶解殘渣再用甲醇再用甲醇-水分次洗滌蒸發(fā)皿水分次洗滌蒸發(fā)皿 甲醇甲醇-水層水層過中性氧化鋁、活性炭柱過中性氧化鋁、活性炭柱甲醇甲醇-水淋洗柱子水淋洗柱子沸水浴濃縮至干沸水浴濃縮至干乙酸乙

32、酯溶解，濃縮，備用乙酸乙酯溶解，濃縮，備用點樣、展開、測定點樣、展開、測定v先點樣液橫展：使先點樣液橫展：使DON偏離原點（雜質(zhì)）偏離原點（雜質(zhì)） 展開劑：乙醚展開劑：乙醚-丙酮或無水乙醚丙酮或無水乙醚 對于小麥制品，還須再用對于小麥制品，還須再用10mL石油醚橫展一次石油醚橫展一次。v加點標(biāo)準(zhǔn)液后縱展開加點標(biāo)準(zhǔn)液后縱展開 展開劑：展開劑： 三氯甲烷三氯甲烷-丙酮丙酮-異丙醇異丙醇(8:1:1) 三氯甲烷三氯甲烷-丙酮丙酮-異丙醇異丙醇-水水(7.5:1:1.5:0.1)薄層上端與樣品點相對應(yīng)的位置點一個薄層上端與樣品點相對應(yīng)的位置點一個DON標(biāo)準(zhǔn)點，作為定位參考標(biāo)準(zhǔn)點，作為定位參考觀察觀察3

33、65nmv雜質(zhì)有熒光雜質(zhì)有熒光 vDON無熒光無熒光而后薄層板在而后薄層板在130加熱，冷卻后加熱，冷卻后v如如DON處無熒光處無熒光 ，則為陰性，則為陰性v雜質(zhì)、雜質(zhì)、DON均有熒光均有熒光 ，但是剛好分開，但是剛好分開，為陽性為陽性定量定量陽性樣品與不同量的標(biāo)準(zhǔn)點一陽性樣品與不同量的標(biāo)準(zhǔn)點一起進行薄層色譜分析，比較樣起進行薄層色譜分析，比較樣品與各標(biāo)準(zhǔn)點品與各標(biāo)準(zhǔn)點DON點熒光強點熒光強度，進行概略定量。度，進行概略定量。薄層色譜法（薄層色譜法（DON，NIV）v小麥中的小麥中的DON，NIV經(jīng)提取、經(jīng)提取、凈化、濃縮和凈化、濃縮和硅膠硅膠G薄層展開后，薄層展開后，加熱薄層板。由于在制備薄層板加熱薄層板。由于在制備薄層板時加入了時加入了三氯化鋁三氯化鋁，使，使DON，NIV在在365nm紫外光燈下顯藍色紫外光燈下顯藍色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較。熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較。 樣品提取、凈化樣品提取、凈化粉碎粉碎甲醇甲醇-水提取水提取二次二次過濾過濾加石油醚加石油醚取甲醇水取甲醇水層層濃縮濃縮加水稀釋加水稀釋待凈化待凈化XAD-4色譜柱凈化色譜柱凈化甲醇洗脫甲醇洗脫測定測定v同前同前v只是展開劑不同只是展